丁慧琳 翟雅鑫 薛麗芳 楊春 王建明 郝曉娟

關(guān)鍵詞：山藥褐腐??；病原菌鑒定；腐皮鐮孢菌；山西省

山藥（Dioscoreaopposita）原名薯蕷，又名淮山、懷山藥、淮山藥、山薯等[1]，屬薯蕷科薯蕷屬[2]。山藥塊莖中富含多種蛋白質(zhì)、維生素、游離氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[3]，具有補脾健胃、降低血壓血糖、抗癌、延緩衰老等功效[4]，是食藥兩用的蔬菜，具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值。

我國山藥栽培歷史悠久，栽培范圍非常廣泛，形成了廣西、江蘇、福建、河南等山藥種植區(qū)[5]。由于市場上山藥需求量的增大和山藥價格的不斷走高，山藥種植面積逐年增加，加上單一連作的栽培模式，山藥病害已成為影響山藥產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素之一[6]。在山藥栽培中已報道的病害主要有Pratylenchuscoffeae引起的根腐線蟲病、馬鈴薯Y病毒引起的病毒病、Colletotrichumgloeosporioides引起的炭疽病、Cylindorsporiumdioscoerae引起的褐斑病、Rhizoctoniasolani引起的立枯病、Fusariumoxysporum引起的枯萎病以及由Fusariumsolani等引起的根腐病等[7-12]。

近年來，在山西省山藥產(chǎn)區(qū)以上主要病害都有發(fā)生，特別是炭疽病、褐斑病、褐腐病、根腐病、線蟲病等發(fā)生較為嚴重，年發(fā)生率在20%以上[13]，給生產(chǎn)帶來較大的經(jīng)濟損失。其中，山藥褐腐病發(fā)生嚴重且對引起該病病原菌的報道不一，晏衛(wèi)紅等[14]研究表明，造成淮山褐腐病的病原菌為Penicilliumsclerotigenum；陳紅巖等[15]研究表明，山藥褐腐病病原菌為腐皮鐮孢菌（Fusariumsolani）；孫華等[16]研究認為，山藥褐腐病由腐皮鐮孢菌和尖鐮孢菌（Fusariumoxysporum）引起。這表明不同地區(qū)的山藥褐腐病病原菌可能由于地理環(huán)境、氣候特征以及栽培品種不同而有所不同，因此，對病原菌的鑒定十分關(guān)鍵。關(guān)于引起山西省山藥褐腐病的病原尚未見相關(guān)報道。

為明確引起山西省山藥褐腐病的病原菌種類，2019—2020年本研究對采集的山藥病樣進行病原菌分離鑒定，旨在為深入開展該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律、抗病育種等研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2019年在山西省鄉(xiāng)寧縣山藥種植區(qū)采集發(fā)病癥狀典型的山藥地下塊莖。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000mL。

1.2 試劑和儀器

真菌DNA提取試劑盒（Biospin）；超凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），高壓蒸汽滅菌鍋（ZEALWAY致微儀器），霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），菌種保藏箱（青島海爾股份有限公司），凝膠成像儀（Bio-Rad），PCR儀（Bio-Rad），水平電泳槽系統(tǒng)（Bio-Rad），光學(xué)顯微鏡（Olympus）。

1.3 病原菌分離

采用常規(guī)組織分離法[17]進行病原菌的分離：用滅菌刀片于病健交界處切取5mm×5mm的組織，75%乙醇中浸泡30s，無菌水沖洗后，用無菌濾紙吸收組織表面多余的水分，放置于PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)3～4d后在顯微鏡下觀察病原菌菌株產(chǎn)孢情況。采用單孢分離法[18]獲得純培養(yǎng)物，將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面試管中培養(yǎng)3d，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化后的病原菌接種于PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)7d，觀察并記錄菌落形態(tài)特征，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算菌絲平均生長速率，并對病原菌進行顯微觀察。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA，以ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATG-3′）和EF-1H（5′-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC）/EF-2T（5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′）為引物分別擴增菌株ITS和EF-1α基因序列。PCR擴增體系（25μL）：DNA模板、上下游引物各1μL，2×TaqPCRMasterMix12.5μL，以ddH2O補足至25μL。PCR反應(yīng)程序分別為：（1）ITS引物：94℃高溫預(yù)變性3min；94℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。（2）EF-1α引物：退火溫度為50.2℃，其余和ITS引物反應(yīng)程序一致。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后送至上海生工生物工程有限公司測序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中對測序結(jié)果進行BLAST序列比對和同源性分析，利用MEGA7.0軟件進行多重比較，SequenceMatrix1.7.8軟件將各基因串聯(lián)成數(shù)據(jù)集并用MEGA7.0軟件以鄰接法（Neighbors-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)1000次。

1.6 致病性測定

采用菌餅接種法[17]進行致病性測定。從分離得到的5株形態(tài)學(xué)特征一致的菌株中挑選代表菌株XNSY-3，于PDA平板上培養(yǎng)7d，用無菌打孔器（直徑為6mm）在菌落邊緣打取菌餅后，接種于已消毒的健康山藥地下塊莖上，置于含有濕潤棉花的無菌培養(yǎng)皿中，接種無菌PDA塊的山藥地下塊莖作為對照，每處理5個地下塊莖，設(shè)3次重復(fù)，25℃黑暗保濕培養(yǎng)，接種18d后觀察并記錄發(fā)病癥狀。對發(fā)病地下塊莖進行病原菌的再分離，觀察再分離菌株與接種菌株是否相同，完成柯赫氏法則驗證，方法同1.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

