趙巖 祝文慧 趙曉軍 殷輝 任璐 周建波

關(guān)鍵詞：辣椒疫霉菌；最佳誘孢條件；抹傷處理；孢子囊產(chǎn)生；孢子囊釋放

辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsicaLeonian）侵染辣椒植株引起的辣椒疫病是世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的一種毀滅性土傳病害，是辣椒三大主要病害之一。該病害在辣椒整個(gè)生育期均會(huì)發(fā)生，在成株期危害最大[1]。該病害潛伏期短，蔓延速度快，傳播范圍廣，常造成辣椒嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收[2-4]。辣椒疫病防治一直是辣椒生產(chǎn)的關(guān)鍵問題和難點(diǎn)問題[5]。辣椒疫霉菌屬于霜霉目（Peronosporales）腐霉科（Pythiaceae）疫霉屬（Phytophthora）[6-7]。無性階段孢子囊是辣椒疫病田間再侵染的重要來源[8-9]，也是該病害相關(guān)研究的主要病原接種體[10]。獲得足量辣椒疫霉菌孢子囊，能夠?yàn)槔苯芬呙咕飳W(xué)特性、遺傳分析及致病性等研究提供根本保證[11-12]。辣椒疫霉菌產(chǎn)生孢子囊的條件較為苛刻，在常規(guī)培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生孢子囊或產(chǎn)孢子囊量較少[13]。目前，已有大量關(guān)于辣椒疫霉菌、致病疫霉菌等卵菌致病菌誘導(dǎo)孢子囊產(chǎn)生的培養(yǎng)環(huán)境條件、培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)菌體處理方法等方面的相關(guān)報(bào)道[14-17]，研究主要關(guān)注了不同誘孢方法對(duì)靶標(biāo)菌最大產(chǎn)孢量的影響，但是不同誘孢方法對(duì)孢子囊消長動(dòng)態(tài)影響的相關(guān)報(bào)道較少。

本研究將優(yōu)化培養(yǎng)基和簡化誘孢操作相結(jié)合，研究不同誘孢條件下辣椒疫霉菌孢子囊產(chǎn)生和釋放變化動(dòng)態(tài)，旨在明確其對(duì)辣椒疫霉菌孢子囊產(chǎn)生和釋放的影響，為辣椒疫病的相關(guān)研究提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 辣椒疫霉菌BY1（Phytophthoracapsica），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害研究室分離、純化、鑒定和保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、pH值7.0），OA培養(yǎng)基（燕麥30g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、pH值7.0），CA培養(yǎng)基（胡蘿卜200g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、pH值7.0），V8培養(yǎng)基（V8汁100mL、碳酸鈣0.02g、蒸餾水1000mL、pH值7.0），均在121℃條件下高壓蒸汽滅菌20min[18]。

辣椒組織培養(yǎng)基（簡稱PA培養(yǎng)基）的配置方法為：取方椒果肉榨汁，過濾稱取方椒汁200g，加入瓊脂20g，用蒸餾水定容至1000mL，并將pH值調(diào)至7.0，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)BY1菌落生長的影響 將活化后的供試菌株BY1沿菌落邊緣打取5mm菌餅接種于供試培養(yǎng)基平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用十字交叉法測量菌落的最大擴(kuò)展直徑[19-20]。每個(gè)處理3次重復(fù)。

生長速度［20-21］=（菌落直徑-5）/培養(yǎng)時(shí)間（1） 1.2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)BY1產(chǎn)生和釋放孢子囊的影響 將活化后的供試菌株BY1沿菌落邊緣打取5mm菌餅分別接種于5種供試培養(yǎng)基平板中央，每種培養(yǎng)基接種60個(gè)皿，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其菌落長滿培養(yǎng)皿時(shí)，每間隔2d對(duì)3個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行一次鏡檢觀察，并記錄孢子囊總數(shù)和已完全釋放了游動(dòng)孢子的空孢子囊數(shù)目。每個(gè)處理3次重復(fù)。

