王倩，錢榮，溫賽群，齊琳琳，劉靈娣，武玉翠，溫春秀*

（1.河北工程大學，河北 邯鄲 056038；2.河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所/河北省藥用植物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050051）

薄荷（Mentha haplocalyxBriq.）別名蘇薄荷、冰薄荷、野薄荷等，為唇形科薄荷屬多年生草本植物，性涼、味辛，歸肝、肺兩經(jīng)。其以全草入藥，對治療風熱感冒、頭痛目赤、咽喉腫痛等病癥均有較好療效。薄荷主要含有揮發(fā)油、有機酸類以及黃酮類等成分，其中揮發(fā)油為薄荷的主要藥效成分之一，具有疏散風熱、抗炎止痛、抑菌止癢等作用，藥用價值較高[1～3]。近年來，野生薄荷已經(jīng)無法滿足日益增長的市場需求，人工栽培的薄荷成為了供給市場需求的主要來源，隨之出現(xiàn)的品種混雜、產(chǎn)量不高、品質(zhì)下降等問題逐漸暴露出來，極大地制約著薄荷產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，選育優(yōu)良的薄荷種質(zhì)顯得十分重要。

研究表明，染色體加倍能夠創(chuàng)制出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的新種質(zhì)[4，5]。與二倍體植物相比，多倍體植物在獲得一些優(yōu)勢性狀的同時，遺傳方面往往具有更大的可塑性，其生理上具有更強的適應性[6]。對于藥用植物來說，經(jīng)過人工誘變使其染色體加倍，得到多倍體器官呈巨型性、抗逆性增強、有效成分含量升高等特性的植株，正是中藥材優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)育種期望達到的目的[7]。因此，通過人工誘導進行植物多倍體材料的創(chuàng)制及育種已成為當前重要的研究方向。而有效的倍性鑒定作為了解植物遺傳背景和進一步應用于實際的前提，在育種過程中同樣是至關(guān)重要的。倍性鑒定的準確性在很大程度上影響著植物新品種的育種效果[8]?；诖?，為了加快育種進程，本研究以秋水仙素為誘變劑對薄荷莖段進行處理，通過形態(tài)學和根尖染色體觀察以及流式細胞分析對其變異株進行倍性鑒定，并對不同濃度與處理時間的植株生長和誘變效果進行比較，篩選適宜薄荷染色體加倍的誘導體系，可為薄荷種質(zhì)創(chuàng)新研究奠定堅實基礎(chǔ)，且變異植株經(jīng)進一步的培育后有望作為新品種在生產(chǎn)上推廣應用[9～11]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所藥用植物研究中心培育的安徽薄荷組培苗。

儀器主要有SW-CJ-18U 型超凈工作臺（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、Thermo ST8 ST8R熱電高速冷凍離心機（美國）、Beckman CytoFLEX 流式細胞儀（美國） 和Olympus BH-2 型顯微鏡（日本）等。

藥劑主要有秋水仙素（C22H25NO6）、乙醇、冰醋酸、改良卡寶品紅染液、鹽酸和DAPI 染色液等。除秋水仙素購于美國Sigma 公司外，其他試劑均購于北京博奧拓達科技有限公司。

培養(yǎng)基有再生試管苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基2 種。其中，再生試管苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖20 mg/L+瓊脂6.5 g/L，pH 值5.8。

1.2 試驗方法

采用秋水仙素加入培養(yǎng)基的方法，對帶有腋芽的薄荷莖段進行處理，誘導薄荷多倍體的產(chǎn)生；通過形態(tài)學和根尖染色體觀察以及流式細胞分析對其變異株進行倍性鑒定，并對不同濃度與處理時間的植株誘變效果進行比較；對變異株與親本植株的田間生物學性狀和揮發(fā)油含量進行比較。

1.2.1 變異植株的獲得 在無菌工作臺中，將薄荷試管苗莖段（帶有腋芽）分別接到含有不同濃度秋水仙素的MS 培養(yǎng)基上，進行不同時間的暗處理培養(yǎng)；后接種至再生試管苗培養(yǎng)基中，在溫度（25±2）℃、光照12 h/黑暗12 h 的光照培養(yǎng)箱中誘導薄荷試管苗的產(chǎn)生。試驗秋水仙素濃度設(shè)50 mg/L（T1）、100 mg/L（T2）和200 mg/L（T3）3 個處理，以不添加秋水仙素處理為對照（CK），每個處理均接20 個莖段，3 組重復；暗處理時間均設(shè)1、2 和3 d。

接種后，以周期性觀察并記錄莖段或再生苗的生長狀態(tài)，每15 d 為1 個記錄周期；第60 天時統(tǒng)計再生苗數(shù)量，計算誘變率。參考趙忠娟等[4]方法，將褐化、未產(chǎn)生再生苗判定為莖段死亡，將葉片明顯較大、顏色較綠的再生苗植株初步判定為變異植株。

1.2.2 變異植株的移栽 將變異植株和CK 植株從組培瓶中取出，先用流水沖洗干凈，再用0.1%多菌靈浸泡滅菌，之后移栽到事先用高錳酸鉀溶液消毒過的蛭石中，編號并覆膜，在常溫條件下通風培養(yǎng)。

