宋國棟,廖宏娟,張志斌,朱 篤,2*

1江西師范大學生命科學學院 江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室,南昌 330022;2江西科技師范大學生命科學學院 江西省生物加工過程重點實驗室,南昌 330013

微生物次級代謝產物是一類結構多樣、功能復雜且具備特殊生物活性的物質,在藥物研究與開發(fā)領域占據著重要的地位。截至目前,從微生物中鑒定出大約30萬種化合物,有超過60 %的抗生素來源于鏈霉菌。然而,隨著大量次級代謝產物的分離,從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)具有顯著生物活性且結構新穎抗生素的概率越來越低[1-3]。近些年,隨著基因組測序技術在微生物測序方面的廣泛應用,大量的鏈霉菌基因組信息被公開[4]。通過對鏈霉菌基因組數據進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)其中仍有一大部分的基因處于沉默狀態(tài),這表明還有大量潛在的次級代謝產物尚未被發(fā)現(xiàn)[5]。受限于常規(guī)培養(yǎng)條件,鏈霉菌生物合成基因簇未能有效激活,因而其獨特的代謝產物途徑往往表達較少或不表達。因此,通過激活鏈霉菌沉默基因簇以挖掘新型活性次級代謝產物具有重要意義。

為了激活鏈霉菌沉默基因表達,以發(fā)現(xiàn)更多活性次級代謝產物,迄今已有多種激活沉默基因簇的方法得到開發(fā)和應用[6,7]。常用的策略可分為兩大類:一類是非定向激活策略,即通過改變培養(yǎng)基的組成(碳源、氮源、微量元素、化學激發(fā)子)[8,9]、菌株的生長環(huán)境(溫度、pH、曝氣、容器類型)[6]或微生物共培養(yǎng)[10]等方式,誘導鏈霉菌產生不同的代謝產物;另一類是定向激活策略,即通過基因編輯技術(CRISPR-Cas9)[11]、靶向激活特定基因簇(啟動子工程、途徑特異性調控因子激活、異源表達)等手段[12,13],使鏈霉菌沉默基因得以表達。相較于定向激活策略,非定向激活策略不需要建立目標菌株的遺傳操作體系,因此具有操作簡單、可同時激活多個生物合成基因簇(而不是某一特定的生物合成基因簇)等優(yōu)點,其應用更為廣泛。本文簡要綜述了改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件激活策略、共培養(yǎng)策略、添加化學激發(fā)子及全局性調控等非定向激活鏈霉菌沉默基因的策略(見圖1),并描述了這一領域所面臨的問題和未來的發(fā)展前景。

圖1 非定向策略激活沉默基因Fig.1 No-target strategies for activating silent genes clusters

1 改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件的激活策略

1.1 改變培養(yǎng)基的組成

培養(yǎng)基組成(即碳源、氮源、無機鹽等)對次級代謝產物的影響非常復雜,且對不同微生物產生相當明顯的差異[14]。大量的研究表明,營養(yǎng)組成的變化可激發(fā)鏈霉菌產生各種新型化合物[15](見圖2、表1)。

表1 改變培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件發(fā)現(xiàn)新的活性代謝產物Table 1 Change of medium composition,culture conditions to discover new active metabolites

圖2 化合物1～37結構Fig.2 Structures of compounds 1-37

1.1.1 碳氮源

Martin等[16]描述了碳氮源種類及碳氮比對次級代謝產物的影響。葡萄糖是一種優(yōu)質的生長碳源,但是濃度過高時會干擾次級代謝產物的形成,這已經被Romero-Rodriguez等[17]所驗證。Gullon等[18]觀察到當葡萄糖作為碳源,可以通過抑制S.lividans中afsMRNA(編碼一個參與刺激次級代謝產物生物合成的全局性調控基因)的表達,從而抑制放線菌紫紅素(actinorhodin)的產生;當葡萄糖用甘油替代時,則沒有觀察到這種抑制作用。同樣地,Rateb等[19]將ISP2培養(yǎng)基中的葡萄糖換成甘油用于培養(yǎng)Streptomycessp.C34,并從該菌分離到4個新的聚酮類化合物chaxamycins A～D(1～4)。Sujatha等[20]比較了葡萄糖、乳糖、果糖、甘油等14種碳源對海洋鏈霉菌Streptomycessp.BT-408生產聚酮類抗生素產量的影響,結果發(fā)現(xiàn)該菌以葡萄糖為碳源時產量最高,其次是果糖。

