王光寧,史夢娜,黃月,陸旻彤,楊超燕,陳艷芬

(廣東藥科大學中藥學院,廣州 510006)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是臨床常見的功能性腸胃病,由胃和十二指腸功能紊亂引起的非器質性病變,癥狀以上腹部不適、飽脹感、脹氣等為主,可能與胃腸運動障礙、內(nèi)臟高敏以及精神心理因素等有關。根據(jù)FD的癥狀和臨床表現(xiàn),可將其劃歸中醫(yī)學“痞滿”“胃脘痛”等范疇,常用中藥有枳殼、柴胡、陳皮等[1-4]。陳皮為蕓香科植物橘及栽培變種的干燥成熟果皮經(jīng)陳化而得,具有理氣健脾、燥濕化痰的功效,可用于治療脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥。廣陳皮為橘的栽培變種茶枝柑的果皮,因主產(chǎn)于廣東新會也稱為新會陳皮,2006年被評為國家地理標志產(chǎn)品。廣陳皮含有黃酮、生物堿、揮發(fā)油等成分,可作用于消化、心血管及呼吸等系統(tǒng),具有調節(jié)胃腸動力、助消化、祛痰、調節(jié)血脂及抗氧化等藥理作用[5-9]。廣陳皮臨床主治脾胃氣滯濕阻、脘腹脹痛、不思飲食等癥,可用于治療消化不良[3,10]。陳皮自古強調“陳久者良”,陳化有利于藥效的發(fā)揮,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)陳化對主要成分黃酮和揮發(fā)油均產(chǎn)生影響。目前廣陳皮采用自然存貯法進行陳化,具有耗時長、損耗率高等不足。本項目組采用人工加熱法對廣陳皮進行模擬陳化,可簡便快速地制備陳化樣品,前期已對模擬陳化方法進行初步考察。本實驗采用多因素應激干預法制造FD大鼠模型,探討不同陳化時間和方法的廣陳皮對FD模型大鼠胃腸動力的影響,并初步探討促進胃腸動力作用機制,為廣陳皮的陳化研究和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體級雄性SD大鼠42只,體質量160～180 g,鼠齡45～50 d,購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(粵)2018-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃,相對濕度50%～60%。

1.2藥物與試劑 廣陳皮購于新寶堂陳皮有限公司,經(jīng)廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定,為茶枝柑Citrusreticulata‘Chachi’的干燥成熟果皮。多潘立酮購于西安楊森制藥有限公司(批號:181028405)。大鼠5-羥色胺(5-HT)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒和大鼠胃動素ELISA試劑盒均購于江蘇酶免實業(yè)有限公司(批號分別為MM-0442R1、MM-0491R1)。5-HT4R抗體購于Affinity(批號:33j3022)。RIPA裂解液(批號:G2002)、磷酸化蛋白酶抑制劑(批號:G2007)及二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量檢測試劑盒(批號:G2026)均購自Servicebio公司。

1.3儀器與設備 多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司,型號:EPOCH2),病理切片機(上海徠卡儀器有限公司,型號:RM2235),灰度分析軟件(Alpha Innotech,alphaEaseFC)。

1.4實驗方法

1.4.1藥液的制備 廣陳皮溶液:分別取干燥的新皮和十年皮,純化水回流提取2次,每次30 min,過濾,合并濾液,減壓濃縮至0.5 g·mL-1。模擬陳化樣品用新皮提取濃縮液于烘箱80 ℃加熱96 h。以上樣品制備好后4 ℃冷藏備用,臨用前加純化水稀釋至0.21 g·mL-1。多潘立酮溶液:取多潘立酮(每片10 mg)60 mg,研磨至粉狀,溶于0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose sodium,CMC-Na)溶液中,制成濃度為0.6 mg·mL-1混懸液。碳糊:稱取CMC-Na 1.2 g溶于純化水120 mL中,依次加入奶粉4.8 g,白砂糖2.4 g,淀粉2.4 g,最后滴入炭素墨水使成黑色半固體糊狀物,稱定質量,備用。

