楊娜,張?zhí)祆?蔣陳曉,2,羅雪梅,朱懷軍,王敏

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院1.藥學(xué)部;2.急診醫(yī)學(xué)科,南京 210008)

百草枯是一種季銨鹽類高效、廣譜除草劑,其在土壤中發(fā)揮作用后可很快失去活性[1]。然而,百草枯對(duì)人體毒性很強(qiáng),經(jīng)口攝入后致死率60%～80%[2]。百草枯可造成人體多處臟器損傷[3],其中肺部病變及功能受損最為顯著[4]。急性中毒癥狀可在1 d內(nèi)出現(xiàn)肺水腫,1～3 d內(nèi)出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征,部分患者度過急性期后可在1～2周內(nèi)發(fā)生肺間質(zhì)纖維化,最終導(dǎo)致呼吸衰竭[5]。少數(shù)患者即使存活,肺部功能也嚴(yán)重受損且生活質(zhì)量下降[6]。百草枯尚無特效解毒劑,其毒性機(jī)制尚不明確,且臨床研究匱乏。即使采取多種處理措施也很難改善預(yù)后,中毒程度較輕的患者,采取適當(dāng)急救措施即可有很高的生存率[7-8]。因此,早期預(yù)測(cè)對(duì)于急性期采取合理的治療措施具有很高的指導(dǎo)意義[9]。近年來,pentraxin-3等相關(guān)血液指標(biāo)對(duì)百草枯中毒預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值引起關(guān)注[10]。 筆者擬通過超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)對(duì)百草枯中毒患者早期血漿進(jìn)行代謝組學(xué)研究,旨在進(jìn)一步了解百草枯急性中毒的早期相關(guān)機(jī)制,并尋找潛在的預(yù)后參考生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部百草枯中毒患者早期血漿檢測(cè)樣本12例。納入標(biāo)準(zhǔn):①誤服百草枯中毒后24 h內(nèi)血漿樣本;②百草枯濃度測(cè)定值大于定量限。排除標(biāo)準(zhǔn):①患者合并惡性腫瘤;②患者合并重要臟器功能障礙性疾病;③患者中毒前服用其他藥物或毒物。對(duì)照組樣本為健康人群血漿樣本12例。

1.2儀器及試劑 Exion LC AD超高效快速液相色譜(美國 AB SCIEX公司);TripleTOF 5600+型高分辨質(zhì)譜(美國 AB SCIEX公司);TGL-16.5M冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);DW-HL340超低溫冰箱(Thermo Fisher公司,美國),乙腈(色譜純,德國Merck公司)。

1.3色譜條件與質(zhì)譜條件 色譜條件:Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣器溫度:4 ℃;流動(dòng)相為水相(A):0.1%甲酸溶液,有機(jī)相(B):乙腈。梯度洗脫程序如下:0.0～1.0 min,10%～30%(B);1.0～19.0 min,30%～95%(B);19.0～20.0min,95%(B);20.0～25.0 min,95%～10% (B)。流速為0.4 mL·min-1,進(jìn)樣體積為5 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,采用正、負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式;正負(fù)電壓:5 500 V/-4 500 V;離子源溫度550 ℃;霧化氣壓力:379.2 kPa;輔助加熱氣壓力:379.2 kPa;氣簾氣壓力:241.3 kPa;去簇電壓:±80 V;碰撞能為35 V,碰撞能分散度15 V;一級(jí)質(zhì)譜全掃描范圍為100～1000 Da;動(dòng)態(tài)背景扣除模式;采用信息依賴采集 (nformation-dependent acquisition,IDA) 模式對(duì)符合IDA標(biāo)準(zhǔn)的離子進(jìn)行MS/MS碎片離子采集。

1.4樣本制備 各組平行取血漿樣本40 μL,分別加入冰乙腈160 μL,渦旋振蕩5 min,高速離心(4 ℃,14 000 r·min-1,10 min,r=8.6 cm)2次后,取上清液100 μL于進(jìn)樣小瓶進(jìn)行UPLC-QTOF-MS分析,進(jìn)樣體積5 μL。