氮是蛋白質和核酸的重要組成之一,不同的氮源會對細菌生長和次級代謝產物的合成有一定的影響[21]。鏈霉菌中低濃度的氮源有利于次級代謝產物的合成已被廣泛證明[14]。Sujatha等[20]比較了6種無機氮源和13種氨基酸(作為唯一氮源)對Streptomycessp.BT-408生產聚酮類抗生素的影響,結果表明硝酸銨為氮源時抗生素產量最高。N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)是細菌肽聚糖的一部分,它是一種優(yōu)質的碳氮源。Rigali等[22]研究了GlcNAc對S.griseus(鏈霉素的生產者)形態(tài)分化與次級代謝產物產生的影響。結果表明,添加較多的GlcNAc,S.griseus的形態(tài)分化和抗生素的生產都被抑制,而添加較少的GlcNAc則得到相反的效果。同時,Wezel等[23]發(fā)現(xiàn),較少的GlcNAc有利于S.cescoloniesA3中抗生素的生成,而較多的GlcNAc則呈現(xiàn)抑制作用。此后證明,這種現(xiàn)象在鏈霉菌中普遍存在,稱為氮抑制。這種機制不僅會影響初級氮代謝,還會影響到次級代謝產物的生物合成。

總之,碳氮源種類和濃度對鏈霉菌的生長發(fā)育以及次級代謝產物的合成都有重要影響,且這一過程要受到嚴格的基因調控。碳源選擇的這一過程被稱為碳分解代謝物阻遏效應(carbon catabolite repression,CCR),與其它革蘭氏陽性菌不同,鏈霉菌中的CCR不受磷酸烯醇丙酮-磷酸轉移酶系統(tǒng)(phosphoenolpyruvate-phosphotransferase system,PTS)的控制,而是通過質子轉運體運輸葡萄糖[24],同時被葡萄糖激酶(glucokinase,Glk)磷酸化,目前已證明了Glk在CCR這一過程中的關鍵作用[25],被稱為Glk依賴機制,此外葡萄糖依賴機制也被認為在CCR中發(fā)揮著重要作用[25]。與Glk相似,在氮代謝中,GlnR(一種全局性調控因子)在雙組分系統(tǒng)(two-component system,TCS)中發(fā)揮著重要的作用[26]。

1.1.2 微量元素

營養(yǎng)元素尤其是微量元素對微生物次級代謝產物的合成和積累有重要作用。微量元素可作為次級代謝產物的組成元素,也可對次級代謝產物合成酶的活性有激活或抑制作用。

磷是細胞生長過程中的中重要元素,參與遺傳物質合成、能量代謝、信號轉導、維持膜完整性等多個至關重要的過程,并通過磷酸化發(fā)揮重要的信號傳導作用[27]。近些年,磷酸鹽對次級代謝產物的分子機制已被闡明,即PhoR-PhoP(又稱Pho規(guī)則)雙分子系統(tǒng)[27]。已有無機磷酸鹽對鏈霉菌生理和抗生素產量影響的報道,高濃度磷酸鹽(≥10 mmol/L)培養(yǎng)基會導致次級代謝產物產量驟減或消失;相反,低磷酸鹽水平(< 0.1 nmol/L)可導致次級代謝產物的增加[28]。一些研究表明,PhoR-PhoP系統(tǒng)通過間接的方式影響其他轉錄因子(AtrA[29]、AveR[30])表達,從而引起次級代謝產物的變化。

微量金屬被證明既能刺激次級代謝產物的增加,又能激活微生物中沉默的生物合成基因簇[31]。金屬離子與微生物之間通常存在三種相互作用:在細胞中發(fā)生反應、同化反應和異化反應。Akhter等[32]采用不同類型(NiCl2、CoCl2、ZnSO4、CrCl3、MnCl2)、不同濃度(100、200、400、800 μmol/L)金屬離子對從海洋沉積物中分離出的S.pratensisNA-ZhouS1進行發(fā)酵培養(yǎng),確定Ni離子效果最佳,并成功分離出2個新的芳香族聚酮stremycin A、B(5、6)以及4個已知的化合物(7～10)。Shi等[33]同樣用含鎳培養(yǎng)基從Streptomycessp.WU20中分離到1個新型的環(huán)唑嗪類似物(11)。Liu等[34]將Streptomycessp.FXJ1.172放在添加了鐵離子的葡萄糖-酵母提取物-麥芽提取物(Glucose-yeast extract-malt extract,GYM)培養(yǎng)基中培養(yǎng),產生了1個新型的環(huán)肽類化合物cyclic depsipeptide NC-1(12)。

