馮明子，傅荔艷，葛盈露，馬婉婉，王鵬，孫永，史永林,

1.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 合肥 230032；2.安徽省疾病預(yù)防控制中心，安徽省公共衛(wèi)生研究院，安徽省醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)?？撇≡⑸锓肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)室

柯薩奇病毒A 組16 型（coxsackievirus A16,CV-A16）是小RNA 病毒科腸道病毒屬的一種，為單正鏈RNA 病毒，基因組全長(zhǎng)約7.4 kb，是引發(fā)手足口?。╤and, foot and mouth disease, HFMD）的常見病原體之一，于1951 年首次被分離出[1]。按照CV-A16 基因組VP1 區(qū)基因序列可將其分為A、B和D 三個(gè)基因型，A 基因型的唯一成員是G-10 原型株；而B 基因型分為B1、B2 亞型，B1 亞型進(jìn)一步分為B1a、B1b 和B1c；D 基因型為新發(fā)現(xiàn)型別，比較少見[2-3]。近年來安徽省HFMD 發(fā)病水平一直較高，而對(duì)HFMD 相關(guān)病原學(xué)的分子分型研究相對(duì)較少[4-5]。本研究收集安徽省各地的HFMD CV-A16核酸陽(yáng)性咽拭子標(biāo)本，利用生物信息學(xué)和分子遺傳學(xué)方法鑒定病毒基因型，并對(duì)其VP1區(qū)測(cè)定的序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化和氨基酸變異位點(diǎn)分析，為進(jìn)一步研究疾病分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 資料與標(biāo)本來源 本研究中安徽省2016 年1月—2020 年12 月HFMD 病例信息來源于中國(guó)疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)傳染病報(bào)告管理信息系統(tǒng)。收集安徽省各市（縣、區(qū)）2016 年1 月—2020 年12 月HFMD患者CV-A16核酸陽(yáng)性咽拭子樣本。病例標(biāo)本采集與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)符合《手足口病預(yù)防控制指南（2009版）》[6]要求。

1.2 主要試劑與儀器 核酸提取試劑盒（665A，中國(guó)臺(tái)灣圓點(diǎn)公司）；磁珠法自動(dòng)核酸提取儀（SLA-32，中國(guó)臺(tái)灣圓點(diǎn)公司）；熒光定量PCR 擴(kuò)增儀（Quant-Studio 5,Thermo Fisher）；普通PCR 擴(kuò)增儀（Mastercycler X50P,Eppendorf）；腸道病毒CV-A16熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（P531，西安天隆公司）；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver 2.0（RR055A,Takara）。

1.3 核酸抽提與熒光定量PCR 和RT-PCR 取出保存的咽拭子標(biāo)本在室溫條件下融化，漩渦振蕩混勻后在二級(jí)生物安全柜內(nèi)取200 μL 混勻液抽提病毒RNA，提取步驟按照核酸提取儀操作說明書進(jìn)行，程序運(yùn)行完成后吸取核酸洗脫液置-20 ℃?zhèn)溆?。采用腸道病毒CV-A16 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒對(duì)收集到的HFMD 核酸陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢出的CV-A16 陽(yáng)性標(biāo)本VP1 區(qū)基因序列進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。CV-A16 VP1 區(qū)基因RT-PCR 擴(kuò)增引物（CV-A16-VP1-S/ CV-A16-VP1-A）參照文獻(xiàn)[7]，RT-PCR 擴(kuò)增體系25 μL，反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄50 ℃30 min，1 個(gè)循環(huán)；預(yù)變性95 ℃15 min，1 個(gè)循環(huán)；三步循環(huán)94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)；總延伸72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離特異性目的條帶。