1.4.2FD大鼠的制備 SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后開始造模,按照體質量隨機分為正常對照組(7只)和模型組(35只)。正常對照組大鼠正常喂養(yǎng),自由飲水。模型組根據(jù)文獻采用郭氏夾尾法、不規(guī)則喂養(yǎng)和0 ℃、0.9%氯化鈉溶液灌胃等多因素應激干預法制造肝郁脾虛FD大鼠模型[11]。具體操作如下:①每只大鼠灌胃0 ℃、0.9%氯化鈉溶液2 mL,每天2次。②用長海綿鉗夾住大鼠尾尖1/3處,力度以不破皮并能引發(fā)打斗為度。每籠每次刺激30 min,激怒大鼠使整籠動物處于憤怒狀態(tài)。每天2次,中間間隔6 h。如有抓傷可用聚維酮碘溶液涂抹受傷部位。③不規(guī)則喂養(yǎng),即每只大鼠單日給食30 g,雙日禁食,每天飲水自由。3種方法聯(lián)合造模,共持續(xù)21 d。造模過程中觀察大鼠的體質量、精神狀態(tài)、毛發(fā)和排便情況等,曠場實驗評價大鼠的自主活動能力,對模型進行評估。

1.4.3分組及給藥 造模結束后,根據(jù)大鼠體質量及曠場實驗結果將模型大鼠隨機分為模型對照組、多潘立酮組、新皮組、十年皮組和模擬陳化組,每組7只。根據(jù)陳皮臨床人的最大劑量換算大鼠的等效劑量為1.05 g·kg-1,給藥劑量設為等效劑量的2倍,即為2.1 g·kg-1。多潘立酮給藥劑量為6.17 mg·kg-1。模型對照組用常溫0.9%氯化鈉溶液灌胃,多潘立酮組灌胃多潘立酮溶液,新皮組、十年皮組和模擬陳化組分別灌胃新皮水提液、十年皮水提液以及加熱模擬陳化藥液,給藥7 d。給藥期間,各組正常喂飼,飲水自由。

1.5觀測指標 一般狀態(tài):每天觀測大鼠的體質量、精神、毛發(fā)及糞便等。行為學評價:采用曠場實驗法觀察各組動物在造模和給藥期間的自主活動能力。在造模的第14天、第21天和給藥7 d分別進行大鼠曠場實驗,以大鼠三爪及以上跨進箱內(nèi)其他方格數(shù)的總格子數(shù)作為水平活動得分,以大鼠雙前肢抬離地面及攀附敞箱四壁的總次數(shù)記為垂直活動得分,記錄每只大鼠5 min內(nèi)的行為活動得分。

胃殘留率和小腸推進率:末次給藥后,所有大鼠禁食不禁水24 h。每只大鼠灌胃碳糊2 mL,30 min后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,分別取出胃和小腸。將胃用濾紙擦凈,稱量并記錄質量。沿胃大彎剪開后用4 ℃、0.9%氯化鈉溶液清洗內(nèi)容物,擦干后稱質量。胃質量與胃凈質量的差值與碳糊質量的百分比即為胃殘留率。取出小腸后分別測量幽門與碳糊的距離和幽門到回盲區(qū)的距離,兩者比值的百分數(shù)即為小腸推進率。

胃竇組織病理觀察:取大鼠胃竇組織,用4%多聚甲醛固定,然后脫水、浸蠟、包埋和切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色后觀察胃竇組織病理學變化。

胃腸激素含量測定:各組大鼠經(jīng)腹主動脈采血,收集血液后在室溫下靜置30 min,于4 ℃離心20 min(3 000 r·min-1,r=8.54 cm),分離血清保存在-80 ℃冰箱中。取各組大鼠血清按照ELISA試劑盒的操作方法分別測定胃動素和5-HT的含量。

蛋白表達:取各組大鼠十二指腸于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用Western blotting法測定各組大鼠十二指腸中5-HT4R的蛋白表達,按照操作順序進行蛋白提取-制膠-電泳-轉膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-化學發(fā)光-圖像分析。

2 結果

2.1一般狀態(tài) 在造模期間正常對照組大鼠毛發(fā)有光澤,行動靈敏,精神狀態(tài)良好,糞便形態(tài)正常。與正常對照組比較,模型組動物從造模第7天開始出現(xiàn)毛發(fā)散亂,形體漸瘦,有暴躁、易怒、焦躁不安的傾向,糞便質地稀軟,有腥臭味。造模結束后模型組大鼠毛發(fā)干枯,形體明顯消瘦,精神狀態(tài)較差,易被激怒,糞便水分含量大,腥臭味明顯。與模型對照組比較,各給藥組大鼠毛發(fā)有光澤,形體恢復明顯,精神狀態(tài)明顯好轉,活動量增加,糞便形態(tài)正常。中醫(yī)認為過激情緒會傷及肝脾從而導致脾胃不和,現(xiàn)代醫(yī)學也認為精神心理因素是消化不良的誘因之一,因此本實驗在實驗過程中觀察各組大鼠的精神情緒變化,結果表明多因素應激干預法造?？芍麓笫笄榫w暴躁易怒,給藥治療后精神狀態(tài)明顯改善。