1.2.3 流式細胞檢測分析 取適量葉片置于培養(yǎng)皿中，加提取緩沖液1.5～2.0 mL，用刀片將其切碎，以便提取出完整細胞核。使用濾網(wǎng)過濾至新的離心管中，1 000 r/min 離心3 min，倒出提取液后，向試管中加入50 μL 染液，避光染色1 min，利用流式細胞儀檢測植株倍性，熒光通道選擇PB450-A。

1.2.4 根尖染色體數(shù)目鑒定 8：00～11：00 取薄荷1 cm 左右的幼根放入冰水混合物中，4 ℃條件下預處理24 h，蒸餾水清洗過后用卡諾固定液〔V（95%乙醇） ∶V（冰醋酸） =3 ∶1〕處理24 h（不超過24 h），轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。60 ℃下用1 mol/L 的鹽酸解離4 min，用蒸餾水將其沖洗后使用改良卡寶品紅染液進行染色，壓片，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 移入田間多倍體植株的生物學性狀調(diào)查 多倍體植株和CK 植株移栽成活后，將其移入試驗田，在相同條件進行培養(yǎng)。達到采收標準后，觀察變異植株與親本植株葉片及植株長勢形態(tài)方面的差異。每個處理隨機選取3 株，用尺子測量葉長、葉寬和株高等，并采用常規(guī)方法測定植株的鮮重和干重。

1.2.6 移入田間多倍體植株的揮發(fā)油含量測定 將移入田間的多倍體植株和CK 植株的地上部分采收，陰干后切成段，用粉碎機粉碎成顆粒均勻細膩的粉末。取供試品適量，采用揮發(fā)油測定裝置測定薄荷揮發(fā)油含量，計算供試品的揮發(fā)油含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Office Excel（2003）軟件進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理對薄荷莖段的誘導效果

秋水仙素的處理濃度和處理時間均對薄荷莖段的存活與突變具有較大影響（表1）。試驗濃度秋水仙素處理的薄荷莖段均可成活，但觀察發(fā)現(xiàn)，其誘導出的再生苗生長緩慢，且部分莖段出現(xiàn)了不同程度的褐化、死亡現(xiàn)象；而對照莖段的再生苗長勢良好，成活率較高。

隨著秋水仙素處理濃度的增大和處理時間的延長，再生苗誘導數(shù)量趨于下降，莖段褐化現(xiàn)象加重，甚至失去生活力。處理時間為1 d 和2 d 時，誘變效果較好，成活的再生苗中均出現(xiàn)了一些突變株，誘變率最高可達33%。處理時間為3 d 時，各濃度處理下誘導產(chǎn)生的再生苗株數(shù)相對較少，且誘變率均為0。對莖段的誘導以及再生苗的生長狀況進行綜合分析，認為T21處理（秋水仙素處理濃度100 mg/L、處理時間1 d）效果最好。該處理下，薄荷莖段成活數(shù)量較多、突變數(shù)最多，誘變率最高，達到了33%。

2.2 秋水仙素誘導薄荷的倍性鑒定

2.2.1 組培苗形態(tài)學觀察 利用裸眼觀察法對相同組培條件下由秋水仙素誘導產(chǎn)生的再生苗與CK 再生苗的生長狀態(tài)進行比較，結(jié)果（圖1）顯示，二者在形態(tài)上出現(xiàn)了顯著變化，由秋水仙素誘導產(chǎn)生的再生植株總體表現(xiàn)為葉片變大且肥厚、顏色濃綠、鋸齒較深、莖稈粗壯等，符合多倍體特性，但生長速度明顯降低。

圖1 變異植株與親本植株（CK）的生長狀態(tài)比較Fig.1 Comparison of growth status between variant plants and parent plants（CK）

2.2.2 流式細胞檢測及根尖染色體鑒定 利用流式細胞儀對初步鑒定的變異植株和親本植株（CK） 進行染色體倍性鑒定，結(jié)果（圖2）顯示，CK 植株的二倍體峰值處于65×104道附近；變異植株T11-3-2、T22-1-4 和T32-1-1 的四倍體峰值處于130×104道左右，約為對照的2 倍?？梢钥闯觯逯党霈F(xiàn)與染色體倍性關(guān)系準確。

利用染色壓片法對變異植株和親本植株（CK）進行根尖染色體鑒定，結(jié)果（圖3）顯示，變異植株的根尖染色體數(shù)量明顯多于CK。根尖染色體法的多倍體鑒定結(jié)果與流式細胞檢測法的多倍體鑒定結(jié)果一致。

圖3 薄荷變異植株與親本植株（CK）的根尖染色體比較Fig.3 Comparison of root tip chromosomes between variant plants and parent plants（CK）of peppermint