1.4 基因序列測(cè)定與進(jìn)化分析 將擴(kuò)增出的陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送到上海伯杰醫(yī)療科技股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到腸道病毒在線分型網(wǎng)站（https://www.rivm.nl/mpf/typing tool/enterovirus/）進(jìn)行CVA16 基因型別分析，并同步提交到NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 比對(duì)。從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載CV-A16 各基因型參考序列，在MEGA 6.0 生物軟件中采用Clustal W 法進(jìn)行基因序列比對(duì)，采用鄰接法（neighbor-joining, NJ）構(gòu)建CV-A16 VP1 區(qū)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。腸道病毒參考株VP1 區(qū)序列分別為U05876、 EU812514、 AM292468、 AM292455、LT577709、 AM292476、 JN248420、 KU596021、KX871389、KX586352、MW197387、MW999272、MW999274、MT553210、MT553192、MT553208、MW197395、LC603085、MT119437、MT553222、MT663414、MZ043547、MZ491035、KM260139、KU595992、KX871449、MH003973、MT119428、MW197293、MW197351、MW462142、KC866888、KP341916。

2 結(jié) 果

2.1 HFMD 流行概況 2016—2020 年安徽省累計(jì)報(bào)告HFMD 實(shí)驗(yàn)室確診病例16 650 例，各年依次為1 057 例、2 955 例、4 202 例、3 962 例、4 474例。腸道病毒A 組71 型（enterovirus A71,EV-A71）共1 296 份（占7.78%）；CV-A16 型共3 809 份（占22.88%）；其他型別共11 545 份（占69.34%）。2016—2020 年CV-A16 在實(shí)驗(yàn)室確診病例中的構(gòu)成比依次為20.72%（219/1 057）、22.91%（677/2 955）、23.89%（1 004/4 202）、42.58%（1 687/3 962）、4.96%（222/4 474）。見圖1。

圖1 2016—2020年安徽省HFMD實(shí)驗(yàn)室確診病例和CV-A16病例分布情況Figure 1 Monthly reported HFMD cases confirmed via laboratory studies and the proportion of CV-A16 cases in Anhui Province from 2016 to 2020

2.2 測(cè)序與基因型別鑒定 共有436 份CV-A16核酸陽(yáng)性樣本納入研究。經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)和同源性分析獲得290 條陽(yáng)性序列，均為B1 亞型，其中B1a 基因亞型65 株，占22.41%（65/290），B1b 基因亞型225株，占77.59%（225/290）。見表1。

表1 2016—2020年安徽省HFMD CV-A16基因型分布情況Table 1 Distribution of HFMD CV-A16 genotypes in Anhui Province from 2016 to 2020

2.3 同源性比較與進(jìn)化分析 290 條CV-A16 VP1基因序列核苷酸堿基均為891 個(gè)，編碼297 個(gè)氨基酸，未見缺失或插入序列；其核苷酸和氨基酸序列同源性為86.80%～100.00%和97.60%～100.00%，與CV-A16原型株（G-10,U05876）核苷酸和氨基酸序列同源性為74.10%～76.80%和90.50%～92.20%；65 條B1a 型VP1 區(qū)基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中B1a 參考株（KC866888）核苷酸和氨基酸序列同源性為93.00%～99.90%和98.60%～100.00%，225 條B1b 型VP1 區(qū)基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中B1b參考株（KP341916）核苷酸和氨基酸序列同源性為88.40%～99.60%和98.60%～100.00%。

CV-A16 VP1 基因序列親緣性進(jìn)化樹分析表明，2016—2020 年安徽省CV-A16 流行毒株屬于B基因型B1a 和B1b 基因亞型，未鑒定出其他基因型。進(jìn)一步分析顯示，CV-A16 B1a 基因亞型流行株在遺傳進(jìn)化上大致分為Cluster A、Cluster B、Cluster C 和Cluster D 分支簇。見圖2。2017 年阜陽(yáng)市、2020 年淮南市和合肥市部分B1a 流行株屬于Cluster A 進(jìn)化分支；2019 年合肥市、宣城市、黃山市、蚌埠市和淮北市B1a 流行株屬于Cluster B 進(jìn)化分支；2018 年和2020 年合肥市部分B1a 流行株屬于Cluster C進(jìn)化分支；2016 年安慶市B1a流行株屬于Cluster D 進(jìn)化分支。Cluster D 分支簇流行株與福建株（KU596021）、山東煙臺(tái)株（KX586352）、上海株（KX871389）親緣性關(guān)系較近。