山藥褐腐病主要為害山藥的地下塊莖，發(fā)病時山藥表面會產(chǎn)生不規(guī)則形的褐色病斑（圖1-A），病斑稍凹陷，切開后可以看見病部變褐腐爛（圖1-B）。

2.2 分離純化結(jié)果

通過組織分離法從山藥地下塊莖中分離純化出5株形態(tài)學(xué)特征一致的菌株，挑選XNSY-3作為代表菌株，對其進行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定和致病性測定。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

代表菌株XNSY-3在PDA平板上菌落呈圓形，初為白色，后呈淡粉色，背面中間黃色，邊緣粉色，氣生菌絲呈棉絮狀（圖2-A），菌絲平均生長速率為1.08cm/d；大型分生孢子呈馬特形，稍彎曲，兩端圓鈍（圖2-B），2～3隔，大小為（14.11～27.21）μm×（3.03～7.27）μm；小型分生孢子橢圓形、卵形或腎形（圖2-C），0～1分隔，多為無隔，大小為（7.08～17.59）μm×（3.03～6.47）μm；厚垣孢子圓形或卵圓形，可由菌絲頂端或中間產(chǎn)生，直徑3.81～11.85μm（圖2-D）。

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

從圖3可以看出，以代表菌株XNSY-3菌株基因組DNA為模板，使用ITS、EF-1α基因引物對病原菌DNA進行PCR擴增，分別得到大小為539、721bp的DNA片段。根據(jù)BLAST比對和同源性分析，XNSY-3菌株ITS序列與FusariumsolaniLrBF21菌株（MG543739）ITS序列同源性為100%，XNSY-3菌株EF-1α序列與Fusariumsolanihc0001菌株（KP143718）EF-1α序列同源性為100%，用MEAG7.0軟件構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，XNSY-3與Fusariumsolani聚為一支。結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定XNSY-3為Fusariumsolani。

2.5 致病性測定結(jié)果

山藥地下塊莖接種菌株XNSY-318d后，病部呈現(xiàn)不規(guī)則形褐色病斑，內(nèi)部腐爛（圖4-A），與田間發(fā)病癥狀一致，空白對照不發(fā)?。▓D4-B）。對接種發(fā)病的地下塊莖進行再分離，重新分離到的菌株與接種菌株相同。

3 結(jié)論與討論

鐮孢菌屬（Fusariumsp.）為真菌中較大的屬，無性世代屬于無性真菌類，有性時期屬于子囊菌門，廣泛分布于自然界[19]。鐮孢菌形態(tài)呈多型性，分生孢子有大、小2種形態(tài)[20]。由于鐮孢菌屬真菌在生長過程中形態(tài)變異較大，所以，單純依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定存在一定的困難[21-22]。

國內(nèi)外主要是以形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)對植物病原菌種類進行鑒定，其中利用多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析法能更加全面地反映物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[23]。本研究通過ITS聯(lián)合EF-1α基因序列分析的方法對山藥褐腐病病原菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)分離得到的菌株與鐮孢菌屬中腐皮鐮孢菌高度同源，結(jié)合其形態(tài)特征和致病性測定結(jié)果，將山西省山藥褐腐病的病原菌鑒定為Fusariumsolani。Fusariumsolani是鐮孢菌屬中一種重要的植物病原菌，在世界各地均有分布，侵染能力強且寄主廣泛，能侵染多種植物，引起根腐病、莖基腐病等[24-27]。該菌具有土壤習(xí)居特性，能夠在土壤中生活并積累，常造成巨大經(jīng)濟損失[28]。除引起山藥褐腐病外，腐皮鐮孢菌侵染山藥還能引起根腐病[29-30]，2種病害在癥狀上具有差異。根腐病發(fā)病時主要表現(xiàn)為根部皮層變褐腐爛、脫落，維管束呈褐色，地上部葉色變黃、干枯直至整株枯死[31]。引起褐腐病時主要造成地下塊莖腐爛，地上部無明顯癥狀。也有研究表明，山藥褐腐病發(fā)病初期葉片黃褐色，葉邊干枯，收獲時地下塊莖病部呈現(xiàn)褐色病斑，嚴重時腐爛[32]。本研究中山藥褐腐病發(fā)病時地下塊莖變褐腐爛，地上部無發(fā)病癥狀，與陳紅巖等[15]的報道一致。在今后的研究中，還應(yīng)針對山西省主要山藥產(chǎn)區(qū)的褐腐病，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法結(jié)合分子鑒定，進一步明確山藥褐腐病病原菌的種群結(jié)構(gòu)。

山藥是山西省特色農(nóng)產(chǎn)品之一，近年來由于山藥品種退化不抗病、土壤帶菌等因素導(dǎo)致土傳病害不斷加重，限制了山西省山藥的生產(chǎn)，給山藥產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失[13]。目前，對于山藥病害的防治主要采用農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治方法[33-36]，在山藥優(yōu)良品種選育及良種繁育方面基礎(chǔ)薄弱[37]。本研究明確了引起山西省山藥褐腐病的病原菌種類，為進行該病害抗性品種的選育提供了一定的理論依據(jù)。