婁夢奇,王曉帆,李明蔚,聶麗萍,廖美德

(華南農業(yè)大學植物保護學院,廣東廣州 510642)

水稻紋枯病、稻瘟病和白葉枯病并稱為世界稻作三大病害,其中紋枯病從水稻苗期到生長后期均可感染,導致水稻無法正常抽穗或秕谷數(shù)量增多[1-2]。水稻病害的主要防控措施包括重大病害的預測預報、抗性品種的選育和種植、農業(yè)防治、物理防治、化學防治、生物防治等[3]。但由于水稻抗性種質資源、病害預測預報及農業(yè)防控措施的局限性,在病害大流行年份,化學防治一直是控制各種水稻病害的主要手段,然而化學藥劑的過量、盲目施用,不僅增加農業(yè)生產成本,影響水稻的品質和生態(tài)環(huán)境安全,還會導致病原菌產生抗藥性,引起病害再猖獗,嚴重制約了我國水稻產業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展[4]。

PS04菌株是由筆者所在實驗室分離保存的菌株[5],屬于膠凍樣類芽孢桿菌,是一種可以分解土壤中磷、鉀礦物質的一類細菌,具有分解土壤中硅酸鹽、鋁酸鹽及云母等礦物質,釋放其中的磷、鉀等多種微量元素供作物吸收利用,從而達到提高作物產量的目的[6]。PS04胞外多糖能誘導植物防御性酶活性,其誘導效果與BTH相當,是一種良好的誘抗劑[7]。為了探明PS04對水稻紋枯病的防治效果及PS04發(fā)酵液在水稻栽培中的應用效果進行了相關試驗,旨在為微生物源農藥在控制植物病害的應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株。PS04菌株由筆者所在實驗室從華南農業(yè)大學殺蟲植物標本園分離純化得到,水稻紋枯病菌和水稻稻瘟病菌由華南農業(yè)大學綠色農藥全國重點實驗室保存。

1.1.2PS04發(fā)酵液的制備。把放置于-70 ℃冰箱中斜面保存的PS04菌株采用劃線法于查氏平板上進行活化,放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h后,待菌落長出后用打孔器打出1～2個菌餅,放于含有100 mL查氏液體培養(yǎng)基(不加瓊脂)的250 mL三角瓶中,35 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)84 h,即為PS04發(fā)酵液[8-9]。

1.1.3培養(yǎng)基。查氏培養(yǎng)基:蔗糖30 g,硝酸鈉1.5 g,磷酸氫二鉀1 g,硫酸鎂0.5 g,氯化鉀0.5 g,瓊脂16～20 g,水1 000 mL,121 ℃高溫滅菌30 min。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂16～20 g,水1 000 mL,121 ℃高溫滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1PS04對病原菌的平皿抑制試驗。用移液槍吸取PS04發(fā)酵液500、1 000、2 000 μL分別注入3個含有100 mL無菌水的250 mL三角瓶中,使3個三角瓶中PS04的濃度為0.5%、1.0%、2.0%。從每個瓶中吸取1 mL的PS04發(fā)酵液分別注入PDA平板上,與培養(yǎng)基混勻。以不做處理的PDA培養(yǎng)基作為對照,共4個處理,每個處理3次重復。將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)好的水稻紋枯病菌采用打孔法(直徑7 mm)打孔,將帶有病原菌菌絲的菌餅接種到不同濃度的平板中央,菌絲生長面與平板接觸,放于培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)溫度為28 ℃,3 d后觀察培養(yǎng)皿的菌絲生長情況并測量計算抑制率[10]。

1.2.2PS04對水稻紋枯病的離體防效。采集長勢一致、無病斑的新鮮葉片,清洗干凈放于鋪有無菌濾紙片的玻璃培養(yǎng)皿中,每皿5片葉子,用無菌水潤濕濾紙片以達到保濕效果。用移液槍吸取PS04發(fā)酵液2、10 mL分別注入2個含有100 mL無菌水的250 mL三角瓶中,吸取100 mL發(fā)酵液原液注入250 mL三角瓶中,使3個三角瓶中PS04的濃度為2%、10%、100%。用移液槍吸取每個濃度的發(fā)酵液1 mL均勻涂抹葉片,以不處理的葉片作為對照。共4個處理,每處理3次重復。涂抹葉片后將培養(yǎng)皿中生長旺盛的水稻紋枯病菌用打孔器打孔(直徑7 mm)進行接種,將菌餅放置于處理后的每片葉子上,菌絲生長面與葉片接觸,將處理后的葉片放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),注意保濕,4 d后觀察葉片的發(fā)病情況[11]。

1.2.3PS04發(fā)酵液大田防效試驗。大田防效試驗設在國內部分省份的水稻種植區(qū)發(fā)病稻區(qū)進行,設2個處理:①PS04稀釋200倍;②清水對照。共調查3次,噴藥1次,采用背負式打藥噴霧法。按照《農藥田間藥效試驗準則 (一) 》GB/T17980.19—2000的技術操作規(guī)程規(guī)定,試驗田于施藥前1 d對各小區(qū)采用對角線5點取樣法共查20叢,調查總株數(shù)、病株數(shù)和病級數(shù)、病情指數(shù)。根據(jù)現(xiàn)場試驗效果確定是否進行多次施藥及調查,并計算病情指數(shù)與防效[12]。

