周海永 郁建迪 聞華立 彭昆 顏俊鋒 汪星

糖尿病膀胱病變（diabetic cystopathy，DCP）是糖尿病患者易發(fā)生的并發(fā)癥，其發(fā)生率達(dá)40%～85%[1]。DCP 以膀胱感覺下降、逼尿肌順應(yīng)性及收縮力下降為主要臨床特征，最終可導(dǎo)致患者排尿困難，加重泌尿系感染及腎臟損傷等[2]。膀胱纖維化是其主要病理學(xué)特征，主要表現(xiàn)為間質(zhì)中的膠原蛋白異常沉積或分布發(fā)生變化[3]，目前尚無有效的防治方法。因此，探討糖尿病膀胱纖維化的病理機(jī)制具有臨床意義。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠膀胱平滑肌結(jié)構(gòu)異常，Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ，colⅠ）、Ⅲ型膠原蛋白（collagenⅢ，col Ⅲ）表達(dá)水平明顯升高，但關(guān)于糖尿病膀胱平滑肌纖維化的發(fā)生機(jī)制目前尚不明確[4]。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成與降解不平衡引起的ECM過度沉積是膀胱纖維化發(fā)展必經(jīng)階段[5]。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-13 能特異性作用于colⅠ、Ⅱ型膠原蛋白（collagen Ⅱ）和colⅢ，參與ECM 的降解與重構(gòu)，從而促成纖維化的發(fā)生[6]。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）是MMP 的內(nèi)源性特異性抑制劑，兩者相互作用對ECM 的穩(wěn)定具有重要影響。MMP過度激活也會升高TIMP-1 水平，而兩者組成的MMP-13/TIMP-1 復(fù)合物能顯著抑制MMP-13 對膠原蛋白的降解作用[7]。MMP 和TIMP 是轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）/細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子3（signaling molecule 3，Smad3）信號通路下游信號分子，DCP 可能通過該信號通路對MMP/TIMP 引起的膀胱纖維化進(jìn)行調(diào)節(jié)[8]。因此，本研究利用糖尿病大鼠膀胱組織探討TGF-β1/Smad3 信號通路調(diào)控MMP-13/TIMP-1 蛋白表達(dá)在糖尿病膀胱纖維化中的作用，為DCP 臨床治療靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 Smad3 抗體、MMP-13 抗體、TIMP-1 抗體、colⅠ抗體、col Ⅲ抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自美國Santa 公司；TGF-β1 抗體購自北京CST 公司；二抗辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的IgG 購自英國Abcam 公司；5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自日本Sigma公司；Western 封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液均購自中國碧云天生物技術(shù)公司。StatFax-2100 酶標(biāo)儀購自美國Awareness 公司；7500 Fast RT-PCR 儀購自美國Life techn0109ies 公司；S1000 PCR 逆轉(zhuǎn)錄儀、PowerPac Uhiversal 電泳儀均購自美國Bio-Rad 公司；高速低溫離心機(jī)購自日本Sigma 公司；M70C 電腦型熒光顯微鏡購自上海萬衡精密儀器有限公司。

1.2 動物分組與建模 3 月齡、健康、無特定病原體的成年雄性Wistar 大鼠100 只均購自北京維通利華實驗動物中心，體重（200±10）g，飼養(yǎng)在溫度22～26 ℃、濕度45%～75%的培養(yǎng)環(huán)境中。將80 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病組和正常對照組，每組40 只；另外20 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為TGF-β1 敲除組和Smad3 敲除組，每組10 只。采用鏈脲佐菌素構(gòu)建糖尿病大鼠模型：大鼠禁食18 h 后，按6.5 mL/kg 劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素緩沖液（配置方法：將鏈脲佐菌素溶解于0.1 mol/L pH 4.2 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中）。正常對照組大鼠按6.5 mL/kg 劑量一次性注射檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。2 h 后采集大鼠尾部靜脈第二滴血液測定血糖水平，若檢測結(jié)果顯示大鼠空腹血糖＞1.67 nmol/L 則判定糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功。建模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠8 周，每周監(jiān)測血糖水平。TGF-β1 敲除組、Smad3 敲除組大鼠采用Cas9 gene targeting 技術(shù)分別敲除TGF-β1 或Smad3 基因，利用RTPCR 和細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)等評價TGF-β1 或Smad3 基因敲除效果。

