施文靜，張文考，陳麗芝，祁擁華，葉春宇，姜 偉，李楠楠，范瑞良，全為民

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)遙感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；3.三門縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江三門 317100；4.三門縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江三門 317100）

牡蠣是重要的海岸帶“生態(tài)系統(tǒng)工程師（ecosystem engineer）”之一，通過牡蠣聚集生長而形成的牡蠣礁曾經(jīng)廣布于全球河口、海灣和濱海［1－3］，發(fā)揮著凈化水體［4］、營造生境［2－3，5－6］、防護(hù)岸線［1－2］、固碳［7］等生態(tài)功能。但由于過度捕撈、環(huán)境污染、生境破壞和病害等原因，過去100年來，全球約85%的牡蠣礁已經(jīng)消失，野生牡蠣資源量已經(jīng)下降了65%［1－2］。

20世紀(jì)90年代之前，我國南北沿海的許多河口和海灣都分布有自然牡蠣礁，但隨著人類活動的增加，絕大多數(shù)牡蠣礁已經(jīng)退化或消失［8－9］。2000年以后，我國逐漸開始關(guān)注牡蠣礁的生態(tài)功能［2］，并對天津大神堂［10］、江蘇小廟洪［3－4］、河北曹妃甸［9］等地區(qū)現(xiàn)存的活體牡蠣礁的生態(tài)現(xiàn)狀進(jìn)行了調(diào)查研究，結(jié)果顯示，大部分牡蠣礁礁體已經(jīng)嚴(yán)重退化或消失。目前，我國對牡蠣礁的生態(tài)學(xué)調(diào)查研究還相對不足［9］，無法準(zhǔn)確掌握我國自然牡蠣礁的地理分布和生態(tài)現(xiàn)狀，這也制約了我國海岸帶生境的保護(hù)與修復(fù)。

健跳港是浙江中部三門灣內(nèi)的一條狹長而彎曲的內(nèi)港，是典型的海灣型淤泥質(zhì)潮汐汊道，全長約17 km，總面積16.7 km2［11］。健跳港上游灣區(qū)底部的水質(zhì)較好、初級生產(chǎn)力較高，潮間帶遍布自然礫石，為牡蠣的附著與生長提供了適宜環(huán)境，形成以近江牡蠣（Crassostreaariakensis）和熊本牡蠣（C.sikamea）為優(yōu)勢種的自然牡蠣礁［12］，當(dāng)?shù)胤Q之為蠣江灘。但近年來，由于流域開發(fā)和過度捕撈等原因，導(dǎo)致蠣江灘自然牡蠣礁面積減少、牡蠣資源量下降和種質(zhì)退化［12］。為保護(hù)該水域牡蠣種質(zhì)資源及其形成的自然牡蠣礁生境，本研究系統(tǒng)調(diào)查了蠣江灘中牡蠣的種類、資源量和幼體補(bǔ)充量，并分析了牡蠣的遺傳多樣性及資源量和幼體補(bǔ)充量的時(shí)空變化特征，以期為蠣江灘牡蠣礁的保護(hù)和修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)

本文研究地點(diǎn)位于浙江省三門縣健跳港上游灣區(qū)的蠣江灘（121°32′17″～121°32′40″E、29°00′55″～29°01′25″N）（圖1）。健跳港內(nèi)潮汐為非正規(guī)半日潮，春季平均潮差為4.11 m，夏季平均潮差達(dá)4.36 m［11］。海水溫度5.2～30.1℃，鹽度3.5～15.1。蠣江灘牡蠣礁位于潮間帶低潮區(qū)，礁區(qū)上邊界和下邊界高程相差約2 m，由牡蠣聚集附著于自然礫石發(fā)育而成，成斑塊狀分布，礁區(qū)面積約0.33 km2。

圖1 健跳港蠣江灘牡蠣礁位置示意圖Fig.1 Location of Lijiangtan oyster reef in Jiantiao Bay

1.2 牡蠣資源調(diào)查

分別于2021年夏初（6月8日）和秋季（10月8日）開展蠣江灘牡蠣礁的生態(tài)現(xiàn)狀調(diào)查，兩季調(diào)查區(qū)域和站位基本一致。將牡蠣礁區(qū)按高程劃分為低礁區(qū)、中礁區(qū)、高礁區(qū)，夏初和秋季分別在每個(gè)礁區(qū)隨機(jī)布設(shè)9個(gè)和6個(gè)0.4 m×0.4 m的樣方，同一礁區(qū)不同樣方的間距大于20 m，采集每個(gè)樣方內(nèi)的所有活體牡蠣作為1個(gè)樣品，裝入封口袋。另在礁體上定性采集牡蠣樣品。

