胡松,劉莉,3,李璐璐,胡磊,鄒沖沖,黃傳奇,劉慷潔,孫安妮

(1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院,武漢 430065;2.武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院藥學部,武漢 430022;3.長江航運總醫(yī)院、武漢腦科醫(yī)院藥學部,武漢 430019;4.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院藥劑科,武漢 430077)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)作為目前世界范圍內最常見的慢性肝病,嚴重危害著全球約25%成年人的健康[1-2]。NAFLD主要包括普通脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)兩類,前者以肝細胞的脂肪堆積為特征,而后者可進展為肝硬化甚至肝癌[3-5]。醫(yī)學界至今尚未明確NAFLD的具體發(fā)病原因,但脂質代謝異常、氧化應激、炎癥的影響等被認為是可能的高致病因素,且臨床上至今缺乏治療NAFLD的有效藥物[6-9]。

蔥白提取物(Alliumcepavar.aggregatumextract,ACAE)是本課題組對火蔥Alliumcepavar.aggregatum的蔥白進行二氧化碳超臨界萃取的產物,由該萃取物制成的醫(yī)療機構制劑博心通軟膠囊(鄂藥制字Z20093124,每粒400 mg,β-谷甾醇含量不低于1.3 mg)已在臨床使用多年[10]。雖然長期的臨床研究和動物實驗[11]均表明ACAE可調節(jié)脂質代謝,并可顯著改善其動脈粥樣硬化、心肌梗死等臨床癥狀[12],但是ACAE發(fā)揮以上功效的分子機制尚未被完全揭示。因此,本研究擬建立油酸誘導的人肝癌細胞(HepG2)高脂模型,觀測ACAE對肝脂質代謝關鍵蛋白(PPARα、SREBP-1C和PNPLA3)、氧化應激調節(jié)因子影響,并分析該作用的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗藥品及試劑 ACAE由武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑中心提供(批號:20201207),實驗前以二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配制成一定濃度的儲存液并冷凍于-20 ℃?zhèn)溆?實驗中各組DMSO濃度均<0.1%);油酸(批號:110-80-1)購于Sigma公司;達爾伯克必需基本培養(yǎng)液(Dulbecco's minimum essential medium,DMEM)(批號:12800017)、胎牛血清(批號:10099134)、磷酸鹽緩沖液(批號:8157363)和噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(批號:146500709)均購自Gibco公司;格里斯試劑(批號:193521001)購于Promega公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(批號:21023315)購于冬歌生物科技有限公司;三酰甘油(triacylglycerol,TG)(批號:1765425)、ELISA試劑盒購于eBioscience公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒(批號:PA115)、總RNA提取試劑(批號:DP502)購自天根生化科技有限公司;逆轉錄試劑盒(批號:RR037)、實時熒光定量試劑盒(批號:RR820A)均購自TAKARA公司;單核苷酸引物由生工生物工程股份有限公司合成;PNPLA3(ab2304)、SREBP-1C(ab3201)、PPARα(ab5076)、Nrf2(ab6244)、CYP1A1(ab5132)、gp 78(ab0846)一抗均購自Abcam公司。

1.2細胞與細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞HepG2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心,以DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗在5%二氧化碳、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數期用于后續(xù)實驗。

1.3細胞活性測定 以適量甲醇溶解油酸(oleic acid,OA),并以適量超純化水將其溶解配制成0.5 mmol·L-1溶液備用。接種于96孔板的細胞(每孔1×104個)以0.5 mmol·L-1OA在37 ℃下預處理24 h,再以梯度濃度(0～80 mg·L-1)ACAE在37 ℃下孵育24 h,隨后加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL和pH 值7.4的磷酸鹽緩沖液180 μL孵育4 h后棄去上清液,加DMSO溶液150 μL溶解結晶,于酶標儀中低速震蕩10 min后在波長490 nm下讀板。

1.4細胞給藥 以HepG2細胞每孔5×103個的密度在6孔板中接種并孵育24 h。之后正常對照組細胞加培養(yǎng)基孵育24 h,模型對照組和各ACAE組在0.5 mmol·L-1OA溶液中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液,正常對照組和模型對照組加培養(yǎng)基,各ACAE組加梯度濃度的ACAE(2、5、10、20 mg·L-1)孵育24 h。每組設置復孔3個,所有實驗平行重復3次。

