石源睿 董海濤 常璐 呂運(yùn)韜 賈小云 張紅梅 唐銳敏

關(guān)鍵詞：八氫番茄紅素脫氫酶；ζ-胡蘿卜素脫氫酶；類胡蘿卜素；馬鈴薯；基因表達(dá)

馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）是僅次于水稻、小麥和玉米的世界第四大糧食作物，最早在南美洲安第斯地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，在秘魯被馴化，是一種與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展密切相關(guān)的優(yōu)勢(shì)作物[1]。其與谷類作物單位面積的可食用干物質(zhì)產(chǎn)量幾乎相同，是工業(yè)和食品加工原料的重要來源[2]。其含有豐富的類胡蘿卜素，是一類高度不飽和的萜類化合物[3]，作為植物光合作用中光吸收的輔助色素，是植物光合膜的重要組成部分[4-5]。類胡蘿卜素可與多種自由基發(fā)生拮抗脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)[6-8]，具有延緩衰老的效果；同時(shí)還能有效防止心血管、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化以及血栓性等疾病的發(fā)生[9]。此外，類胡蘿卜素進(jìn)入人體被吸收后會(huì)轉(zhuǎn)化成維生素A，以達(dá)到保護(hù)視力的效果[10]。

在植物體內(nèi)，異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）經(jīng)過一系列的氧化還原反應(yīng)合成β-類胡蘿卜素[11]?；閰f(xié)同作用的八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）是類胡蘿卜素合成途徑中的限速酶[12]。無色的八氫番茄紅素在PDS和ZDS的脫氫作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榉凵姆鸭t素，進(jìn)而生成β-類胡蘿卜素[13]，共同參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中類胡蘿卜素的代謝途徑。目前，已有許多研究表明，PDS和ZDS基因?qū)儆谕椿?，在系統(tǒng)中可歸為一類[14]?；襞嗟萚15]、TRAVELLA等[16]研究表明，類胡蘿卜在植物體內(nèi)主要存在于葉綠體及許多花和植物的有色體中，與植物的光合作用及葉、花和果實(shí)的顏色形成密不可分。當(dāng)植株內(nèi)的PDS被沉默時(shí)，其葉片會(huì)發(fā)生白化，導(dǎo)致其色素含量改變，從而使其光合作用受阻。吳建設(shè)等[17]、陳段芬等[18]分別對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的觀賞性向日葵和中國水仙內(nèi)的PDS表達(dá)進(jìn)行研究，證實(shí)了PDS表達(dá)量的增加與花色的加深有關(guān)。在三汁蜜柚果實(shí)成熟過程中，隨著果實(shí)顏色的加深，其汁胞、囊衣和海綿層中CmZDS的表達(dá)量呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢(shì)[19]，在芒果中也有類似發(fā)現(xiàn)[20]。分析成熟時(shí)期番木瓜果實(shí)、葉片和花中PDS和ZDS基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，富含類胡蘿卜素的果實(shí)中的表達(dá)量要顯著高于葉片和花[21-23]。彩色馬鈴薯塊莖中富含類胡蘿卜素和花青素等次生代謝物，使其成為開發(fā)功能食品的理想資源[24]。

本研究從黃心馬鈴薯晉薯16號(hào)品種中分別克隆PDS和ZDS基因，利用生物信息學(xué)工具對(duì)這2個(gè)基因及其所編碼的蛋白序列進(jìn)行分析，并對(duì)二者在不同組織內(nèi)的表達(dá)模式進(jìn)行定量檢測(cè)，旨在解析馬鈴薯PDS和ZDS在類胡蘿卜素合成途徑中的調(diào)控作用，為后續(xù)馬鈴薯品種的創(chuàng)新及培育奠定一定分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃心馬鈴薯為晉薯16號(hào)（Jinshu16），脫毒苗由山西省薯類脫毒中心提供；紅心馬鈴薯紅玫瑰2號(hào)（RedRose2）和紫心馬鈴薯為希森8號(hào)（Xisen8），脫毒苗均由山東省樂陵市希森薯業(yè)有限公司提供。將3個(gè)品種4周齡的組織培養(yǎng)苗轉(zhuǎn)移至Hogellan溶液中煉苗，7d后移至基質(zhì)中生長(zhǎng)，培養(yǎng)于（22±1）℃、14h光照/10h黑暗條件的溫室中生長(zhǎng)，100d后收獲新鮮塊莖。轉(zhuǎn)化所用菌株為大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體是PMD19-TVector。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