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定牡蠣種類，根據(jù)外殼形態(tài)可以鑒定大部分牡蠣個(gè)體，對于部分外殼形態(tài)特征較模糊的牡蠣樣本，采用線粒體16S rDNA基因序列分析確定其種類［12－14］，并據(jù)此分析牡蠣的遺傳多樣性。另從夏初調(diào)查獲取的牡蠣樣品中，每種牡蠣選取30個(gè)，使用COI通用引物L(fēng)CO1490：5′-GGTCAACAAATCATA AAGATATTGG-3′和HCO2198：5′-TAAACTTCAGGG TGACCAAAAAATCA-3′，對選取的牡蠣進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送上海生工生物工程有限公司測序。通過ClustalX（Version 1.83）軟件進(jìn)行多序列比對和分析，采用MEGA 11軟件確定各序列的堿基組成、多態(tài)位點(diǎn)及個(gè)體間遺傳距離等。采用DNASP 5.0軟件計(jì)算基于16S rDNA和COI基因片段的4種牡蠣的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（S）、變異位點(diǎn)數(shù)（V）、單倍型數(shù)（H）、單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（K）等遺傳多樣性參數(shù)［13］。

在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)計(jì)數(shù)每個(gè)樣品中活體牡蠣的數(shù)量，牡蠣的密度統(tǒng)計(jì)為單位面積內(nèi)每種牡蠣的數(shù)量（個(gè)·m－2）。另從每個(gè)樣品中隨機(jī)抽取30個(gè)牡蠣，用數(shù)字游標(biāo)卡尺測量其殼高（SH），精確至1 mm，個(gè)體數(shù)量不足30個(gè)時(shí)則全部測量。牡蠣密度數(shù)據(jù)經(jīng)lg（x＋1）轉(zhuǎn)換后，采用兩因素方差分析（two-way ANOVA）方法對牡蠣密度的季節(jié)（夏初、秋季）變化和空間（高礁區(qū)、中礁區(qū)和低礁區(qū)）變化進(jìn)行分析（Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05）。所有數(shù)據(jù)分析均采用Sigmaplot12.5軟件實(shí)現(xiàn)。

1.3 牡蠣補(bǔ)充量監(jiān)測

用3根長3.5 m、直徑10 cm的不銹鋼管垂直插入海底（插入深度約1 m），組裝成邊長0.5 m的等邊三角形實(shí)驗(yàn)用附苗架。2021年6月在低礁區(qū)設(shè)置5個(gè)附苗架，附苗架平行于水邊線布置，盡量使5個(gè)附苗架處于相同高程。附苗器為15 cm（長）×15 cm（寬）×1 cm（厚）的瓷磚片。在每個(gè)附苗架中，分別在離海底0.6 m和1.6 m處水平安裝1個(gè)聚乙烯網(wǎng)片（網(wǎng)目尺寸1 cm），每個(gè)網(wǎng)片上放置1個(gè)附苗器，附苗器粗糙面朝上。牡蠣補(bǔ)充量于2021年6月8日開始監(jiān)測，2021年10月8日結(jié)束監(jiān)測，約15 d設(shè)為1個(gè)監(jiān)測時(shí)段，6月8日放置第1個(gè)附苗器，然后分別于6月26日、7月10日、7月27日、8月9日、8月21日、9月6日、9月21日將附苗器取下放入封口袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，并換上新的附苗器，10月8日取回最后一個(gè)附苗器。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用解剖鏡檢驗(yàn)和計(jì)數(shù)每個(gè)附苗器粗糙面附著的牡蠣稚貝數(shù)量，并換算為牡蠣補(bǔ)充量（個(gè)·cm－2）。每次從每個(gè)實(shí)驗(yàn)潮區(qū)牡蠣稚貝樣品中隨機(jī)取30個(gè)，采用上述分子生物學(xué)方法鑒定其種類。牡蠣補(bǔ)充量數(shù)據(jù)經(jīng)lg（x＋1）轉(zhuǎn)換后采用兩因素方差分析（two-way ANOVA）方法分析牡蠣補(bǔ)充量的時(shí)間變化和空間變化（Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣種類和遺傳多樣性