1.1.3 更換培養(yǎng)基

除了改變培養(yǎng)基中的碳源、氮源、添加微量元素等方式,更換培養(yǎng)基也可以獲得更豐富的代謝產物。Wu等[35]使用不同的培養(yǎng)基(ISP2、ISP4、ACM和TSB),對一株海洋來源的鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng),最終在ACM培養(yǎng)基中分離出1個新型聚酮類化合物inthomycin B(13)。Lu等[36-40]對Streptomycessp.CS進行培養(yǎng),在YMG瓊脂培養(yǎng)基產生3個新的大環(huán)內酯類化合物(14～16),在ISP2培養(yǎng)基中產生5個新的巴弗洛霉素衍生物(17～21),在Waksman合成培養(yǎng)基中產生5個新的聚酮類化合物(22～26),在燕麥培養(yǎng)基中產生3個新的安莎霉素類化合物naphthomycins L、M、N(27～29)以及3個已知的naphthomycins(30～32)。Ding等[41]將一株海洋來源的鏈霉菌Streptomycessp.DT-A37放在Gause′s液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),分離得到2個主產物:全霉素(holomycin)(33)及其開環(huán)衍生物(34)。隨后Ding等[41]又將這株鏈霉菌放在大米固體中培養(yǎng)發(fā)酵,從其培養(yǎng)提取物中分離出新的全霉素衍生物(35)和2個新的環(huán)丙烷乙酸衍生物(36、37)。

1.2 培養(yǎng)條件的改變

微生物在培養(yǎng)過程中的外界環(huán)境如溫度、pH、曝氣、容器類型等因素都會影響微生物基因表達,因而對次級代謝產物的合成有著顯著的影響。最早在2002年,Bode等[6]通過改變外界培養(yǎng)參數(如曝氣、溫度、pH、培養(yǎng)容器),從6種不同的微生物中分離出100多種化合物,分屬于25種以上不同的結構類型。

1.2.1 溫度

次級代謝產物的產生直接受微生物酶活性的影響,溫度過高導致酶失活,溫度過低則會影響酶促反應速率。鏈霉菌S.peucetiusDM07以生產重要的蒽環(huán)類藥物而聞名,在同一培養(yǎng)基中,Pham等[42]將菌株在不同溫度下(18、23、28和37 ℃)培養(yǎng)72 h,發(fā)現(xiàn)在18 ℃培養(yǎng)條件下的產物于17.5 min出現(xiàn)新峰,而在其他的溫度下該峰不存在,通過進一步的分離與純化得到1個新型大環(huán)內酯類化合物peucemycin(38)(見圖3和表1)。

圖3 化合物38～71結構Fig.3 Structures of compounds 38-71

1.2.2 曝氣或溶氧量

含氧量的變化可以影響生化反應,進而調控代謝途徑,激活不同的基因簇。鏈霉菌Streptomycessp.Go40/14所有的代謝產物都可以通過改變發(fā)酵罐體積、培養(yǎng)基組成或曝氣程度分離獲得,化合物39～43幾乎在所有的條件下都能獲得;而化合物44和45只能在特殊的發(fā)酵罐得到;化合物46～49可通過高曝氣獲得;化合物50只能在體積超過90L、高曝氣的發(fā)酵罐中得到[6]。Gallagher等[43,44]用海洋來源的鏈霉菌Streptomycessp.CNQ-525來探究氧氣濃度對次級代謝產物生成的影響,當在低氧環(huán)境下生長時,觀察到萜類化合物napyradiomycin(51)的產量減少,而另外1個萜類化合物的中間體8-amino-flaviolin(52)大量增加。S.parvulusTu64在常規(guī)培養(yǎng)條件下的主要代謝產物為聚酮類化合物manumycin A(53),同時伴有manumycins B～D(54～56)的產生,但隨著壓力以及溶氧量的增加,導致該菌產生了20個新的聚酮類化合物manumycin或manumycin類似物,這里僅列出來2種(57、58)[6]。