取每個(gè)品種種植100d的馬鈴薯根、莖、葉和塊莖各0.1g，用液氮快速冷凍后進(jìn)行研磨。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用RNA提取試劑盒（華越洋，北京）對(duì)不同品種的馬鈴薯各組織總RNA進(jìn)行提取。后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取RNA的完整性和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)TaKara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（TaKara，大連）對(duì)所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.3 馬鈴薯StPDS和StZDS基因克隆

根據(jù)NCBI網(wǎng)站中查到的馬鈴薯StPDS和StZDS預(yù)測(cè)序列（XM_015306724.1，XM_015308927.1）設(shè)計(jì)克隆引物（表1）。

以上述反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板分別對(duì)StPDS和StZDS進(jìn)行PCR克?。ㄟ~維生物，武漢），反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃下變性30s，48℃（StPDS）/43.6℃（StZDS）退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸2min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠回收試劑盒（AxygenScientificInc.，Unioncity，USA）將目的片段回收，并與PMD19-T相連，獲得重組質(zhì)粒PMD19-T-StPDS和PMD19-T-StZDS。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，并將其涂布于含有氨芐霉素的LB平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)15～17h，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，將陽性克隆所提取的質(zhì)粒（優(yōu)逸蘭迪，蘇州）送上海生工生物公司測(cè)序，陽性克隆的菌液和所提質(zhì)粒凍于-80℃保存。

1.4 馬鈴薯StPDS和StZDS基因的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析軟件如表2所示，分別對(duì)StPDS和StZDS轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000bp的基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)其編碼蛋白的親疏水性、理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及互作蛋白進(jìn)行分析。利用馬鈴薯StPDS和StZDS的蛋白序列，通過BlastP在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索其他植物PDS和ZDS的蛋白序列，使用MEGA7.0軟件，構(gòu)建Neiber-Joing（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap分析重復(fù)數(shù)為1000。

1.5 馬鈴薯塊莖中類胡蘿卜素含量的測(cè)定

取適量的馬鈴薯塊莖用液氮快速冷凍后研磨成粉狀，稱取約0.15g塊莖樣品置于50mL離心管中，加入15mL丙酮，于4℃黑暗處放置1～2h，直至粉末為灰白色，4000r/min離心10min，吸取上清液測(cè)定其在454nm處的吸光值。

1.6 馬鈴薯StPDS和StZDS基因的表達(dá)模式分析

根據(jù)馬鈴薯StPDS和StZDS基因序列設(shè)計(jì)特異性定量引物（表1），以晉薯16號(hào)、紅玫瑰2號(hào)和希森8號(hào)的根、莖、葉和薯塊的cDNA為模板，EF-1α為內(nèi)參，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書（Takara，大連），通過BIO-RADCFX96熒光定量?jī)x對(duì)馬鈴薯StPDS和StZDS基因進(jìn)行不同品種不同組織的表達(dá)模式分析。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。根據(jù)2-ΔΔCt法分析計(jì)算結(jié)果，并使用SPSSStatisticsv22對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StPDS和StZDS基因克隆

提取晉薯16號(hào)塊莖中RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以StPDSPF/PR和StZDS-PF/PR為克隆引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1-A所示，在2條泳道上各得到了1條特異性條帶，將這2條目的片段割膠回收、連接PMD19-T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行菌落PCR，檢測(cè)到目的片段（圖1-B、C）。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明，StPDS和StZDS的cDNA長(zhǎng)度分別為1752、1767bp，與NCBI網(wǎng)站中預(yù)測(cè)的馬鈴薯PDS和ZDS基因進(jìn)行比對(duì)，一致度分別為99.40%和99.35%（圖1-D、E）。

2.2 馬鈴薯StPDS和StZDS的生物信息學(xué)分析

2.2.1 馬鈴薯StPDS和StZDS理化性質(zhì)分析 如圖2、3所示，StPDS基因編碼583個(gè)氨基酸，蛋白的分子質(zhì)量為64.97ku，理論等電點(diǎn)為6.41；StZDS基因編碼588個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為64.73ku，理論等電點(diǎn)為8.51，二者均為無跨膜結(jié)構(gòu)的親水不穩(wěn)定蛋白。

