鄭巳年 崔曉波 陳嘉瑜 顏華卿 陳力 李如兵

腎細(xì)胞癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率占成人惡性腫瘤的2%～3%，但致死率極高[1]。中國腫瘤登記年報(bào)資料顯示，2015 年我國新發(fā)腎細(xì)胞癌66.8 萬例，死亡23.4 萬例，發(fā)病高峰年齡50～60 歲[2]。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）是腎細(xì)胞癌最常見的亞型，死亡率最高[3]。盡管局限性KIRC（T1～T2期）患者經(jīng)手術(shù)切除治療后5 年生存率約為93%，但是約60%的患者初次診斷即為轉(zhuǎn)移性KIRC 或在病程中發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移性KIRC 患者的5 年生存率僅為12%[4]。因此，探索KIRC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，有助于確定新的治療靶點(diǎn)，以延長患者的生存期。近年來研究發(fā)現(xiàn)，泛素-蛋白酶體途徑在惡性腫瘤的形成過程中起重要作用[5]。泛素化-去泛素化穩(wěn)態(tài)是導(dǎo)致KIRC 發(fā)生、發(fā)展的重要因素[6]。去泛素化酶從靶蛋白中去除泛素化修飾，從而調(diào)節(jié)包括細(xì)胞周期進(jìn)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡在內(nèi)的許多生物學(xué)過程[7]。泛素特異性蛋白酶是去泛素化酶的主要亞類，而人類泛素特異性蛋白酶4（ubiquitin specific protease 4，USP4）基因是泛素特異性蛋白酶家族成員之一，它位于染色體帶3p21.3 上，由22 個(gè)外顯子組成[8]。研究表明，USP4 可以通過去泛素化修飾重要蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)各種信號(hào)通路，在腫瘤、免疫和RNA 剪接等方面均有不同程度的影響[9]。然而，目前尚無研究證實(shí)USP4 是否通過去泛素化修飾功能來參與KIRC 發(fā)生、進(jìn)展的調(diào)控?；诖?，本研究利用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫和基因表達(dá)綜合（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中KIRC 患者的基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探討USP4 對(duì)KIRC 細(xì)胞增殖能力的影響，以期為KIRC的臨床診治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 人KIRC 細(xì)胞系Caki-1、OSRC-2 均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。FBS、RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；過表達(dá)USP4 的質(zhì)粒、敲低USP4 的質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒均購自蘇州吉瑪公司；Lipofectamine 2000 試劑購自美國Invitrogen 公司；PBS、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、硝酸纖維素膜、脫脂奶粉、辣根過氧化無梅標(biāo)記羊抗人的IgG、電化學(xué)發(fā)光顯影液、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、β-肌動(dòng)蛋白抗體、結(jié)晶紫均購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 （1）利用TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫（http://timer.cistrome.org/）的Gene DE 模塊分析TCGA 數(shù)據(jù)庫關(guān)于USP4 在KIRC、腎乳頭狀細(xì)胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、腎嫌色細(xì)胞癌（kidney chromophobe，KICH）和癌旁正常腎臟組織之間的差異表達(dá)。（2）從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）下載并提取TCGA-KIRC 項(xiàng)目STAR 流程的TPM 格式數(shù)據(jù)，獲得的數(shù)據(jù)中包含613 例原發(fā)性KIRC 組織和72 例正常腎臟組織，并以USP4 mRNA 表達(dá)水平的中位數(shù)（4.77 log2TPM）為界，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。（3）利用GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載包含KIRC 組織及癌旁正常腎臟組織的數(shù)據(jù)集GSE53757，其中包含72 例KIRC 患者完整的臨床資料。