1.3 大鼠膀胱組織病理學(xué)形態(tài)觀察 兩組大鼠8 周后通過注射3%戊巴比妥鈉過量麻醉處死。將大鼠固定冰上，于恥骨上作約2 cm 的縱行切口，暴露膀胱，去除輸尿管及膀胱漿膜層后取出膀胱，反復(fù)用PBS 清洗，剔除膀胱黏膜層，獲得膀胱平滑肌組織。經(jīng)10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片，分別經(jīng)HE 或VG 染色后，在400 倍光鏡下觀察大鼠膀胱平滑肌結(jié)構(gòu)及纖維化程度。

1.4 大鼠膀胱平滑肌組織中相關(guān)信號通路因子蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。取兩組大鼠新鮮膀胱平滑肌組織，每20 mg 樣本加入150 μL 裂解液，低溫研磨儀研磨，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，提取全蛋白，根據(jù)說明書采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。5%BSA 封閉2 h，將TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1、col Ⅰ、col Ⅲ與GAPDH 一抗（1∶400 稀釋）在37 ℃下孵化1 h，然后4 ℃過夜，使用TBST 緩沖液洗膜，HRP 標(biāo)記二抗（1∶4 000稀釋）37 ℃下孵化1 h，洗膜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，經(jīng)曝光掃描后進(jìn)行圖像分析。以目的條帶與GAPDH 的灰度比值計算相關(guān)信號通路因子蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠膀胱組織病理學(xué)形態(tài)觀察 HE 及VG 染色結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠膀胱組織膠原纖維明顯增多，見圖1。

圖1 大鼠膀胱組織病理學(xué)形態(tài)觀察（A：糖尿病組，HE 染色，×400；B：正常對照組，HE 染色，×400；C：糖尿病組，VG 染色，×400；D：正常對照組，VG 染色，×400）

2.2 兩組大鼠膀胱平滑肌組織中TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1 蛋白表達(dá)水平比較 糖尿病組大鼠膀胱平滑肌組織中TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 兩組大鼠膀胱平滑肌組織中TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1蛋白表達(dá)水平比較（A：電泳圖；B：表達(dá)水平比較，aP＜0.05）

2.3 TGF-β1 敲除對糖尿病大鼠膀胱平滑肌組織MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表達(dá)水平的影響TGF-β1 敲除組大鼠膀胱平滑肌組織中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表達(dá)水平均明顯低于糖尿病組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 TGF-β1 敲除對糖尿病大鼠膀胱平滑肌組織中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、colⅢ蛋白表達(dá)水平的影響（A：電泳圖；B：表達(dá)水平比較，aP＜0.05）

2.4 Smad3 敲除對糖尿病大鼠膀胱平滑肌組織中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表達(dá)水平的影響Smad3 敲除組大鼠膀胱平滑肌組織中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表達(dá)水平均明顯低于糖尿病組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 Smad3 敲除對糖尿病大鼠膀胱平滑肌組織中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、colⅢ蛋白表達(dá)水平的影響（A：電泳圖；B：表達(dá)水平比較，aP＜0.05）

3 討論

DCP 是以間質(zhì)膠原的位置發(fā)生改變或異常沉積為特點的膀胱纖維化。本研究利用HE 或VG 染色觀察大鼠膀胱組織病理學(xué)形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠膀胱組織中膠原纖維明顯增多，符合DCP 的病理特征。研究表明，ECM 合成與降解不平衡可導(dǎo)致ECM 過度沉積，從而引起膀胱纖維化，是膀胱纖維化進(jìn)展的必經(jīng)階段[9-10]。MMP 作為一類重要的蛋白酶，能對ECM 中的多種組分進(jìn)行特異性降解，在調(diào)控過程中會造成大量膠原蛋白聚集，最終導(dǎo)致纖維化。MMP-13 具有高度的特異性，能有效分解colⅠ、col Ⅱ、col Ⅲ，其降解能力較MMP-1、MMP-8 高出40 倍，在ECM 的降解、重構(gòu)以及促進(jìn)纖維化發(fā)生中具有重要作用。相關(guān)研究表明，MMP-13 在肝纖維化大鼠肝組織中的表達(dá)水平持續(xù)升高，同時能清楚觀察到有明顯的ECM 沉積，使得基質(zhì)微環(huán)境穩(wěn)定性變差，而這也是出現(xiàn)肝ECM 重構(gòu)和不可逆性纖維化的關(guān)鍵原因，提示MMP-13 參與糖尿病肝纖維化的過程。TIMP 作為MMP 的內(nèi)源性特異性抑制劑，兩者交互作用對ECM 穩(wěn)態(tài)的維護(hù)和修復(fù)具有重要臨床意義。隨著MMP 的過度激活，TIMP-1 表達(dá)也明顯上調(diào)，而表達(dá)上調(diào)的TIMP-1 可與MMP-13 組成MMP-13/TIMP-1 復(fù)合物，進(jìn)而抑制MMP-13 降解膠原。