2.2體質量變化 在造模期間,正常對照組大鼠的平均體質量穩(wěn)定增長,增速較快。與正常對照組比較,模型組大鼠體質量增長緩慢。第21天時模型組與正常對照組的平均體質量相差較大,見圖1。表明該造模方法可明顯抑制大鼠體質量增加。

圖1 大鼠造模期間平均體質量變化趨勢

給藥1周后,多潘立酮組、新皮組、十年皮組和模擬陳化組的大鼠體質量增長較快,具體見圖2。表明給藥干預后有助于FD大鼠體質量的恢復。

圖2 大鼠給藥期間平均體質量變化趨勢

2.3行為學得分 與正常對照組比較,造模期間模型組大鼠的水平和垂直得分明顯減少,說明多因素應激干預法造模能顯著降低大鼠的自主活動水平。見表1。

表1 大鼠造模期間水平和垂直運動得分

綜合造模期間一般情況、體質量變化以及行為學評分說明采用郭氏夾尾、不規(guī)則喂養(yǎng)和0 ℃、0.9%氯化鈉溶液灌胃等方法可較好地制造FD大鼠模型。

由給藥后各組大鼠行為學得分結果可知,與正常對照組比較,模型組的水平得分和垂直得分均降低。連續(xù)給藥7 d后,新皮組、十年皮組以及模擬陳化組大鼠的水平和垂直運動得分均高于模型對照組 [F(5,36)=2.155,F(5,36)=2.027,P<0.05或P<0.01],說明廣陳皮能提高FD大鼠的自主活動水平。具體見表2。

表2 大鼠給藥后水平和垂直運動得分

2.4胃殘留率和小腸推進率 結果見表3。與正常對照組比較,模型對照組大鼠的胃殘留率明顯上升,小腸推進率明顯下降(P<0.05);與模型對照組比較,各廣陳皮給藥組大鼠的胃殘留率下降、小腸推進率升高 [F(5,36)=2.010,F(5,36)=8.891,P<0.05或P<0.01],其中新皮組和十年皮組大鼠的小腸推進率升高明顯。

表3 6組大鼠的胃殘留率和小腸推進率比較

2.5胃竇組織的病理觀察 各組大鼠胃竇組織HE染色病理結果見圖3。可知,正常對照組和模型對照組及各給藥組均未發(fā)現(xiàn)器質性改變,胃竇組織無潰瘍及炎性浸潤等明顯病理特征。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.多潘立酮組;D.新皮組;E.十年皮組;F.模擬陳化組。

2.6胃動素和5-HT含量 各組大鼠血清中胃動素和5-HT含量測定結果見表4。與正常對照組比較,模型對照組大鼠血清中胃動素和5-HT的含量均明顯下降(P<0.05)。與模型對照組比較,各廣陳皮給藥組大鼠血清中胃動素和5-HT的含量明顯升高 [F(5,36)=4.841,F(5,36)=5.032,P<0.05或P<0.01],其中新皮組和模擬陳化組大鼠血清中的胃動素含量顯著升高;新皮組和十年皮組大鼠血清中的5-HT含量顯著升高。

表4 6組大鼠血清中胃動素和5-HT的含量

2.75-HT4R蛋白表達 見圖4。與正常對照組比較,模型對照組大鼠十二指腸中的5-HT4R蛋白表達量下降,各給藥組大鼠十二指腸中的5-HT4R蛋白表達量顯著升高;與模型對照組比較,各陳皮給藥組和多潘立酮組的5-HT4R蛋白表達量顯著升高 [F(5,12)=40.378,P<0.05或P<0.01]。表明本實驗采用多因素應激干預法造?？上抡{FD大鼠十二指腸中5-HT4R蛋白表達,廣陳皮不同給藥組大鼠十二指腸的5-HT4R蛋白表達量顯著升高,與正常對照組比較也明顯升高,說明廣陳皮不僅能回調FD模型大鼠十二指腸的5-HT4R蛋白表達,也可上調正常大鼠的5-HT4R蛋白表達。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.新皮組;D.十年皮組;E.模擬陳化組;F.多潘立酮組。①與正常對照組比較,t=3.952,P<0.05; ②與正常對照組比較,t=-10.157～-5.160,P<0.01;③與模型對照組比較,t=-11.410～-7.443,P<0.01。