孢子囊計(jì)數(shù)方法為：向培養(yǎng)皿中加入10mL無菌水，用消毒滅菌的毛刷刷洗菌絲表面，將孢子囊菌懸液傾倒至體積為10mL的試管內(nèi)，搖勻吸取10μL孢子囊菌懸液于顯微鏡10倍視野下觀察，統(tǒng)計(jì)孢子囊數(shù)量，然后根據(jù)孢子囊菌懸液的體積計(jì)算每毫升含有的孢子囊個(gè)數(shù)[22]。

1.2.3 抹傷處理對(duì)BY1產(chǎn)生和釋放孢子囊的影響 將活化后的供試菌株BY1沿菌落邊緣打取5mm菌餅分別接種于5種供試培養(yǎng)基平板中央，每種培養(yǎng)基接種60個(gè)皿，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其菌落長滿培養(yǎng)皿時(shí)，用滅菌涂布器進(jìn)行菌絲抹傷處理，使所有菌絲貼于培養(yǎng)基平板上，繼續(xù)置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每間隔2d對(duì)3個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行一次鏡檢觀察，并記錄孢子囊總數(shù)和已完全釋放了游動(dòng)孢子的空孢子囊數(shù)目，孢子囊計(jì)數(shù)方法同1.2.2。以相同培養(yǎng)基上未抹傷處理作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用MicrosoftExcel2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析并繪制圖表；利用SPSS26.0軟件，采用Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)BY1菌落生長的影響

如圖1所示，辣椒疫霉菌BY1在各供試培養(yǎng)基上生長速度有所差異，在OA培養(yǎng)基上生長最快，滿皿時(shí)間為6d；在CA和PA培養(yǎng)基上生長速度次之，滿皿時(shí)間為7d；在PDA培養(yǎng)基上滿皿時(shí)間為8d；在V8培養(yǎng)基上生長最慢，滿皿時(shí)間為9d。辣椒疫霉菌BY1在各供試培養(yǎng)基上生長速度均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢（圖2）。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)BY1產(chǎn)生和釋放孢子囊的影響

辣椒疫霉菌BY1在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)孢子囊量的變化曲線如圖3所示。

由圖3可知，辣椒疫霉菌BY1在各供試培養(yǎng)基上孢子囊的產(chǎn)生時(shí)間、最大產(chǎn)孢量及續(xù)存期和孢子囊的釋放時(shí)間均有所差異。待辣椒疫霉菌BY1在各供試培養(yǎng)基上長滿皿后，在PA培養(yǎng)基上6d就可以觀察到有孢子囊的產(chǎn)生，18d孢子囊量達(dá)到最大值，最大產(chǎn)孢續(xù)存期為8d；第26天孢子囊開始釋放游動(dòng)孢子；在第34天孢子囊完全釋放，視野內(nèi)全部為孢子囊空殼。在CA培養(yǎng)基上12d開始產(chǎn)生孢子囊，26d達(dá)到最大值，最大產(chǎn)孢續(xù)存期為6d；第32天孢子囊開始釋放游動(dòng)孢子；第38天完全釋放。在V8培養(yǎng)基上18d開始產(chǎn)生孢子囊；第28天孢子囊產(chǎn)生量趨于穩(wěn)定，最大產(chǎn)孢續(xù)存期為8d；第36天孢子囊開始釋放游動(dòng)孢子；第44天完全釋放。在PDA和OA培養(yǎng)基上未觀察到孢子囊的產(chǎn)生。

由圖4可知，在5種供試培養(yǎng)基上，辣椒疫霉菌BY1在PA培養(yǎng)基上的最大產(chǎn)孢量顯著高于其他培養(yǎng)基（P<0.05），最大產(chǎn)孢量為7.238萬個(gè)/mL；CA培養(yǎng)基次之，最大產(chǎn)孢量為3.712萬個(gè)/mL；V8培養(yǎng)基最大產(chǎn)孢量為0.523萬個(gè)/mL。