1.5細胞ROS測定 細胞給藥后,每孔加入10 μmol·L-1二氯熒光素二乙酸酯孵育后,在波長485 和535 nm下測定各組熒光強度。搜集各組細胞裂解后以BCA蛋白試劑盒測定各組細胞蛋白質濃度,并計算單位蛋白質濃度下的相對熒光強度來評估各組細胞的相對ROS含量。

1.6TG的測定 細胞給藥后,搜集各組細胞并裂解。根據TG和BCA試劑盒說明測定各組TG水平和各組蛋白含量,計算得到各組TG相對含量。

1.7實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 細胞給藥后,搜集各組細胞并以Trizol試劑裂解并提取總RNA,測定提取總RNA的A260/A280以確保純度。3 μg總RNA以逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA,再以實時熒光定量試劑擴增。擴增方案為兩步法:第一步95 ℃保持5 min預變性,第二步95 ℃保持3 s,70 ℃保持33 s,重復38個循環(huán)PCR反應。PNPLA3、PPARα引物和內參寡核苷酸序列見表1,以2-△△CT計算各組細胞相對mRNA含量。

表1 PNPLA3、PPARα引物和內參寡核苷酸序列

1.8免疫印跡分析 細胞給藥后,搜集各組細胞于冰上裂解30 min,12 000×g下冷凍離心10 min,并以BCA蛋白試劑盒測定各組蛋白濃度?？偟鞍捉浭榛蛩徕c-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后轉膜至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后與相應的一抗(PNPLA3、SREBP-1c、PPARα、gp78、Nrf2、CYP1A1)孵育1 h。洗膜3次后以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗孵育1 h,洗膜3次后在ECL發(fā)光液中孵育2 min,以感光膠片壓片成像后,以Bio-rad 170-8170凝膠成像系統(tǒng)測定各組灰度值。

1.9統(tǒng)計學方法 所有計量資料以SPSS 20.0版軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊時結合LSD檢驗比較組間統(tǒng)計學差異,方差不齊時采用Dunnett T3 檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1蔥白提取物對HepG2的細胞毒性 由MTT實驗結果(圖1)可知,與正常對照組比較,2、5、10、20 mg·L-1的ACAE對HepG2細胞無細胞毒性(P>0.05),40、80 mg·L-1ACAE對HepG2細胞有細胞毒性(P<0.05)。因此,后續(xù)實驗中,給藥組以2、5、10、20 mg·L-1ACAE進行實驗。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.0.5 mmol·L-1OA+2 mg·L-1ACAE組;D.0.5 mmol·L-1OA+5 mg·L-1ACAE組;E.0.5 mmol·L-1OA+10 mg·L-1ACAE組;F.0.5 mmol·L-1OA+20 mg·L-1ACAE組;G.0.5 mmol·L-1OA+40 mg·L-1ACAE組;H.0.5 mmol·L-1OA+80 mg·L-1ACAE組。①與正常對照組比較,t=3.39,P<0.05;②與模型對照組比較,t=3.52、14.81,P<0.05。

2.2蔥白提取物對HepG2細胞TG生成的影響 由實驗結果(圖2)可知,與正常對照組比較,OA可顯著提高HepG2細胞的TG生成量(F=216.46,P< 0.05,方差齊);與模型對照組比較,所有實驗濃度的ACAE均可顯著降低HepG2細胞的TG生成量(P<0.05)。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.0.5 mmol·L-1OA+2 mg·L-1ACAE組;D.0.5 mmol·L-1OA+5 mg·L-1ACAE組;E.0.5 mmol·L-1OA+10 mg·L-1ACAE組;F.0.5 mmol·L-1OA+20 mg·L-1ACAE組。①與正常對照組比較,P<0.05;② 與模型對照組比較,P<0.05。