1.5質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程 UPLC-QTOF-MS原始數(shù)據(jù)文件采用開源數(shù)據(jù)處理軟件XCMS,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)、峰濾噪、峰識(shí)別、及峰對(duì)齊。對(duì)包含質(zhì)荷比、保留時(shí)間、峰面積等信息的二維數(shù)據(jù)陣進(jìn)行分析。參照質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)篩選原則、缺失值填補(bǔ)、數(shù)據(jù)歸一化及標(biāo)尺化處理后,將篩選出的變量導(dǎo)入SIMCA-P 13.0版軟件(Umetrics,瑞典),并進(jìn)行主成分分析(principle component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminate analysis,OPLS-DA)。 差異代謝物篩選選取OPLS-DA模型VIP參數(shù)值>1和顯著性差異P<0.05的變量,同時(shí)滿足差異倍數(shù)(fold change,FC)<0.833或>1.2,經(jīng)人類代謝組數(shù)據(jù)庫鑒定。對(duì)差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst采用熱圖(Heatmap)分析。

2 結(jié)果

2.1兩組人群人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料比較 共入組血漿樣本24例,其中誤服百草枯中毒后24 h內(nèi)血漿樣本和健康對(duì)照人群血漿樣本各12例,見表1。兩組人群性別、年齡構(gòu)成一致,腎功能指標(biāo)肌酐、尿酸以及腎小球?yàn)V過率(glomeruar filtration rate,GFR)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但組內(nèi)個(gè)體差異大。百草枯中毒組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)水平顯著高于對(duì)照組。

表1 兩組人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料比較

2.2主成分分析PCA 本研究基于前期方法[11],采用UPLC-QTOF-MS對(duì)兩組人群進(jìn)行血漿代謝組學(xué)分析。對(duì)質(zhì)量控制(quality qontrol,QC)樣本總離子流(total ionchromatogram,TIC)圖疊加后顯示隨行 QC 樣本色譜輪廓圖變異小、重疊度高(圖1),說明本試驗(yàn)建立的 UPLC-Q-TOF/MS方法在樣本進(jìn)樣分析過程中具有較好的穩(wěn)定性。通過XCMS軟件對(duì)色譜峰進(jìn)行提取校準(zhǔn)后正離子和負(fù)離子模式下分別得到色譜峰2 214和2 053個(gè)。經(jīng)80%去零規(guī)則消除缺失值、數(shù)據(jù)歸一化及標(biāo)尺化處理后,進(jìn)一步進(jìn)行PCA分析。PCA圖中每個(gè)點(diǎn)代表血漿代謝組成成分的得分。通過PCA得分圖可觀察樣本的聚集、離散及離群點(diǎn),樣本點(diǎn)靠的越近說明代謝組組成越接近,而離的越遠(yuǎn)說明樣本間代謝組差異越大。見圖2。結(jié)果顯示,QC樣本點(diǎn)聚集良好,證明該分析方法具有良好的可重復(fù)性。正離子模式計(jì)算出R2X(cum)=0.668,Q2(cum)=0.504;負(fù)離子模式計(jì)算出R2X(cum)=0.672,Q2(cum)=0.494。百草枯中毒組較健康對(duì)照組呈現(xiàn)一定的分離度,且中毒組PCA得分圖顯示出較大的個(gè)體差異。