1.2.3 鹽度、pH

鹽度、pH與溫度一樣都是微生物生理生化保持穩(wěn)定的一個重要因素。微生物暴露在添加不同鹵素的培養(yǎng)基中,可能會激活隱秘的生物合成基因簇,產生不同的次級代謝產物。Streptomycessp.DSM 14386在含1.5% NaCl的培養(yǎng)基中產生5個新型的環(huán)肽類化合物Svetamycins A～E(59～63),在含1.5% NaBr的培養(yǎng)基中產生2個溴化同源物Svetamycins F、G(64、65),這些物質均在常規(guī)培養(yǎng)基中未被發(fā)現(xiàn)[45,46]。培養(yǎng)環(huán)境pH通過影響酶的活性及膜表面的帶電性質,改變底物的進出速率與進出方式,進而影響基因簇的表達。Streptomycessp.A1在pH為微酸的情況下產生雙苯并螺環(huán)縮酮類化合物Rubromycins(66～69),當環(huán)境pH為7.3時,則會產生化合物70和71[6]。Sakar等[47]從靠海附近的濕潤環(huán)境中分離到一株Streptomycessp.MS1/7,并報道了pH對該菌次級代謝產物產量的影響,發(fā)現(xiàn)其在酸性(pH 4.0)培養(yǎng)基中沒有抗菌活性,pH大于7.0表現(xiàn)出一定的活性,pH=10.0時仍表現(xiàn)出抗菌活性,但是在pH為9.0時抗菌活性最高。

1.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化策略

在改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件的激活策略中,培養(yǎng)條件的優(yōu)化可以通過一次次地修改某個單一因素來實現(xiàn),也可以基于更復雜的數學和統(tǒng)計方法來幫助實現(xiàn),即人工神經網絡(artificial neural network,ANN)、遺傳算法(genetic algorithm,GA)、響應面法(response surface methodology,RSM)等[48]。RSM方法是Box等[49]開發(fā)的一種使用因子設計來優(yōu)化所需代謝物的生產過程,常用于優(yōu)化配方變量和優(yōu)化發(fā)酵過程。Managamuri等[50]對S.sparsusVSM-30培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化,包括孵育時間、溫度、pH、碳氮源等,實現(xiàn)抗真菌、抗細菌和抗氧化等活性物質的增加。在另一項研究中,Singh等[51]應用ANN與GA結合的方法優(yōu)化了S.triostinicus的培養(yǎng)基組分,并從該菌種分離到放線菌素V,該菌株在先前并沒有檢測此類抗生素的產生,且應用ANN/GA獲得的抗生素產量比RSM獲得的產量高36.7%。

2 共培養(yǎng)策略

傳統(tǒng)微生物天然產物的生產通常是在一個營養(yǎng)豐富的單一培養(yǎng)基中完成的,這些培養(yǎng)基雖然有效,但是與細菌原始、復雜且貧瘠的環(huán)境相比有著明顯的區(qū)別[52]。共培養(yǎng)體系是激活沉默生物合成基因簇、刺激新型次級代謝產物產生的有效策略之一,其主要通過模擬種間爭奪養(yǎng)分、空間等條件時所遇的生存壓力來分析微生物形態(tài)變化、監(jiān)測細胞密度等,進而發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中微生物次級代謝產物的變化[53]。根據培養(yǎng)基狀態(tài)的不同可以分為液體共培養(yǎng)(混合發(fā)酵)和固體共培養(yǎng)[10]。根據共培養(yǎng)微生物的類型,我們可以分為:鏈霉菌與鏈霉菌共培養(yǎng)、鏈霉菌與非鏈霉菌共培養(yǎng)兩大類[54]。

2.1 鏈霉菌與鏈霉菌共培養(yǎng)

Yamanaka等[55]對76株鏈霉菌的交叉共培養(yǎng)證明,20%以上的鏈霉菌在共培養(yǎng)條件下表現(xiàn)為菌株長勢迅速且次級代謝產物產量增加。鐵色素類化合物去鐵胺(desferrioxamine E)(72)(見圖4)是從S.griseus培養(yǎng)液上清中分離純化的一種鐵載體,它與鏈霉菌生長及相關生物產品的產生有關。將該菌與不同鏈霉菌菌株共培養(yǎng),使鏈霉菌出現(xiàn)不同程度的次級代謝產物增加或形態(tài)分化。當S.griseus與S.coelicolorA3(破壞了鐵載體合成基因簇,單獨不可培養(yǎng))共培養(yǎng)時,S.coelicolorA3恢復正常生長,表明了desferrioxamine E在鏈霉菌的生存發(fā)育中起到一定的作用[55]。S.colicolorM145與其他鏈霉菌(Streptomycessp.E14、Streptomycessp.SPB74等)相互作用時,至少產生了12個不同的去鐵胺[56]。