（4）利用Ualcan 數(shù)據(jù)庫（https://ualean.path.uab.edu/analysis.html）提供的基因表達(dá)和生存曲線的圖表，分析不同臨床病理特征患者KIRC 組織中USP4 表達(dá)的差異。（5）從HPA 數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）獲取KIRC 組織及正常癌旁組織中USP4 蛋白的免疫組化染色數(shù)據(jù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Caki-1、OSCR-2 細(xì)胞置于含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中生長，取對(duì)數(shù)生長期的Caki-1、OSCR-2 細(xì)胞，以3×104個(gè)/孔的密度均勻接種至24孔板；待細(xì)胞生長融合度為60%～70%時(shí)，按照Lipofectamine 2000 說明書步驟將目的質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 Caki-1、OSCR-2 細(xì)胞中USP4 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。收集轉(zhuǎn)染的Caki-1、OSCR-2 細(xì)胞，用PBS 溶液進(jìn)行稀釋，置于冰上預(yù)冷10 s；加入RIPA 裂解液后提取總蛋白，利用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將處理后的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h；經(jīng)一抗1∶1 000 稀釋后4 ℃孵育過夜，加入TBST 洗膜3 min×5 次；然后用辣根過氧化物酶二抗1∶3 000 稀釋后37 ℃孵育1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)成像得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4 Caki-1、OSCR-2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) （1）CCK-8 法：將各組細(xì)胞以2 000 個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h 時(shí)加入100 μL 10%CCK-8試劑，溫育3 h 后，使用酶聯(lián)儀測(cè)定450 nm 波長處的吸光度（optical density，OD）值，并以0 h 時(shí)OD 值為參照，其余時(shí)間點(diǎn)OD 值均與0 h 時(shí)OD 值相除得到增殖指數(shù)。（2）平板克隆實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，消化、收集細(xì)胞并將細(xì)胞鋪至6 孔板，每孔加入約800 個(gè)細(xì)胞、4 mL完全培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察呈單細(xì)胞懸液狀態(tài)。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周，每隔24 h 觀察細(xì)胞狀態(tài)；當(dāng)出現(xiàn)克隆時(shí)即棄去培養(yǎng)基，使用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，4%多聚甲醛固定20 min，0.25%結(jié)晶紫染色20 min，干燥后在光鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)，然后計(jì)算克隆指數(shù)?？寺≈笖?shù)為實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)目與對(duì)照組克隆數(shù)目的比值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USP4 在KIRC 組織中的表達(dá) 利用TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫分析顯示，USP4 在腎細(xì)胞癌各亞型（KICH、KIRC、KIRP）組織中的mRNA 表達(dá)水平均明顯低于癌旁正常腎臟組織；其中KIRC 組織中的USP4 mRNA 表達(dá)水平差異最為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1A。利用GEO 數(shù)據(jù)庫、TCGA-KIRC 數(shù)據(jù)庫分析顯示，USP4 在KIRC 組織中的mRNA 表達(dá)水平均明顯低于癌旁正常腎臟組織（均P＜0.05），見圖1B、C。利用HPA 數(shù)據(jù)庫中的免疫組化染色結(jié)果證實(shí)，USP4 在KIRC 組織中的蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁正常腎臟組織（P＜0.05），且USP4 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，見圖1D。