2.2.2 馬鈴薯StPDS和StZDS蛋白結(jié)構(gòu)分析和信號(hào)肽預(yù)測(cè) 如圖4所示，在馬鈴薯StPDS的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例較高，分別為38.25%和41.34%；β-片層和β-轉(zhuǎn)角所占比例較少，分別為16.64%和3.77%；其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，其蛋白質(zhì)可能具有5個(gè)較為保守的結(jié)構(gòu)域。而StZDS二級(jí)結(jié)構(gòu)由40.99%的α-螺旋、16.5%的β-片層、3.57%的β-轉(zhuǎn)角和38.95%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成；其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，其蛋白質(zhì)可能具有5個(gè)較為保守的結(jié)構(gòu)域。此外，2個(gè)蛋白均無信號(hào)肽，為非分泌蛋白，這一結(jié)果也與其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的功能相適應(yīng)。

2.2.3 馬鈴薯StPDS和StZDS的啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè) 利用Menu網(wǎng)站對(duì)StPDS及StZDS的啟動(dòng)子（取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp）進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5所示，二者均具有較多的光響應(yīng)元件（如TCCCmotif、TCT-motif、Box4、G-box等）和逆境有關(guān)的調(diào)控元件（如響應(yīng)低溫脅迫（LTR）和干旱脅迫（MBS））。其中，StPDS還具有抗氧化反應(yīng)的調(diào)控元件（ARE）；對(duì)StPDS及StZDS的啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行分析，推測(cè)馬鈴薯PDS及ZDS基因的表達(dá)可能受到光調(diào)節(jié)及激素和逆境的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)。

2.2.4 馬鈴薯StPDS和StZDS的系統(tǒng)進(jìn)化分析在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載二穗短柄草（Brachypo?diumdistachyon）（XP_003558653.1）、玉米（Zeamays）（NP_001338939.1）、木薯（Manihotesculenta）（XP_021613095.1）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）（NP_193157.1）、向日葵（Helianthusannuus）（XP_022013639.1）、煙草（Nicotianatabacum）（XP_019244024.1）、辣椒（Capsicumannuum）（XP_016562403.2）、野生番茄（Solanumpennellii）（XP_027771295.1）、番茄（Solanumlycopersicum）（NP_001234095.1）共9個(gè)物種PDS的同源序列，以及番木瓜（CaricapapayaLinn）（XP_021891252.1）、小球藻（Chlorellavariabilis）（XP_005843062.1）、木薯（XP_043815084.1）、擬南芥（NP_001319473.1）、玉米（NP_001105609.2）、向日葵（XP_022010060.1）、煙草（NP_001312062.1）、辣椒（NP_001311497.1）、番茄（NP_001234383.2）共9個(gè)物種的ZDS蛋白質(zhì)氨基酸序列。利用MEGA-X對(duì)上述序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6），馬鈴薯PDS及ZDS均與同為茄科植物的番茄和野生番茄的同源關(guān)系最近，推測(cè)它們可能在馬鈴薯內(nèi)發(fā)揮著與番茄PDS、ZDS相近的功能。

2.3 馬鈴薯StPDS蛋白互作預(yù)測(cè)

使用String軟件（https：//cn.string-db.org/）對(duì)馬鈴薯StPDS（Phytoenedehydrogenase）互作蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖7），StPDS與StZDS（Zeta-Carotenedesaturase）、StLYCe（Lycopeneepsiloncyclase）等酶蛋白存在互作關(guān)系。

2.4 馬鈴薯塊莖中類胡蘿卜素含量測(cè)定及StPDS和StZDS表達(dá)模式分析

對(duì)3個(gè)不同品種馬鈴薯葉片及塊莖中類胡蘿卜素的含量進(jìn)行檢測(cè)并分析，結(jié)果如圖8所示，類胡蘿卜素在紅玫瑰2號(hào)葉片和塊莖中含量較高，顯著高于晉薯16號(hào)。

進(jìn)一步利用qRT-PCR對(duì)3種不同顏色馬鈴薯的葉片及薯塊中StPDS和StZDS基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)基因均在紅心馬鈴薯紅玫瑰2號(hào)中表達(dá)量最高，顯著高于另外2個(gè)品種（P<0.05）；且在葉片中的表達(dá)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于塊莖。同一組織中，類胡蘿卜素含量和2個(gè)基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)一致，均表現(xiàn)為紅玫瑰2號(hào)最高，希森8號(hào)次之，晉薯16號(hào)最低，說明StPDS和StZDS可能正向調(diào)控類胡蘿卜素的積累；而在同一品種中，如紅玫瑰2號(hào)，塊莖中類胡蘿卜素含量高于葉片，但是2個(gè)基因的表達(dá)量卻表現(xiàn)為葉片高于塊莖，這一現(xiàn)象說明StPDS和StZDS可能參與葉片的某些生理活動(dòng)。