圖4 化合物72～75結構Fig.4 Structures of compounds 72-75

Promomycin(73)是在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的可以促進抗生素生產的聚醚類化合物,結構上與lonomycin(74)相關,本身具有抗菌活性。將產生這種物質的鏈霉菌與不同的鏈霉菌(常規(guī)培養(yǎng)未有抗生素類物質產生)共培養(yǎng),均有抗生素物質產生[57]。S.lividans是兩種紅色素的生產者,但這些色素的產生需要具備一定的條件,在實驗室正常培養(yǎng)條件下,并不會產生這些色素,需要在一種激素類似物(75)的刺激下才可以產生[58]。Onaka等[58]將從土壤中分離出的400個放線菌用于刺激S.lividans的生長,將Streptomycessp.TP-A0584與目標菌種共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)S.lividans產生紅色素,后經分離得到1個新的多肽類抗生素goadsporin,低濃度的goadsporin具有促進孢子形成的作用,高濃度則會抑制菌體的生長。

2.2 鏈霉菌與非鏈霉菌共培養(yǎng)

2.2.1 鏈霉菌與細菌

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等人類致病菌一直是實驗室篩選具有生物活性次級代謝產物的指示菌株。最近幾十年發(fā)現(xiàn),這些致病菌在通過共培養(yǎng)方式來激活沉默基因簇方面具有優(yōu)勢,因而一直嘗試將它們與放線菌共培養(yǎng),尤其是鏈霉菌屬[59]。

Bing等[60]發(fā)現(xiàn)Streptomycessp.FXJ2.014單一培養(yǎng)主要產生的生物活性代謝產物是醌霉素(quinomycin A),將其與枯草芽孢桿菌在液體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)可產生1個新的醌霉素結構類似物quinomycin FXJ2.014-HB,并通過實驗驗證,這種新產生的醌霉素具有成為低細胞毒性抗生素的潛力。Daniel等[61]將一株海洋來源的鏈霉菌與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)了1個新的環(huán)肽類化合物dentigerumycin E,檢測了dentigerumycin E(76)及其化學衍生物(77、78)生物活性,發(fā)現(xiàn)dentigerumycin E具有抗人類癌細胞增殖活性(見圖5、表2)。

表2 共培養(yǎng)挖掘新的活性代謝產物Table 2 Co-culture mining for new active metabolites

圖5 化合物76～107結構Fig.5 Structures of compounds 76-107

Sung等[62]從紅樹林根部分離到一株鏈霉菌Streptomycessp.PTY08712,通過分析其基因組發(fā)現(xiàn)該菌株具有產生多種次級代謝產物的強大潛力。使用多種培養(yǎng)基單獨培養(yǎng)時,在其提取物中發(fā)現(xiàn)的次級代謝產物,與基因組數據顯示的潛在的次級代謝產物的種類相比存在巨大的偏差。后將其與枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)共培養(yǎng),該菌株中的沉默生物合成基因簇被激活,granaticin、granatonmycin D 和 dihydrogranaticin 等3種抗生素產量增加。單一培養(yǎng)S.coelicolorA3時會產生少量三吡咯色素類化合物undecylprodigiosin,Mavituna等[63]將該鏈霉菌與大腸桿菌共培養(yǎng),最終undecylprodigiosin的產量有顯著增加。

Burkholderiavietnamiensis(ATCC BAA-248)、Brucellaneotomae(ATCC 23459),Yersiniapestis(A1122)和Xanthomonasaxonopodis(ATCC 8718)均為變形桿菌,與鏈霉菌(Streptomycessp.Bo33)共培養(yǎng)時產生1個新型的醌類天然抗生素resistomycin,對菌株單獨培養(yǎng)時均未檢測到該物質的產生[64]。

2.2.2 鏈霉菌與真菌

真菌是一類龐大的群體,人們已經從真菌發(fā)現(xiàn)了大量的次級代謝產物[65],并且許多次級代謝產物表現(xiàn)出生物活性,因而具有重大的藥物開發(fā)潛力[66]。目前,最成功的共培養(yǎng)方法可能涉及到與各種真菌的共培養(yǎng),由于許多真菌與放線菌在不同的生態(tài)環(huán)境中共存,這意味著他們之間存在著普遍的相互作用[67](見圖5和表2)。