TGF-β1/Smad3 信號通路是造成間質(zhì)纖維化的重要途徑，也是目前研究熱點。不少學(xué)者將TGF-β1/Smad3 信號通路視作不可或缺的纖維化誘導(dǎo)因子，其對纖維化的影響主要包括以下3 點：（1）促進(jìn)ECM 成分合成，使纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增加；（2）對ECM 降解的各種酶活性進(jìn)行抑制，使TIMP 及纖維蛋白蛋白的活性增強(qiáng)，從而使得ECM 的降解受到抑制；（3）推動上皮間充質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）的轉(zhuǎn)變。由此推測，MMP-13/TIMP-1 可能會受到TGF-β1信號的調(diào)控。本研究采用Western blot 法檢測糖尿病組與正常對照組大鼠膀胱平滑肌組織中TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示糖尿病組TGF-β1、Smad3、MMP-13、TIMP-1 蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，提示MMP-13/TIMP-1 表達(dá)異常與糖尿病所致的纖維化有關(guān)，進(jìn)而推測DCP 的作用機(jī)制可能與TGF-β1/Smad3 信號通路有關(guān)。

TGF-β 家族的生物學(xué)作用需要借助完整的Smad來完成[11]。其中TGF-β1 是公認(rèn)的促纖維化核心因子，能啟動并調(diào)節(jié)ECM 的全過程[12]。第一步是TGF-β 1 與其Ⅱ型受體相結(jié)合，而Ⅱ型受體可對Ⅰ型受體進(jìn)行磷酸化，激活后的Ⅰ型受體會將Smad2、Smad3 進(jìn)行活化，之后磷酸化的Smad2、Smad3 與Smad4 一同進(jìn)入細(xì)胞中，在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控TGF-β1 靶基因的轉(zhuǎn)錄[13]。有研究表明，TGF-β1 信號通路被激活后即可通過下游Smad 和非Smad 信號通路（如p38 MAPK 和PI3K/Akt途徑）參與腎纖維化[14]。此外，李玉琴等[15]指出Smad3磷?；倪x擇性抑制劑可通過抑制α-平滑肌肌動蛋白和肌成纖維細(xì)胞的積聚，從而抑制糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程。許多銜接蛋白能將Smad2、Smad3連接至受體復(fù)合物，進(jìn)而增強(qiáng)TGF-β1 的信號傳導(dǎo)，而Smad3 能與DNA 發(fā)生相互作用，進(jìn)而活化編碼基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與信號傳導(dǎo)，Smad2 僅能與共激活因子或抑制因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)，故推測Smad3 是TGF-β1 的重要調(diào)控分子[16-17]。Yang 等[18]等探討TGFβ1/Smad/α-平滑肌肌動蛋白通路對神經(jīng)源性膀胱組織學(xué)及功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、α-平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白、colⅠ、col Ⅲ在神經(jīng)源性膀胱組織中的表達(dá)水平均明顯升高，TGF-β1可能參與組織學(xué)及功能變化的全過程。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠分別敲除TGF-β1、Smad3 后，膀胱平滑肌組織中MMP-13、TIMP-1、colⅠ、col Ⅲ蛋白表達(dá)水平均明顯降低，進(jìn)一步證實TGF-β1/Smad3 信號通路可能通過調(diào)控MMP-13/TIMP-1 參與DCP 的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，MMP-13、TIMP-1 在糖尿病膀胱纖維化中呈高表達(dá)。TGF-β1/Smad3 信號通路通過調(diào)控MMP-13/TIMP-1 蛋白表達(dá)參與糖尿病膀胱纖維化的發(fā)生、發(fā)展。