3 討論

中醫(yī)認為怒傷肝思傷脾,肝木乘脾土,肝氣郁結致使胃失和降、脾失健運而出現(xiàn)消化不良,因此本實驗采用夾尾刺激可激怒大鼠并引發(fā)打斗,結合不規(guī)則飲食和0 ℃、0.9%氯化鈉溶液灌胃模擬功能性消化不良癥狀。造模期間,模型對照組大鼠的體質量增長緩慢,暴躁易怒,自主活動明顯減少,胃竇組織無明顯器質性病變,說明該方法可較好地模擬FD的癥狀。給藥治療后各給藥組的體質量增長明顯高于模型對照組,精神狀態(tài)明顯好轉,自主活動也明顯增加,胃殘留率和小腸推進率也明顯改善,說明廣陳皮可改善FD模型大鼠的消化不良癥狀,促進胃腸動力。與模型對照組比較,新皮、十年皮組和模擬陳化組均可促進胃排空和小腸推進,新皮和十年皮的促進小腸推進作用更明顯。表明不同陳化時間廣陳皮對FD大鼠胃腸動力的促進作用差異不明顯。

胃腸激素是一類具有調節(jié)自身胃腸道運動的特殊小分子肽活性物質,主要由消化系統(tǒng)中的內(nèi)分泌細胞所分泌。胃動素是消化道常見的激素之一,具有促進胃腸運動作用和分泌作用。各廣陳皮給藥組均能促進FD大鼠胃動素的分泌,其中新皮促進胃動素分泌作用強于十年皮組,與模擬陳化樣品相近。表明廣陳皮可通過促進胃動素分泌增強胃腸動力,與文獻報道結果一致[12]。

5-HT是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的神經(jīng)遞質,參與調節(jié)胃腸道運動和分泌功能。人體內(nèi)90%的5-HT 存在于消化道黏膜,外周神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT 幾乎全部由位于胃腸腺腔底部的腸嗜鉻細胞產(chǎn)生貯存和再攝取[13]。研究表明5-HT 通過對胃腸動力、分泌和內(nèi)臟敏感性等影響從而在FD發(fā)病機制中發(fā)揮作用[14]。本實驗結果表明,廣陳皮能夠促進FD大鼠血清中5-HT分泌,其中新皮組和十年皮組5-HT含量高于模擬陳化組,說明不同陳化方法對5-HT的影響存在差異。5-HT通過作用于不同受體來調節(jié)胃腸道的運動,其中與胃腸道關系較為密切的興奮性受體有5-HT4R等。5-HT4R受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體,在腦和外周組織均有分布,在外周主要分布于胃腸道、膀胱和心臟,參與胃腸道平滑肌收縮,激活神經(jīng)元細胞釋放乙酰膽堿從而促進胃腸運動。本實驗的蛋白免疫印跡法結果表明廣陳皮可上調FD大鼠十二指腸5-HT4R蛋白表達,推測廣陳皮可能是通過5-HT與十二指腸中的5-HT4R受體結合來增強腸動力。

廣陳皮中主要含有黃酮類和揮發(fā)油類成分,其中黃酮類成分具有促消化、抗炎及抗氧化等藥理作用[15-16];揮發(fā)油具有平喘、止咳、抗變應性炎癥、抗氧化和抗菌的作用[17],是其主要的活性成分。本項目組前期研究和文獻報道[7,18-19]均表明隨著陳化時間的延長,主要黃酮類成分橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量均有增加,揮發(fā)油類成分的種類和相對含量均發(fā)生變化,酯、酸、醇類成分增加。黃酮類和揮發(fā)油類成分在陳化過程中量變和質變與藥效的相關性仍需進一步研究。

綜上所述,本研究結果表明,廣陳皮可促進FD模型大鼠的胃腸動力,其作用機制可能與促進胃動素和5-HT的分泌及十二指腸中5-HT4R蛋白表達上調有關。新陳皮、10年陳皮和模擬陳化樣品均可促進胃腸動力,陳化時間對FD大鼠的促胃腸動力作用影響不明顯,初步確定模擬陳化方法可行。筆者在下一步實驗中將優(yōu)化廣陳皮模擬陳化條件并全面比較模擬陳化與自然陳化樣品的藥效作用差異,為廣陳皮人工模擬陳化提供更多科學依據(jù)。