Rateb等[68]報道將S.bullii與AspergillusfumigatusMBC-F1-10分別接種在麥芽提取物培養(yǎng)基,在LC-MS色譜圖中幾乎看不到任何占主導地位的峰,用相同的培養(yǎng)基將兩者共同培養(yǎng),其LC-MS譜圖非常復雜,最后經過分離鑒定,得到7個新型的生物堿類化合物(79～85)。Schroeckh等[69]將印尼曲霉A.nidulans與S.hygroscopicus共培養(yǎng)時會產生4個新型的聚酮類化合物(86～89),這是在單獨培養(yǎng)時未曾發(fā)現(xiàn)的。

在Yu等[70]的研究中,以S.rocheiMB037和Rhinocladiellasimilis35進行共培養(yǎng),并以兩株菌的單獨培養(yǎng)作為對照。從培養(yǎng)液中成功分離出2個新型的大環(huán)內酯類化合物borrelidins J、K(90、91),以及三種已知的大環(huán)內酯類化合物(92～94),且化合物90、91僅在共培養(yǎng)中被檢測到。Wang等[71]將Penicilliumsp.WC-29-5與S.fradiae007共培養(yǎng),從培養(yǎng)液中共分離出5個新型的聚酮類化合物(95～99),其中化合物deoxyfunicone(95)、交鏈孢酚 alternariol (96)、(9R,14S)-epoxy-11-deoxyfunicone(98)、(9S,14R)-epoxy-11-deoxyfunicone(99),僅在共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),且化合物98和99表現(xiàn)出一定的細胞毒性活性。

TsukamurellapulmonisTP-B0596是一種含霉菌酸的真菌,與S.lividans共培養(yǎng)能誘導紅色素的產生。Onaka等[72]將112株鏈霉菌與TsukamurellapulmonisTP-B0596共培養(yǎng),經HPLC分析發(fā)現(xiàn)其中41個菌株誘導了新的次級代謝產物產生,如新型聚酮類抗生素alchivemycin A(100)。

鏈霉菌與非鏈霉菌共培養(yǎng)時,兩者的關系并不是一成不變的。鏈霉菌既可以是生產者也可以是誘導者。如Wakefield等[73]將一株源自海洋的真菌AspergillusfumigatusMR2012與高干旱沙漠分離的S.leeuwenhoekiiC34共培養(yǎng)來研究兩者的相互作用。真菌MR2012與鏈霉菌C34共培養(yǎng)導致許多新化合物產生,其中包括真菌來源的6個新型的生物堿類化合物brevianamide X(101)、brevianamide F(102)、terezine D(103)、luteoride D(104)、pseurotin G(105)、11-O-methy pseurotin A(106),這是該真菌在單獨培養(yǎng)時從未檢測到的;除了在鏈霉菌C34檢測到的代謝物外,共培養(yǎng)條件下分離出1個新型的環(huán)肽類化合物chaxapeptin(107),這也是單獨培養(yǎng)未檢測到的。

3 添加化學激發(fā)子

化學激發(fā)子是小分子物質,當添加到培養(yǎng)基中時可誘導微生物生物合成基因簇的表達并產生次級代謝產物[74]。在自然界中,鏈霉菌生活在比較復雜的環(huán)境之中,周圍常存在細菌、真菌、動物和植物,為了解決本身生存問題,其會產生大量化學信號分子來調節(jié)自己與四周環(huán)境的適應性,從而滿足特定合成基因的調控表達機制,以便其更好地生存[75](見圖6、表3)。

表3 添加化學激發(fā)子發(fā)現(xiàn)新的活性代謝產物Table 3 Addition of chemical excitons to discover new active metabolites

圖6 化合物108～118結構Fig.6 Structures of compounds 108-118

有報道稱,大多數激發(fā)子是抗生素,它們能在較低的濃度下誘導次級代謝產物的產生[76]。如前面提到的從一株鏈霉菌中分離得到的抗生素goadsporin,低濃度(<1 μmol/L)的goadsporin能刺激鏈霉菌次級代謝產物的增加;高濃度的goadsporin則會抑制細胞的增殖[58]。Etoposide(108)和ivermectin(109)是已知的抗生素,在低濃度下均可以誘導次級代謝產物的增加[41]。S.coelicolor能生產undecylprodignine(110)、streptorubin B(111)等色素型次級代謝產物[77,78]。為了確定干擾次級代謝的小分子,Craney等[79]篩選了30569種小分子,以鏈霉菌在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)期間色素的沉著能力作為檢測標準。