2.3蔥白提取物對HepG2細胞ROS生成的影響 由實驗結果(圖3)可知,相對于正常對照組,OA可顯著提高HepG2細胞ROS的生成量(F=112.00,P<0.05;方差齊);與模型對照組比較,2 mg·L-1的ACAE對ROS生成量無影響(P>0.05),5、10、20 mg·L-1的ACAE可顯著提升ROS的生成量(P<0.05)。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.0.5 mmol·L-1OA+2 mg·L-1ACAE組;D.0.5 mmol·L-1OA+5 mg·L-1ACAE組;E.0.5 mmol·L-1OA+10 mg·L-1ACAE組;F.0.5 mmol·L-1OA+20 mg·L-1ACAE組。①與正常對照組比較,P<0.05;② 與模型對照組比較,P<0.05。

2.4蔥白提取物對HepG2細胞NO生成的影響 由實驗結果(圖4)可知,與正常對照組比較,OA可顯著提高HepG2細胞的NO生成量(F=216.46,P<0.05,方差齊);與模型對照組比較,所有實驗濃度的ACAE均可顯著降低HepG2細胞的NO生成量(P<0.05)。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.0.5 mmol·L-1OA+2 mg·L-1ACAE組;D.0.5 mmol·L-1OA+5 mg·L-1ACAE組;E.0.5 mmol·L-1OA+10 mg·L-1ACAE組;F.0.5 mmol·L-1OA+20 mg·L-1ACAE組。①與正常對照組比較,P<0.05;② 與模型對照組比較,P<0.05。

2.5蔥白提取物對HepG2細胞PNPLA3和PPARα mRNA相對含量的影響 由實驗結果(圖5)可知,與正常對照組比較,OA可顯著提高HepG2細胞PNPLA3mRNA的相對含量(F=42.54,P<0.05,方差齊);與模型對照組比較,5～20 mg·L-1ACAE可顯著降低HepG2細胞的PNPLA3 mRNA的相對含量(P<0.05)。另一方面,與正常對照組比較,OA可顯著降低HepG2細胞PPARα mRNA的相對含量(F=9.59,P<0.01,方差不齊);與模型對照組比較,所有實驗濃度的ACAE均可顯著提升HepG2細胞PPARα mRNA的相對含量(P<0.05)。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.0.5 mmol·L-1OA+2 mg·L-1ACAE組;D.0.5 mmol·L-1OA+5 mg·L-1ACAE組;E.0.5 mmol·L-1OA+10 mg·L-1ACAE組;F.0.5 mmol·L-1OA+20 mg·L-1ACAE組。①與正常對照組比較,P<0.05;②與模型對照組比較,P<0.05;③與正常對照組比較,P<0.01。

2.6ACAE對HepG2細胞脂代謝、氧化應激相關蛋白的影響 結果見表2和圖6。與正常對照組比較,模型對照組的Nrf2和PPARα的相對含量顯著降低(P<0.05),而SREBP-1c、CYP1A1、PNPLA3和gp78的相對含量顯著升高(P<0.05)。與模型對照組比較,2～20 mg·L-1的ACAE和5～20 mg·L-1的ACAE分別使Nrf2和PPARα相對含量顯著提升(P<0.05),5～20 mg·L-1的ACAE組SREBP-1c相對含量顯著高于模型對照組(P<0.05),2～20 mg·L-1的ACAE組CYP1A1、PNPLA3和gp78的相對含量顯著高于模型對照組(P<0.05)。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.0.5 mmol·L-1OA+2 mg·L-1ACAE組;D.0.5 mmol·L-1OA+5 mg·L-1ACAE組;E.0.5 mmol·L-1OA+10 mg·L-1ACAE組;F.0.5 mmol·L-1OA+20 mg·L-1ACAE組。

表2 6組HepG2細胞脂代謝、氧化應激相關蛋白比較

3 討論

NAFLD的發(fā)生和發(fā)展主要經歷2個階段:其一是肝臟脂質的累積,是形成NASH和胰島素抵抗的重要原因;其二是以氧化應激和炎癥為特征的肝損傷。在當今全球經濟迅速發(fā)展的大環(huán)境下,NAFLD的發(fā)病率在全球范圍內都保持著上升趨勢。因此,尋找能夠安全、有效控制NAFLD的藥物具有重要的社會意義和潛在的經濟價值。