圖1 質(zhì)量控制樣本的總離子流重疊圖

圖2 血漿樣本PCA和OPLS-DA結(jié)果

2.3OPLS-DA分析 進(jìn)一步采用OPLS-DA對(duì)百草枯中毒和健康人群的血漿樣本進(jìn)一步區(qū)分,見圖2。百草枯中毒和健康人群血漿互相分離,代謝輪廓有明顯區(qū)別。預(yù)測(cè)成分對(duì)差異的解釋水平(正離子模式:R2Y=0.983;負(fù)離子模式:R2Y=0.978)和預(yù)測(cè)水平(正離子模式:Q2=0.77;負(fù)離子模式:Q2=0.71)較好。通過200次置換檢驗(yàn)計(jì)算出每組截距,其中正離子模式下模型參數(shù)R2=0.874,Q2=-0.405;負(fù)離子模式下模型參數(shù)R2=0.867,Q2=-0.398,其數(shù)值均<1,判定模型穩(wěn)定可靠,預(yù)測(cè)性好,不存在過擬合。

2.4差異代謝物篩選與分析 基于OPLS-DA模型,比較兩組人群血漿中的差異代謝物,選取VIP參數(shù)值>1、顯著性差異P<0.05并同時(shí)滿足FC<0.833或>1.2的變量,經(jīng)二級(jí)譜庫對(duì)差異化合物進(jìn)行精確鑒定分析,見表2。正、負(fù)離子模式下共篩選出差異化合物48個(gè),包含磷脂、氨基酸、飽和或不飽和脂肪酸等。采用MetaboAnalyst5.0對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路富集分析后發(fā)現(xiàn),主要涉及亞麻酸和亞油酸代謝、磷脂酰乙醇胺合成、同型半胱氨酸降解等通路。對(duì)代謝物的水平分析發(fā)現(xiàn),中毒組血漿中脂肪酸及磷脂[溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)、溶血磷脂酰肌醇(LysoPI)]等變化顯著(P<0.05),見圖3。采用火山圖結(jié)合統(tǒng)計(jì)顯著性量度(P值)和變化幅度(倍數(shù))進(jìn)一步分析顯示,有23種差異化合物在兩組中變化超過2倍(圖4A),包含8種不飽和脂肪酸、6種磷脂、2種氨基酸等。其中LysoPE(22：6)和LysoPC(20：1)變化最為顯著,在百草枯中毒組血漿中水平比健康對(duì)照組分別高16.2倍(P<0.05)和17.9倍(P<0.05),其他差異代謝物變化均在4倍以內(nèi)。亞油酸、苯丙氨酰苯丙氨酸、LysoPC(16：0) 和LysoPC(17：0) 在百草枯中毒組血漿中水平顯著低于健康對(duì)照組。

N01—N12:健康對(duì)照組;B01—B12:百草枯中毒組。

A.中毒及對(duì)照組差異化合物火山圖; B.L-乳酸;C.二十碳二烯酸;D.4-羥丁酸;E.甜菜堿;F.苯丙氨酰苯丙氨酸;G.1-磷酸鞘氨醇;H.溶血磷脂(20：1);I.溶血磷脂酰乙醇胺(22：6)。①與存活組比較,t=3.26～3.54,P<0.01;②與存活組比較,t=2.33～2.71,P<0.05。

表2 兩組人群差異代謝物

百草枯中毒組12例患者中有6例出現(xiàn)急性百草枯中毒后死亡。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),百草枯中毒組較健康對(duì)照組血漿中顯著變化的48種差異化合物中,有8種化合物在中毒存活和死亡亞組中差異顯著,見圖4。除苯丙氨酰苯丙氨酸外,包括LysoPE(22：6)、LysoPC(20：1)、L-乳酸、二十碳二烯酸、4-羥丁酸、甜菜堿、1-磷酸鞘氨醇在內(nèi)的7種化合物在中毒死亡組中水平顯著高于存活組。值得一提的是,LysoPE(22：6)和LysoPC(20：1)變化同樣最為顯著,在死亡組中水平分別為存活組水平的14.5倍(P<0.05)和16.4倍(P<0.01)。以上提示,二者在百草枯急性中毒及致死相關(guān)毒性機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