牡蠣樣品的16S rDNA基因測序結(jié)果表明，蠣江灘牡蠣礁中分布有6種牡蠣，分別是近江牡蠣、熊本牡蠣、福建牡蠣（C.angulata）、香港牡蠣（C. hongkongensis）、貓爪牡蠣（Talonostrea talonata）和長牡蠣（C.gigas）。

前4種常見牡蠣的16S rDNA和COI基因片段的堿基組成結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)出A＋T明顯高于C＋G、C的比例最低的特點(diǎn)（表1）。2種基因片段不同之處在于堿基A和T占比不同，在16S rDNA基因片段中，A與T的占比相差不大，而在COI基因片段中，T的占比明顯高于A的占比（表1）。4種牡蠣的遺傳多樣性見表2。

表1 4種牡蠣16S rDNA和COI基因片段堿基組成Tab.1 Base com position of 16S rDNA and COI gene fragments of 4 oyster species（%）

表2 基于16S rDNA和COI基因片段的4種牡蠣遺傳多樣性Tab.2 Genetic diversity of 4 oyster species based on 16S rDNA and COI gene fragments

2.2 牡蠣資源量及其時(shí)空變化

定量生態(tài)調(diào)查僅采集到3種牡蠣（表3）。在數(shù)量上，熊本牡蠣占絕對優(yōu)勢，香港牡蠣和近江牡蠣的占比均較低（表3）。由高礁區(qū)至低礁區(qū)，熊本牡蠣的占比和出現(xiàn)頻率總體上逐步下降，而近江牡蠣和香港牡蠣的占比和出現(xiàn)頻率總體上逐步上升（表3）。

表3 蠣江灘定量調(diào)查中3種牡蠣的數(shù)量、占比和出現(xiàn)頻率Tab.3 Number，percentage and frequency of 3 oyster species in quantitative sam pling at Lijiangtan oyster reef

蠣江灘中3種牡蠣的密度均呈現(xiàn)顯著的季節(jié)變化（熊本牡蠣：F＝90.817，P＜0.001；近江牡蠣：F＝13.622，P＜0.001；香港牡蠣：F＝26.474，P＜0.001）和空間變化（熊本牡蠣：F＝4.378，P＝0.019；近江牡蠣：F＝16.956，P＜0.001；香港牡蠣：F＝19.333，P＜0.001）。

熊本牡蠣的密度夏初高礁區(qū)顯著高于低礁區(qū)，秋季3個(gè)礁區(qū)間無顯著差異；在同一礁區(qū)，秋季熊本牡蠣密度均顯著高于夏初（圖2-A）。近江牡蠣密度在中礁區(qū)和低礁區(qū)均為秋季顯著高于夏初（圖2-B）。香港牡蠣密度夏初低礁區(qū)顯著高于高礁區(qū)，秋季3個(gè)礁區(qū)的高低排序?yàn)椋焊呓竻^(qū)＜中礁區(qū)＜低礁區(qū)；在中礁區(qū)和低礁區(qū)，香港牡蠣密度秋季顯著高于夏初（圖2-C）。

圖2 夏初和秋季蠣江灘熊本牡蠣（A）、近江牡蠣（B）、香港牡蠣（C）和總體（D）密度的時(shí)空變化Fig.2 Spatial-temporal changes in densities of Crassostrea sikamea（A），C.ariakensis（B），C.hongkongensis（C）and total（D）oysters at Lijiangtan oyster reef in early summer and autumn

夏初蠣江灘牡蠣平均總密度為（97±40）個(gè)·m－2，秋季牡蠣平均總密度為（1 770±467）個(gè)·m－2。牡蠣總密度具有顯著的季節(jié)變化（F＝69.566，P＜0.001），但空間變化不顯著（F＝0.508，P＝0.606），礁區(qū)和季節(jié)之間沒有互作效應(yīng)（F＝0.660，P＝0.522）。在同一礁區(qū)，牡蠣總密度秋季均顯著高于夏初（圖2-D）。