2.3 抹傷處理對(duì)BY1產(chǎn)生和釋放孢子囊的影響

從圖5可以看出，辣椒疫霉菌BY1在各供試培養(yǎng)基上經(jīng)過抹傷處理后，孢子囊的產(chǎn)生時(shí)間、最大產(chǎn)孢量及其續(xù)存期和孢子囊的釋放時(shí)間均發(fā)生顯著變化。在PA培養(yǎng)基上，抹傷處理后比未處理的培養(yǎng)基孢子囊產(chǎn)生時(shí)間提前了2d，最大產(chǎn)孢續(xù)存期增加了2d，孢子囊的釋放時(shí)間增加4d；在CA培養(yǎng)基上，抹傷處理后培養(yǎng)基上的孢子囊產(chǎn)生時(shí)間提前了2d，最大產(chǎn)孢續(xù)存期增加了2d，孢子囊釋放期延長了2d；在V8培養(yǎng)基上，抹傷處理后培養(yǎng)基的產(chǎn)孢時(shí)間比未處理時(shí)提前了4d，但是最大產(chǎn)孢續(xù)存期不變，孢子囊釋放期縮短了2d；原本不產(chǎn)生孢子囊的OA培養(yǎng)基，抹傷處理后，在第24天觀察到孢子囊的產(chǎn)生，第28天達(dá)到最大產(chǎn)孢量且續(xù)存期為4d，第34天孢子囊開始釋放游動(dòng)孢子，第40天孢子囊完全釋放，視野內(nèi)全部為孢子囊空殼；在PDA培養(yǎng)基上仍未觀察到孢子囊的產(chǎn)生。

從圖6可以看出，在5種供試培養(yǎng)基上，長滿皿經(jīng)過抹傷處理后，辣椒疫霉菌BY1在PA、CA和V8等3種培養(yǎng)基上的孢子囊產(chǎn)量顯著高于對(duì)照（P<0.05）。其中，PA培養(yǎng)基抹傷處理后產(chǎn)生的孢子囊量顯著高于其他誘孢處理（P<0.05），最大孢子囊產(chǎn)量為8.412萬個(gè)/mL；在OA培養(yǎng)基上經(jīng)過抹傷處理也開始產(chǎn)生孢子囊，但最大孢子囊產(chǎn)量僅有0.299萬個(gè)/mL；PDA培養(yǎng)基上仍未產(chǎn)生孢子囊。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)主要研究了不同培養(yǎng)基及抹傷處理對(duì)辣椒疫霉菌BY1孢子囊的產(chǎn)生和釋放的影響，并將整個(gè)過程劃分為菌落生長期（接種到菌落滿皿）、孢子囊產(chǎn)生前期（菌落滿皿到孢子囊開始產(chǎn)生）、孢子囊產(chǎn)生期（孢子囊開始產(chǎn)生到產(chǎn)孢量達(dá)到最大）、最大產(chǎn)孢續(xù)存期（保持最大產(chǎn)孢量的時(shí)期）、孢子囊釋放期（孢子囊開始釋放到完全釋放）5個(gè)階段。通過對(duì)各階段動(dòng)態(tài)變化過程的研究，可詳細(xì)探究孢子囊發(fā)育周期及其影響因素，不再局限于用某一時(shí)間段或某一時(shí)刻的孢子囊數(shù)來衡量不同誘孢方法的產(chǎn)孢能力，如張榮等[23]將辣椒疫霉菌接種于5種培養(yǎng)基上，先置于26℃下暗培養(yǎng)3d，再連續(xù)光照培養(yǎng)6d后，隨機(jī)取3點(diǎn)于10倍視野下鏡檢發(fā)現(xiàn)，在PSA和大豆瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生的孢子囊較多，分別為13.88、13.77個(gè)/視野；許亞池等[24]通過不同配比V8培養(yǎng)基、不同黑暗培養(yǎng)時(shí)間及無菌水處理，培養(yǎng)10d后于10倍顯微鏡下觀察，探究對(duì)辣椒疫霉菌的產(chǎn)孢影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5%V8培養(yǎng)基上，黑暗處理5d后加入適量無菌水，孢子囊最大產(chǎn)量為140個(gè)/視野。研究結(jié)果為以孢子囊為接菌體的相關(guān)試驗(yàn)提供了技術(shù)支撐，也為辣椒疫霉菌的生物學(xué)特性、遺傳分析及致病性等與孢子囊相關(guān)的研究提供了理論支撐。