圖1 生物信息學(xué)分析USP4 在KIRC 組織中的表達(dá)（A：TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫提供的KICH、KIRC、KIRP 組織和癌旁正常腎臟組織中USP4 mRNA 表達(dá)水平比較，aP＜0.01；B：GEO 數(shù)據(jù)庫提供的GSE53757 數(shù)據(jù)集中KIRC 組織和癌旁正常腎臟組織中USP4 mRNA 表達(dá)水平比較，aP＜0.01；C：TCGA 數(shù)據(jù)庫提供的KIRC 組織和癌旁正常腎臟組織中USP4 mRNA 表達(dá)水平比較，aP＜0.01；D：HPA 數(shù)據(jù)庫提供的癌旁正常腎臟組織和KIRC 組織中USP4 蛋白表達(dá)的比較，免疫組化染色，×40）

2.2 KIRC 組織中USP4 mRNA 表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系 KIRC 組織中USP4 mRNA 表達(dá)水平與患者T 分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)、總生存率、疾病特異性生存率、無進(jìn)展生存率均有關(guān)（均P＜0.05）；與性別、年齡、N 分期、M 分期均無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

表1 KIRC組織中USP4 mRNA表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 過表達(dá)USP4 對(duì)Caki-1、OSRC-2 細(xì)胞增殖能力的影響 USP4 蛋白在Caki-1、OSRC-2 細(xì)胞中顯著過表達(dá)，見圖2A、C。過表達(dá)USP4 會(huì)明顯降低Caki-1、OSRC-2 細(xì)胞增殖指數(shù)（均P＜0.05），見圖2B、D；同時(shí)也會(huì)明顯降低Caki-1、OSRC-2 細(xì)胞克隆指數(shù)（均P＜0.05），見圖2E、F。

圖2 過表達(dá)USP4 對(duì)Caki-1、OSRC-2 細(xì)胞增殖能力的影響（A：Caki-1 細(xì)胞中USP4 表達(dá)的電泳圖；B：過表達(dá)USP4 對(duì)Caki-1 細(xì)胞增殖指數(shù)的影響，aP＜0.05；C：OSRC-2 細(xì)胞中USP4 表達(dá)的電泳圖；D：過表達(dá)USP4 對(duì)OSRC-2 細(xì)胞增殖指數(shù)的影響，aP＜0.05；E：過表達(dá)USP4 對(duì)Caki-1 細(xì)胞克隆指數(shù)的影響，aP＜0.05；F：過表達(dá)USP4 對(duì)OSRC-2 細(xì)胞克隆指數(shù)的影響，aP＜0.05）

2.4 敲低USP4 對(duì)Caki-1 細(xì)胞增殖能力的影響 敲低USP4 會(huì)明顯提高Caki-1 細(xì)胞克隆指數(shù)（均P＜0.05），見圖3。

圖3 敲低USP4 對(duì)Caki-1 細(xì)胞增殖能力的影響

3 討論

對(duì)于KIRC，目前最有效的方法是早期發(fā)現(xiàn)并實(shí)施手術(shù)治療，但是約60%患者初次診斷即為轉(zhuǎn)移性KIRC或在病程中發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，而腫瘤轉(zhuǎn)移是KIRC患者死亡的主要原因[4]。因此，探索KIRC 探索新的治療靶點(diǎn)對(duì)于精準(zhǔn)靶向治療意義重大。去泛素化酶是蛋白質(zhì)泛素化逆轉(zhuǎn)過程的蛋白酶，而USP4 作為泛素特異性蛋白酶家族成員之一，在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮腫瘤抑制作用。在食管癌中，USP4 高表達(dá)與患者預(yù)后改善有關(guān)[10]。與癌旁正常組織相比，USP4在肺腺癌、肺鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低；同時(shí)發(fā)現(xiàn)USP4 參與NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控，而USP4 的穩(wěn)定敲低可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11-12]。

本研究利用生物信息學(xué)工具分析顯示，USP4 在KIRC 組織中的mRNA 及蛋白表達(dá)水平均明顯低于癌旁正常腎臟組織；且KIRC 組織中USP4 mRNA 表達(dá)水平與患者T 分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)、總生存率、疾病特異性生存率、無進(jìn)展生存率均有關(guān)，與性別、年齡、N 分期、M 分期均無關(guān)。可見，USP4 高表達(dá)患者能取得更好的生存獲益。因此，筆者推測(cè)USP4 可能是預(yù)測(cè)KIRC 發(fā)生、發(fā)展的生物標(biāo)志物。為了驗(yàn)證這一猜想，本研究利用細(xì)胞模型作了初步探索，結(jié)果顯示USP4 蛋白在Caki-1、OSRC-2 細(xì)胞中顯著過表達(dá)，而過表達(dá)USP4 會(huì)明顯降低Caki-1、OSRC-2 細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力，敲低USP4 會(huì)明顯提高Caki-1 細(xì)胞克隆形成能力。筆者推測(cè)去泛素化酶抑癌作用相關(guān)的機(jī)制可能與其底物蛋白功能有關(guān)，由于底物分子調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，包括p53、NF-κB、Wnt、轉(zhuǎn)化生長因子-β、組蛋白表觀遺傳修飾等[13]，但需要進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，本研究初步證實(shí)USP4 在KIRC 細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌作用，為KIRC 的臨床診治治提供新的治療靶點(diǎn)。