圖3顯示了夏初和秋季蠣江灘牡蠣礁牡蠣（整體）殼高-頻率分布。夏初牡蠣殼高范圍為6～87 mm，平均為35 mm，稚貝（殼高＜20 mm）比例為19.42%；秋季牡蠣殼高范圍為2～77 mm，平均為21 mm，稚貝（殼高＜20 mm）的比例為51.95%。

圖3 夏初（A）和秋季（B）蠣江灘牡蠣的殼高-頻率分布Fig.3 Distribution of shell height-frequency of oysters at Lijiangtan oyster reef in early summer and autumn

2.3 牡蠣幼體補(bǔ)充量

幼體補(bǔ)充量分析中，運(yùn)用分子生物學(xué)方法共鑒定8批次644個(gè)牡蠣樣品（表4）。其中，熊本牡蠣590個(gè)、占比91.61%，近江牡蠣42個(gè)、占比6.52%，福建牡蠣、香港牡蠣和貓爪牡蠣數(shù)量占比分別為0.78%、0.47%和0.62%。近江牡蠣、香港牡蠣、福建牡蠣和貓爪牡蠣更多附著于0.6 m潮區(qū)，而熊本牡蠣在1.6 m潮區(qū)附著量略高于0.6 m潮區(qū)（表4）。除了第1個(gè)監(jiān)測時(shí)段0.6 m潮區(qū)的補(bǔ)充群體中近江牡蠣占比高于熊本牡蠣，其余各時(shí)段和潮區(qū)熊本牡蠣均占絕對優(yōu)勢。

表4 蠣江灘牡蠣補(bǔ)充群體的種類組成Tab.4 Species com position of oyster recruitment communities at Lijiangtan oyster reef

圖4顯示了蠣江灘牡蠣礁牡蠣補(bǔ)充量的時(shí)空變化情況。0.6 m潮區(qū)牡蠣補(bǔ)充量峰值出現(xiàn)于8月9日附苗器采樣和9月21日附苗器采樣時(shí)段；1.6 m潮區(qū)牡蠣補(bǔ)充量變化趨勢與0.6 m潮區(qū)基本相似，但第1個(gè)補(bǔ)充高峰出現(xiàn)時(shí)間比0.6 m潮區(qū)約早半個(gè)月。牡蠣補(bǔ)充量具有顯著的時(shí)間變化（F＝52.651，P＜0.001）和空間變化（F＝12.448，P＜0.001），兩因子之間有互作效應(yīng)（F＝3.254，P＝0.005）。除初始2個(gè)監(jiān)測時(shí)段和最后1個(gè)監(jiān)測時(shí)段外，牡蠣補(bǔ)充量在2個(gè)潮區(qū)間均具有顯著性差異（圖4）。

圖4 蠣江灘牡蠣補(bǔ)充量的時(shí)空變化Fig.4 Spatial-tem poral changes in oyster recruits at Lijiangtan oyster reef

3 討論

3.1 蠣江灘牡蠣種類及遺傳多樣性

中國沿海牡蠣種類繁多，由于牡蠣表型變化大，很難運(yùn)用形態(tài)學(xué)方法準(zhǔn)確鑒定牡蠣種類［15－16］。本研究采用分子生物學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)2021年蠣江灘中分布有6種牡蠣，相比2020年調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)的4種牡蠣［12，17］，又增加了貓爪牡蠣和長牡蠣。與其他鄰近海域相比［4，18－20］，蠣江灘具有較高的牡蠣物種多樣性，應(yīng)該是浙江沿海牡蠣物種分布的“熱點(diǎn)”區(qū)域之一，具有較高的保護(hù)價(jià)值。貓爪牡蠣零星分布于我國渤海、黃海、東海和南海沿岸，是潮間帶偶見種［21］。長牡蠣自然分布于我國江蘇連云港以北沿海，本研究為首次報(bào)道長牡蠣自然分布于浙江沿海，同時(shí)期，作者也在江蘇海門蠣岈山檢測到長牡蠣群體，以上結(jié)果顯示，該種有向黃海南部和東海北部擴(kuò)散的趨勢，其原因有待進(jìn)一步研究。與江蘇海門、上海蘆潮港、浙江象山港牡蠣群體的16S rDNA遺傳多樣性對比［5］，蠣江灘中熊本牡蠣的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均是最低的，近江牡蠣的單倍型多樣性指數(shù)也低于鄰近的3個(gè)自然群體［4］，表明蠣江灘熊本牡蠣和近江牡蠣遺傳多樣性均較低，這可能是因?yàn)樵撃迪牻肝挥诮√凵嫌螢硡^(qū)，狹長的海灣限制了灣內(nèi)牡蠣群體與外部群體的基因交流。