辣椒疫霉菌BY1在OA培養(yǎng)基上生長最快，接種后6d可滿皿，但未觀察到孢子囊產(chǎn)生，抹傷處理后滿皿24d開始產(chǎn)孢，但產(chǎn)孢量較小；在PA培養(yǎng)基上接種后7d滿皿，滿皿后6d開始產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量在5種供試培養(yǎng)基中最高。說明辣椒疫霉菌是否產(chǎn)生孢子囊、產(chǎn)孢開始時(shí)間及產(chǎn)孢量與菌落生長期長短無關(guān)，主要取決于孢子囊產(chǎn)生前期的長短，即菌絲體產(chǎn)生孢囊梗后再產(chǎn)生孢子囊的快慢。PA培養(yǎng)基大幅縮短了辣椒疫霉菌孢子囊產(chǎn)生前期的時(shí)間，促進(jìn)了菌體產(chǎn)生孢子囊，提高了產(chǎn)孢能力。抹傷處理縮短了孢子囊產(chǎn)生前期和孢子產(chǎn)生期的時(shí)間，促進(jìn)疫霉菌提前進(jìn)入最大產(chǎn)孢階段，同時(shí)也延長了最大產(chǎn)孢延續(xù)期和孢子釋放期的時(shí)間。

陳方新等[25]研制了幾種誘導(dǎo)苧麻疫霉（PhytophthoraboehmeriaeSawada）產(chǎn)生游動(dòng)孢子囊的蔬菜汁混合培養(yǎng)液，其中，番茄與黃瓜按體積比1∶2的配比得到的培養(yǎng)液誘孢效果最佳，最大產(chǎn)孢量為0.314萬個(gè)/mL；王拱辰等[26]從30種植物組織培養(yǎng)基中篩選出了3種能夠促進(jìn)鐮孢屬（Fusarium）李瑟組產(chǎn)生大孢子、小孢子和產(chǎn)孢細(xì)胞。這些研究證明了植物組織或植物組織培養(yǎng)基可誘導(dǎo)病原菌無性孢子產(chǎn)生。蘭成忠等[27]通過果實(shí)創(chuàng)傷接種法將辣椒疫霉菌接種于黃瓜果實(shí)上，于28℃、24h光照培養(yǎng)4d后，黃瓜接種部位病斑迅速擴(kuò)展，表面長出大量氣生菌絲并產(chǎn)生大量的孢子囊，其產(chǎn)孢量為1.35萬個(gè)/cm2，為辣椒疫霉菌寄主植物的植物體或組織培養(yǎng)液可以誘導(dǎo)孢子產(chǎn)生提供了理論依據(jù)。所以，本試驗(yàn)選取了辣椒組織培養(yǎng)基（PA）誘導(dǎo)辣椒疫霉菌孢子囊的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)，PA培養(yǎng)基結(jié)合抹傷處理在接菌后11d開始產(chǎn)孢，21d達(dá)到最大產(chǎn)孢期，最大產(chǎn)孢持續(xù)期10d，最大產(chǎn)孢量可達(dá)8.412萬個(gè)/mL，孢子囊釋放期為12d，誘導(dǎo)孢子囊產(chǎn)生和延緩孢子囊釋放作用均高于其他處理，且相比水淹法[23]等疫霉菌誘孢方法操作簡單，可用于辣椒疫霉菌孢子囊的誘集。