2.3 多倍體植株的田間生物學性狀和揮發(fā)油含量

2.3.1 田間生物學性狀 采收期的調(diào)查結(jié)果（表2）顯示，各多倍體植株的田間生物學性狀均與親本植株（CK）具有明顯差異。多倍體植株中，株高除T11-3-1 略＞CK外，其他植株均明顯＜CK；分枝數(shù)除T21-1-4＞CK 外，其他植株均＜CK，但所有植株與CK 差異均不顯著；葉片厚度均＞CK，且除T11-3-1 外，其他植株與CK 差異均達到了顯著水平；植株鮮重和干重均顯著＜CK；葉片長度和寬度除T23-3-1、T11-2-2、T22-1-4 和T21-1-4＞CK 外，其他植株均＜CK。裸眼觀察也發(fā)現(xiàn)，與CK 植株相比，多倍體植株在田間普遍表現(xiàn)為葉厚、生長緩慢（圖4）。

圖4 多倍體植株與親本植株（CK）的田間形態(tài)比較Fig.4 Comparison of field morphology between polyploid plants and parent plants（CK）

表2 采收期多倍體植株與親本植株（CK）的田間生物學性狀比較Table 2 Comparison of field biological traits between polyploid plants and parent plants（CK）at harvest time

2.3.2 揮發(fā)油含量 《中國藥典》2020 版規(guī)定薄荷藥材的揮發(fā)油含量不得少于0.80%。測定結(jié)果（圖5）顯示，親本植株（CK）的揮發(fā)油含量為1.12%；多倍體植株的揮發(fā)油含量為0.77%～2.21%，有8 個植株的揮發(fā)油含量＞CK，其中T11-3-1 的揮發(fā)油含量最高，為親本植株的1.97 倍。有2 個多倍體植株的揮發(fā)油含量＜CK，其中T32-1-1 的揮發(fā)油含量（0.87%）最低，但其揮發(fā)測量油含量也達到了藥典標準?？梢钥闯觯啾扼w植株的揮發(fā)油含量普遍高于親本植株。

圖5 采收期多倍體植株與與親本植株（CK）的揮發(fā)油含量比較Fig.5 Comparison of volatile oil content between polyploid plants and parent plants（CK） at harvest time

3 結(jié)論與討論

多倍體是植物存在于自然界的一種普遍現(xiàn)象，能夠使植物以跳躍的方式改變其外觀形態(tài)和生理指標，同時發(fā)生染色體加倍，快速產(chǎn)生新的種質(zhì)資源[12～14]。目前在多倍體植物資源創(chuàng)新中，利用秋水仙素誘導是應用較廣泛且有效的手段之一。但高濃度的秋水仙素容易對細胞產(chǎn)生毒害作用，使植株難以恢復分裂能力，甚至死亡[15]。周玉麗[16]研究顯示，用濃度為0.3%的秋水仙素處理連翹幼苗，變異率相對較高，但成活率較低；當濃度調(diào)節(jié)至0.2%并處理72 h 后，誘導效果最為理想，變異率高達58.3%。施和平等[17]研究顯示，用0.05%的秋水仙素處理廣藿香毛狀根36 h，誘導效果最佳，誘導率可達40%；延長處理時間并增大秋水仙素濃度后，誘導率趨于下降。因此，選擇適宜的誘變材料，以及把握合適的秋水仙素濃度和處理時間至關(guān)重要。本研究中，以不同濃度的秋水仙素為誘變劑，對帶有腋芽的薄荷試管苗莖段進行誘變處理，結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加秋水仙素誘導薄荷產(chǎn)生多倍體植株的方法是可行的，且誘導效果明顯，通過流式細胞檢測、根尖染色體數(shù)目觀察等方法共鑒定出多倍體植株10 個；同時，在多個梯度條件下篩選得到秋水仙素誘導薄荷染色體加倍的最適體系為秋水仙素處理濃度100 mg/L、處理時間1 d。

在薄荷染色體加倍的研究中，趙忠娟等[4]發(fā)現(xiàn)通過秋水仙素誘導的椒樣薄荷，其變異植株較親本植株長勢快，株高明顯高于親本植株。于盱等[18]則認為不同品種在染色體加倍后變異現(xiàn)象和生長速度存在一定的差異，在相同組培條件下68-7 薄荷的染色體加倍植株與正常植株相比長勢緩慢，但73-8 和滬-39 薄荷的染色體加倍后植株生長速度與其正常植株相比無明顯變化。本研究結(jié)果顯示，薄荷誘導染色體加倍后的植株，無論是在形態(tài)特征方面還是在生理特征和揮發(fā)油含量等方面均與親本植株存在不同程度的差別，主要表現(xiàn)為葉片變得肥大且厚、莖稈變粗、鋸齒相對更深，但生長速度緩慢；多數(shù)變異植株的揮發(fā)油含量高于親本植株，最高含量可達2.21%，為親本植株（1.12%）的1.97 倍。后期將采用其他誘變手段，在誘變劑的選擇、濃度及時間的處理上進行更多嘗試，探索能夠更直觀反映基因水平變異的快速、有效檢測評價技術(shù)[19]，以期在強化誘變效果的同時，為多倍體鑒定技術(shù)的進步提供強有力的支撐，這對加快我國藥用植物新品種的開發(fā)以及優(yōu)良品種的篩選起到重要作用[20]。