圖2 2016—2020年安徽省CV-A16 VP1區(qū)基因進(jìn)化樹Figure 2 Phylogenetic tree of VP1 gene sequences of CVA16 strains in Anhui Province from 2016 to 2020

2016—2020年鑒定出的CV-A16 B1b基因亞型流行株在遺傳進(jìn)化上大致分為6 個(gè)分支簇（ClusterⅠ～Ⅵ），見圖2。2016 年阜陽(yáng)市、合肥市，2017 年宣城市、安慶市、滁州市，2018 年蚌埠市、銅陵市，2019 年合肥市、宣城市的B1b 流行株屬于ClusterⅠ進(jìn)化分支；2017 年淮北市和阜陽(yáng)市，2018 年合肥市和蚌埠市B1b 流行株屬于Cluster Ⅱ進(jìn)化分支；2016 年安慶市和阜陽(yáng)市B1b 流行株屬于Cluster Ⅲ進(jìn)化分支；2016 年合肥市和阜陽(yáng)市，2017 年合肥市、宣城市、安慶市和滁州市，2018 年銅陵市，2019年宣城市和銅陵市部分流行株屬于Cluster Ⅳ進(jìn)化分支；2016 年阜陽(yáng)市、安慶市，2017 年滁州市、阜陽(yáng)市、合肥市和2019 年合肥市部分流行株屬于Cluster Ⅴ進(jìn)化分支；2016 年安慶市、2017 年合肥市、2018年銅陵市部分流行株屬于Cluster Ⅵ進(jìn)化分支。

2.4 VP1 區(qū)氨基酸變異位點(diǎn)分布情況 2016—2020 年CV-A16 型VP1 基因序列與CV-A16 原型株（G-10, U05876）進(jìn)行氨基酸變異情況分析發(fā)現(xiàn)，290 條序列VP1 區(qū)297 個(gè)氨基酸編碼位點(diǎn)中有20個(gè)發(fā)生變異，見表2。2016 年安徽省檢出的60 株CV-A16 B1a 和B1b 流行株VP1 區(qū)有21 個(gè)氨基酸編碼位點(diǎn)發(fā)生變異，比表2 中多了1 個(gè)變異位點(diǎn)（VP1-A11T）；2018 年和2019 年共檢出的147 株B1a 和B1b CV-A16 流行株，VP1 區(qū)有21 個(gè)氨基酸編碼位點(diǎn)發(fā)生變異，比表2 中多了1 個(gè)變異位點(diǎn)（VP1-P215L）。本研究發(fā)現(xiàn)2016—2020 年安徽省225株B1b CV-A16毒株中有181株VP1區(qū)第14個(gè)氨基酸編碼位點(diǎn)出現(xiàn)變異（S14N），占80.44%（181/225）;205 株VP1 區(qū)第23 個(gè)氨基酸編碼位點(diǎn)出現(xiàn)變異（L23M），占91.11%（205/225），在B1a CV-A16 毒株中未見變異。

表2 2016—2020年安徽省CV-A16 VP1區(qū)氨基酸位點(diǎn)變異情況Table 2 Amino acid site variation in VP1 region of CV-A16 strains in Anhui Province from 2016 to 2020