3.2 蠣江灘牡蠣資源量和補(bǔ)充潛力

本研究顯示，蠣江灘熊本牡蠣、近江牡蠣和香港牡蠣的密度均呈現(xiàn)顯著的季節(jié)變化和空間變化，秋季牡蠣密度顯著高于夏初，表明該牡蠣礁在夏季發(fā)生了顯著的資源補(bǔ)充。但3種牡蠣補(bǔ)充的空間格局不同，熊本牡蠣在3個(gè)礁區(qū)中均有顯著補(bǔ)充，而近江牡蠣和香港牡蠣僅在中、低礁區(qū)有顯著補(bǔ)充，表明這3種牡蠣在自然分布上呈現(xiàn)明顯的空間生態(tài)位分區(qū)（zonation）格局，這種分區(qū)格局與健跳港上游灣區(qū)基巖海岸［12］、長江口［7］、江蘇海門［22］和上海蘆潮港［23］的研究結(jié)果一致。例如，陳麗芝等［12］調(diào)查了相同研究地點(diǎn)的基巖潮間帶中這3種牡蠣的自然分布，發(fā)現(xiàn)近江牡蠣和香港牡蠣的空間生態(tài)位一致，僅分布于最底層的潮區(qū)，且隨著高程降低這2種牡蠣的密度逐步升高；熊本牡蠣最高密度出現(xiàn)于中潮區(qū)，且隨著高程降低其密度逐步降低。WANG等［23］研究表明，熊本牡蠣比近江牡蠣具有更強(qiáng)的耐干露能力和更輕的軟組織干重，且兩種牡蠣浮游幼體的分布水層存在明顯差異。本研究綜合分析認(rèn)為，附著潮區(qū)差異和附著后的物理?xiàng)l件（空氣暴露、溫度、失水等）與生物條件（競爭和捕食）差異可能是造成3種牡蠣的分布呈現(xiàn)潮間帶分區(qū)格局的原因。

牡蠣密度是表征牡蠣礁生態(tài)現(xiàn)狀的常用指標(biāo)之一［24］。夏初和秋季蠣江灘牡蠣礁中牡蠣平均總密度分別為（97±40）個(gè)·m－2和（1 770±467）個(gè)·m－2，夏初牡蠣密度較低的原因可能是2020年冬季的持續(xù)過度采捕；秋季牡蠣的密度較高表明夏季發(fā)生了顯著的資源補(bǔ)充，該牡蠣密度高于許多自然或人工修復(fù)牡蠣礁中的牡蠣密度［7，20，24－26］。

闡明牡蠣幼體附著與補(bǔ)充的時(shí)空格局對于制定有效的牡蠣礁修復(fù)策略至關(guān)重要［27］。與2020年監(jiān)測結(jié)果相比［17］，2021年蠣江灘牡蠣礁牡蠣補(bǔ)充期相對較短（6月初至10月初左右），繁殖期間牡蠣補(bǔ)充量變化趨勢由2020年正態(tài)“單峰”曲線變化轉(zhuǎn)變?yōu)?021年“雙峰”曲線變化，表明牡蠣補(bǔ)充格局的年際變化較大。從2個(gè)實(shí)驗(yàn)潮區(qū)的監(jiān)測結(jié)果來看，總體上0.6 m潮區(qū)補(bǔ)充量高于1.6 m潮區(qū)，即中間潮區(qū)更適宜于牡蠣幼體的附著和補(bǔ)充，主要原因可能是0.6 m潮區(qū)既可避免底層環(huán)境高懸沙沉積的影響，也可有效降低空氣暴露對牡蠣附著、生長與存活的物理脅迫［27］。本研究表明，蠣江灘牡蠣礁分布著一個(gè)有較高物種多樣性的牡蠣群落，應(yīng)加強(qiáng)保護(hù)和管理。下一步需研究泥沙淤積和香港牡蠣入侵對蠣江灘生境和牡蠣種質(zhì)資源的影響。