3 結(jié)論與討論

類胡蘿卜素是存在于許多花、果實(shí)、葉片中的天然色素。PDS和ZDS在植物體類胡蘿卜素合成通路上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，有研究表明，這2種脫氫酶是類胡蘿卜素合成通路上的重要分支點(diǎn)[25-27]，其表達(dá)受到抑制時(shí)會(huì)影響植物體內(nèi)八氫番茄紅素的積累，進(jìn)而影響花、葉片和果實(shí)中類胡蘿卜素含量，不僅會(huì)造成植物體種皮、果肉顏色的變化，而且還會(huì)影響植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，目前已從草莓[28]、番木瓜[22-23]、水仙[20]、穿心蓮[29]、甜瓜[30]等物種體內(nèi)分離得到PDS或ZDS基因。

本研究成功克隆到馬鈴薯的PDS和ZDS，其片段大小分別為1752、1767bp，分別編碼583、588個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)StPDS和StZDS進(jìn)行理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)二者均為無跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性蛋白，表明二者均不是膜蛋白，這與其在植物體內(nèi)發(fā)揮的功能相適應(yīng)。在NCBI上搜索不同物種的PDS和ZDS序列并構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，馬鈴薯StPDS和StZDS的氨基酸序列與番茄的PDS和ZDS親緣關(guān)系最近，表明馬鈴薯的PDS和ZDS可能與番茄SlPDS和SlZDS具有相似的功能和作用機(jī)制。利用String數(shù)據(jù)庫對(duì)馬鈴薯PDS進(jìn)行互作蛋白預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)StPDS蛋白與StZDS、StLYCe等酶蛋白相互作用，這一結(jié)果與KATO等[27]的研究結(jié)果一致，LCYe可以調(diào)控紅色的番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬摩?胡蘿卜素[21]，推測(cè)這些蛋白可能協(xié)同作用，共同正調(diào)控植物類胡蘿卜素的合成。

類胡蘿卜素可以吸收光作為碳同化的能源，有研究表明，PDS基因在被沉默后，植物葉片會(huì)發(fā)生白化，其光合作用受阻[16，31]。本研究對(duì)不同品種馬鈴薯的葉和塊莖內(nèi)StPDS和StZDS的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，這2個(gè)基因均在葉片中的表達(dá)量最高，這與前人的研究結(jié)果相一致[17，28]。對(duì)馬鈴薯塊莖類胡蘿卜素含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，不同顏色薯塊中類胡蘿卜素的含量有所差異，其中紅心馬鈴薯紅玫瑰2號(hào)塊莖中類胡蘿卜素的含量最高，且紅玫瑰2號(hào)中2個(gè)基因的表達(dá)量均顯著高于其他2個(gè)品種，這與其塊莖中類胡蘿卜素含量的變化趨勢(shì)相一致。對(duì)果色差異較大的3個(gè)芒果品種進(jìn)行基因表達(dá)分析后也得出類似的結(jié)果，芒果PDS和ZDS基因表達(dá)量在紅色芒果果皮中最高，在青色芒果果皮中最低[20]。

本研究通過克隆獲得StPDS和StZDS的cDNA全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)差異分析，結(jié)果表明，在同一組織中，紅玫瑰2號(hào)類胡蘿卜素的含量及StPDS和StZDS基因的表達(dá)量顯著高于希森8號(hào)和晉薯16號(hào)，推測(cè)其可能正向調(diào)控馬鈴薯塊莖中類胡蘿卜素的積累，從而使薯塊的顏色呈現(xiàn)紅色；對(duì)不同品種的馬鈴薯類胡蘿卜素及2個(gè)基因的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，StPDS和StZDS基因在葉片中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于塊莖，這一結(jié)果與類胡蘿卜素含量所呈現(xiàn)的趨勢(shì)恰好相反。結(jié)合前人的研究，推斷StPDS和StZDS可能參與葉片的光合作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究PDS和ZDS在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育過程調(diào)控機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)，同時(shí)為改善馬鈴薯的外觀品質(zhì)提供了一定的參考依據(jù)。