3 討 論

HFMD 的主要表現(xiàn)是患者手、足和口腔皮膚或黏膜皮損，前驅(qū)癥狀多為發(fā)燒、上呼吸道不適[8]。1981 年上海報(bào)告我國(guó)首例HFMD 病例，此后至2007 年HFMD 在我國(guó)的流行表現(xiàn)為局部地區(qū)小規(guī)模暴發(fā)，重癥和死亡病例少見；2007 年后HFMD 局部地區(qū)出現(xiàn)較大規(guī)模暴發(fā)，重癥和死亡病例數(shù)呈升高趨勢(shì)[9]。2008—2017 年安徽省共報(bào)告HFMD 病例930 613 例，其中重癥病例4 738 例，在全國(guó)排名第11 位；死亡病例147 例，在全國(guó)排名第9 位[5,10]。有研究表明，2017—2018年安徽省HFMD CV-A6實(shí)驗(yàn)室確診病例數(shù)較以往有升高趨勢(shì)，且病原譜發(fā)生變化，可能與EV-A71滅活疫苗的接種數(shù)量有關(guān)[11]。

既往研究表明，1999—2008 年我國(guó)流行的CVA16 毒株都屬于B1a 和B1b 基因亞型，在2008 年之后出現(xiàn)B1c 基因亞型，但B1b 基因亞型始終處于優(yōu)勢(shì)地位[12-14]。B1a 分支毒株最早于1995 年在日本被發(fā)現(xiàn)，隨后在我國(guó)、馬來西亞和泰國(guó)成為CV-A16主要流行株[15]。近年來，CV-A16 B1 基因亞型成為我國(guó)主要流行株，也是安徽省的優(yōu)勢(shì)流行株，以CV-A16 B1b 分支為優(yōu)勢(shì)基因型，B1a 分支與其共同流行及進(jìn)化循環(huán)[7,16]。本研究結(jié)果顯示，2016—2020年安徽省B1b基因亞型分支成為優(yōu)勢(shì)流行株，這與安徽省先前有關(guān)CV-A16 毒株分子遺傳進(jìn)化分析的情況基本一致[7,16]。

對(duì)2016—2020 年安徽省CV-A16 流行株序列基因型別的占比進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，2016—2018 年CVA16 B1b 基因亞型占比均超過90%；而2019 年CVA16 B1a 基因亞型毒株所占比例與同年CV-A16 B1b 比例接近；2020 年CV-A16 B1a 基因亞型毒株所占比例明顯高于CV-A16 B1b，占比近90%。這可能提示安徽省HFMD CV-A16 流行株基因亞型有改變的趨勢(shì)，待后續(xù)的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)證實(shí)。從進(jìn)化樹聚類結(jié)果看，安徽省CV-A16 B1a Cluster D 分支簇流行株與部分周邊城市親緣關(guān)系較近，提示安徽省HFMD CV-A16 B1a 流行株在演變過程中可能與周邊區(qū)域流行株共同循環(huán)和進(jìn)化。此外，安徽省290株CV-A16 毒株VP1 區(qū)氨基酸序列變異分析發(fā)現(xiàn)，5 年中290 株CV-A16 序列中有288 株病毒在VP1區(qū)13 位上由蘇氨酸替換為天冬酰胺，但2019 年的2 株B1b 基因亞型毒株（19BB002- 2019013b、19BB004-2019015b）在13 位上由蘇氨酸替換為絲氨酸，是否提示安徽省CV-A16 B1b 基因亞型在循環(huán)進(jìn)化中演變成新的分支有待后續(xù)研究證實(shí)。

本研究證實(shí)了HFMD CV-A16 腸道病毒B1a 和B1b 兩種基因亞型在安徽省共同存在，且B1 毒株流行的優(yōu)勢(shì)基因型別發(fā)生了變化，為完善安徽省手足口病病原譜分子進(jìn)化資料以及疾病防控提供了科學(xué)參考。但本研究收集到的手足口病患兒咽拭子樣本均來自輕癥病例，無(wú)重癥病例標(biāo)本，且2020年受新冠病毒感染疫情影響收集到的標(biāo)本數(shù)量較少，可能會(huì)導(dǎo)致本研究結(jié)果存在一定局限性。

利益沖突聲明全部作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明馮明子負(fù)責(zé)樣本收集與整理、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、論文撰寫；傅荔艷、葛盈露、王鵬參與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；馬婉婉負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)整理和分析；孫永、史永林負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、論文撰寫指導(dǎo)