水稻紋枯病病情分級標準:0級,全株無病;1級,第4葉片及其以下各葉鞘、葉子發(fā)病;3級,第3葉片及其以下各葉鞘、葉子發(fā)病;5級,第2葉片及其以下各葉鞘、葉子發(fā)病;7級,劍葉葉片及其以下各葉鞘、葉子發(fā)病;9級,全株發(fā)病,提早枯死。

病情指數(shù)=[∑(各級病株數(shù)×相對級數(shù)值)÷(調查總株數(shù)×最高級值)]×100

防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%

1.2.4PS04發(fā)酵液田間測產試驗。測產試驗在廣東省江門張村水稻種植區(qū)進行,不處理的稻田為對照組,噴施稀釋200倍的PS04發(fā)酵液為處理組。在水稻收割前對各大區(qū)進行測產,采用對角線5點取樣法,每1 m2調查不少于30穗,記錄每穗粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、結實率、千粒重,計算理論產量[13]。

2 結果與分析

2.1 PS04發(fā)酵液對水稻紋枯病菌的抑菌活性隨著PS04發(fā)酵液濃度的增加,對水稻紋枯病菌生長的抑制越明顯,在PS04發(fā)酵液濃度為0.5%時對水稻紋枯病菌的抑菌率為56.10%,濃度為1.0%時抑菌率為64.93%,濃度為2.0%時抑菌率為84.16%(圖1、2)。

注:A.CK,B.0.5%PS04發(fā)酵液,C.1.0%PS04發(fā)酵液, D.2.0%PS04發(fā)酵液。Note:A.CK,B.0.5% concentration PS04 fermentation broth,C.1.0% PS04 fermentation broth,D.2.0% PS04 fermentation broth.

圖2 不同濃度PS04發(fā)酵液對水稻紋枯病菌的抑菌率Fig.2 Inhibition rate of different concentrations of PS04 fermentation broth

2.2 PS04發(fā)酵液對水稻紋枯病離體防效用離體水稻葉片測定PS04發(fā)酵液對水稻紋枯病的防治效果見表1。由表1可知,對照組的水稻葉片在接種病菌4 d后,導致100%發(fā)病,病斑直徑平均為9.27 cm。經不同濃度PS04發(fā)酵液處理的水稻葉片在接種紋枯病菌4 d后,表現(xiàn)出顯著的保護性防效,其中當PS04在100%時防效為71.63%,在10%時防效為46.04%,在2%時防效為19.72%。與對照組相比有顯著的防效。

表1 PS04發(fā)酵液對水稻紋枯病的防治效果

2.3 PS04發(fā)酵液大田防效試驗在江門張村水稻種植區(qū)進行了大田防效試驗,結果見表2。由表2可知,在江門張村地區(qū)施用PS04制劑之后,第一次藥后的病情指數(shù)為6.27,對照區(qū)的病情指數(shù)為35.50。第二次藥后病情指數(shù)為3.72,對照區(qū)的病情指數(shù)為25.70。可見藥后病情指數(shù)顯著低于對照,且二次施藥后顯著降低水稻紋枯病的發(fā)生。

表2 PS04發(fā)酵液在江門張村水稻種植區(qū)對紋枯病的防效

2.4 PS04發(fā)酵液大田測產試驗在江門張村水稻種植區(qū)進行了大田應用試驗,結果見表3。從表3可以看出,噴施PS04發(fā)酵液后的水稻千粒重顯著高于對照組,千粒重增加了1.45 g。與對照組相比,每穗粒數(shù)無顯著差異。PS04發(fā)酵液處理組水稻的結實率與對照組無顯著差異,PS04發(fā)酵液處理組的有效穗數(shù)顯著高于對照組。處理組的產量較對照組增加了13.43%。由此可以看出,PS04發(fā)酵液增加了水稻產量。

表3 江門張村水稻種植區(qū)產量及其構成因素

3 結論與討論

PS04菌株是筆者所在課題組自華南農業(yè)大學植物園分離得到的一株類芽孢桿菌,經鑒定為膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacilluskribbensis),又名克立本類芽孢桿菌。芽孢桿菌具有抗逆性強、抗菌譜廣及生長代謝速度快等優(yōu)點,被廣泛應用于植物病害的防治研究中[14-15]。本實驗室是前期對PS04菌株進行了分離鑒定及其抗菌代謝產物的研究之后用PS04發(fā)酵液對水稻紋枯病進行室內抑菌試驗并進行了田間防效和測產試驗。

在平板抑制試驗中發(fā)現(xiàn)PS04菌株具有良好的抑菌活性,且隨著濃度的增加而表現(xiàn)顯著,當PS04發(fā)酵液濃度為2%時對水稻紋枯病的防效為84.16%,在對水稻紋枯病的離體防效試驗中發(fā)現(xiàn)PS04發(fā)酵液原液對水稻紋枯病的防治效果最好,能夠降低葉片發(fā)病率。在大田對水稻紋枯病病害防治及測產試驗中,發(fā)現(xiàn)施用PS04制劑后能夠顯著抑制病害發(fā)生率并提高單位面積簇數(shù)、結實率、千粒重等產量形成相關因素。另外在大田試驗中發(fā)現(xiàn),在水直播田、機插田施用PS04發(fā)酵液后,秧苗素質均有不同程度提升,表現(xiàn)為莖稈粗壯,葉色較濃。苗高比對照田塊高1～3 cm(常規(guī)稻尤為明顯),增加水稻葉片長度、提高根長和白根數(shù),后期抗衰性狀表現(xiàn)明顯,能顯著降低病害發(fā)生率。因此,可為今后微生物源農藥防治水稻紋枯病病害提供一定理論基礎與技術支撐。