3 討論

目前針對(duì)百草枯中毒尚無特效解毒劑,對(duì)于其中毒預(yù)后的早期評(píng)估對(duì)臨床采取合理措施具有一定指導(dǎo)意義。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,是一種研究生物系統(tǒng)受到刺激后代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間變化的一種技術(shù)手段[12]。近些年來,代謝組學(xué)技術(shù)在疾病預(yù)后評(píng)估、藥物/毒物作用機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)等多方面廣泛應(yīng)用[13-14]?，F(xiàn)階段,由于急性百草枯中毒較為罕見,臨床樣本較難獲得,針對(duì)百草枯中毒后的代謝組學(xué)研究多集中在動(dòng)物水平。有研究表明,百草枯中毒大鼠肺組織氨基酸代謝、脂肪代謝等代謝途徑可能參與了百草枯中毒致肺損傷的病理進(jìn)程[15]。其中,棕櫚酸、硬脂酸等脂肪酸代謝物變化趨勢(shì)與本研究中血漿代謝組學(xué)結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn),急性百草枯患者中毒早期血漿中LysoPE(22：6)和LysoPC(20：1)升高最為顯著,且死亡患者血漿中水平顯著高于存活患者。值得關(guān)注的是,二者皆為磷脂類物質(zhì)。研究表明,LysoPC為強(qiáng)促炎遞質(zhì),可通過激活和募集黏附分子、生長(zhǎng)因子、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞來增強(qiáng)炎癥,也可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能參與免疫反應(yīng)。在輸血或直徑≤2.5 μm的顆粒物所致的急性肺損傷過程中,LysoPC水平均顯著上調(diào)[16]。臨床研究還發(fā)現(xiàn),作為促肺纖維化介質(zhì)溶血磷脂酸的合成前體,血漿LysoPC可作為特發(fā)性肺纖維化的潛在生物標(biāo)志物。以上提示,血漿LysoPC水平與百草枯中毒所致肺功能損害及肺纖維化具有密切關(guān)聯(lián)。血漿LysoPE與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17-18],LysoPE對(duì)于非小細(xì)胞肺癌具有較高的診斷效能(AUC:0.78)和靈敏度(94.75%)[19],提示LysoPE與肺部生理病理狀態(tài)存在密切關(guān)聯(lián)。

不飽和脂肪酸二十碳二烯酸為促炎遞質(zhì),且血漿不飽和脂肪酸水平與肺功能呈負(fù)相關(guān),這與死亡患者血漿中水平顯著高于存活患者相一致[20]。本研究還發(fā)現(xiàn)死亡患者血漿中包括L-乳酸和4-羥丁酸在內(nèi)的單羧酸類化合物水平顯著高于存活患者。二者是細(xì)胞重要的分解代謝產(chǎn)物,同時(shí)可作為底物參與到其他生物代謝途徑中。二者在血漿中的較高水平不僅說明中毒患者機(jī)體處于顯著的代謝異常狀態(tài),負(fù)責(zé)其轉(zhuǎn)運(yùn)的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(monocarboxylate transporter,MCT)的表達(dá)或活性是否存在異常還需要進(jìn)一步考察,而MCT功能失調(diào)被證實(shí)與肺、腎臟等多種臟器疾病進(jìn)程密切相關(guān)[21]。與所篩選的其他差異代謝物不同,苯丙氨酰苯丙氨酸被發(fā)現(xiàn)在死亡患者血漿中水平顯著低于存活患者,有研究表明苯丙氨酰苯丙氨酸可以影響蛋白質(zhì)的合成和分泌,與內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)[22],而其與急性百草枯中毒后所致的各臟器嚴(yán)重?fù)p傷之間的關(guān)聯(lián)還需要進(jìn)一步探究。

綜上所述,本研究通過UPLC-QTOF-MS技術(shù)對(duì)急性百草枯中毒患者早期血漿進(jìn)行代謝組學(xué)研究,可為急性百草枯中毒預(yù)后早期評(píng)估提供參考,為中毒所致肺損傷提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。