ACAE是我院經典醫(yī)療機構制劑博心通軟膠囊的主要原料,前期臨床研究中發(fā)現博心通軟膠囊能顯著降低患者血清TG水平,減輕患者動脈粥樣硬化等臨床癥狀。為了探究ACAE治療NAFLD的機制,本研究以OA誘導HepG2細胞這一經典NAFLD細胞模型為基礎,觀察了ACAE對TG、ROS、NO生成量以及PNPLA3、PPARα等關鍵靶蛋白相對含量的影響。

TG是NAFLD肝臟中的主要脂質成分,同時TG的肝內堆積也是NAFLD的特征性病理表現。與此同時,TG的肝內堆積不僅僅起到損傷肝細胞的作用,同時也是機體對抗脂毒性及過量生成ROS的一種保護機制。ACAE可促進肝細胞啟動自身針對ROS過量的自我保護機制,體外實驗表明,大多數具有治療特性的膳食化合物在高濃度的情況下,都可以作為有效的促氧化劑分子[13]。這種促氧化作用增加了ROS的產生。此外,NO既是NAFLD中衡量氮化應激程度的指標,也是判斷肝細胞發(fā)生氧化應激損傷程度的指標。ACAE可有效抑制油酸對HepG2細胞的氧化應激和氮化應激損傷。

PNPLA3是馬鈴薯糖蛋白磷脂酶家族成員之一,它參與多項肝臟脂肪酸代謝活動,同時是NAFLD致病的關鍵蛋白之一[14-16],臨床數據證實PNPLA3對纖維化、肝脂肪積累和炎癥的發(fā)展有積極的直接影響[17],PNPLA3 rs738409突變可能通過2種方式促進疾病進展:通過直接激活纖維化途徑或通過炎癥[18]。

PNPLA3基因rs738409的多態(tài)性是糖尿病NAFLD患者肝纖維化和心血管疾病風險的標志[19]。PNPLA3基因突變與NAFLD有顯著的相關性,提示可能發(fā)展NAFLD治療的新的酶學位點藥物。ACAE對PNPLA3的生成具有從mRNA到蛋白表達的全面抑制作用。此外,PNPLA3還直接調控SREBP-1c,而SREBP-1c參與調控多種肝內脂肪合成關鍵酶的生成[20-22]。ACAE可通過抑制PNPLA3和SREBP-1c的生成來控制肝內脂肪堆積。PPARα是細胞核上參與調控脂質氧化的關鍵受體[23-24],前期動物實驗中也驗證了ACAE通過誘導PPARGC1A治療NAFLD的可行性,結合ACAE對ROS的上調作用,本研究提示ACAE可能通過提高肝細胞脂肪氧化來抑制肝內脂肪堆積。

Nrf2蛋白調控著肝內解毒、抗氧化等多項功能,一般認為細胞中Nrf2蛋白越豐富,其抗氧化能力越強[25-26]。然而,Nrf2在氧化應激反應中的雙重對立作用應該被嚴格考慮,在一個復雜的層次調控網絡中,在刺激其協同介導的抗氧化細胞保護反應之前,還可以在不同的細胞系中觸發(fā)一定的ROS產量[27]。同時ACAE對于ROS的上調作用,說明ACAE可增強肝細胞的抗氧化能力,并對氧化應激反應起到協調作用。CYP1A1是多種異源物的單加氧酶,它參與多種有毒物質的代謝[28-29]。ACAE可顯著抑制油酸對HepG2細胞的毒性作用。gp78作為一種泛素連接酶,參與人體多種脂肪酸和類固醇等脂質的合成[30-32]。ACAE也可能通過抑制gp78的生成來發(fā)揮其降低脂質生成的臨床作用。

綜上所述,ACAE一方面通過下調PNPLA3、SREBP-1c、gp78、CYP1A1等靶點抑制脂質的生成堆積并降低氧化應激的損傷,另一方面通過上調PPARα和Nrf2加速脂質氧化來加速脂質代謝。雖然本研究在細胞層面對ACAE調節(jié)脂質代謝的機制進行了較全面地解釋,但ACAE中發(fā)揮調節(jié)脂質代謝的活性成分(群)尚不明確,ACAE調節(jié)脂質代謝的其他靶標蛋白、目的細胞尚不明確。本課題組將繼續(xù)開展深入研究。