結果觀察到有112種小分子有色素沉著能力,其中19種小分子表現(xiàn)出較好的效果。19個小分子中有4個具有相似的結構:ARC2、ARC3、ARC4和ARC5,稱為ARC2系列。在實驗中,將購買的ARC2(112)及其ARC2衍生物Cl-ARC2用于多種鏈霉菌中,成功誘導出1個苯并異色烷醌類化合物(113)、1個三吡咯色素類化合物(114)以及3個不飽和內脂類化合物(115～117)[14,74,79,80]。

組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)是一類重要的酶,負責從組蛋白的N端尾部去除乙酰基團[81]。組蛋白的N端通過添加/去除小基團如甲基、乙?；蛄姿峄鶊F來修飾,這些修飾可以影響基因的轉錄[82]。鏈霉菌屬于原核生物,沒有組蛋白可以供DNA附著,HDAC抑制劑對細菌的研究較少。在一項初步研究中,Moore等[81]研究了HDAC抑制劑對S.coelicolorA3次級代謝產物產生的影響。實驗在兩種固體培養(yǎng)基中進行,正常情況下R5培養(yǎng)基會產生兩種色素且產量正常,MM培養(yǎng)基則會降低兩種色素的產量。當加入一定體積的丁酸鈉(sodium butyrate,一種典型的HDAC抑制劑)會使MM培養(yǎng)基上色素的產量增加,而R5培養(yǎng)基上的色素產量降低。隨后使用不同的HDAC抑制劑,得出了相似的結果。在液體培養(yǎng)基中,加入丁酸鈉,通過定量PCR進行檢測發(fā)現(xiàn)S.coelicolorA3中5個公認的沉默基因被表達[81]。

稀土金屬也是一類激發(fā)因子,最近的研究證明,其在刺激沉默基因簇產生次級代謝產物方面也相當有效果[83]。如Xu等[84]在正常培養(yǎng)基中添加LaCl3用于培養(yǎng)來自于深海的50株放線菌,其中有15株由于添加了LaCl3導致抗病原菌活性物質的產量增加,并檢測到新的環(huán)肽類化合物如uranchimycin D(118)。此外,糖、金屬離子等也可以作為激發(fā)子觸發(fā)沉默基因簇表達[23,32,85]。

總之,無論選擇哪種激發(fā)子進行誘導,其優(yōu)勢都是明顯可見的。同時添加激發(fā)子是最簡單、最具有成本效益的方式,當然缺點也是明顯的,激發(fā)子過多過少都會造成一定的影響,過多會造成微生物的直接死亡,過少則表現(xiàn)為沒有影響,因此使用時需要選擇合適的激發(fā)子的濃度[74]。

4 全局性調控

鏈霉菌的次級代謝產物可以通過多種復雜的代謝途徑合成,且相關基因的表達往往要受到極為嚴格的調控[86]。其中,全局性調控是指在全局性調控因子的作用下發(fā)揮的調控作用,該因子不屬于任何一個基因簇,在特定的環(huán)境條件下,可同時誘導多個基因的表達,還可以影響形態(tài)結構以及生長發(fā)育[87]。

天藍色鏈霉菌bld基因是全局性調控中第一個被描述的,該基因的突變會導致抗生素合成的中斷以及生長發(fā)育停止。早在2000年,天藍色鏈霉菌中就有超過10個bld基因被鑒定,這些基因調控著不同的產物[88],其中bld A基因是bld基因中研究最多的,其通過調控mRNA的轉錄,從而控制次級代謝產物的合成[89]。同時研究者在其他鏈霉菌的基因組中也發(fā)現(xiàn)了bld基因的同源基因,逐漸被用于鏈霉菌沉默基因簇的激活[90]。除了bld基因外,目前還有nsdA[91]、farR1[92]、abrC1/C2/C3[93]、SCB1,2,3[94]、adpA[95]、crp[96]等全局性調控因子用于鏈霉菌沉默基因簇的激活。

5 總結

抗生素的發(fā)現(xiàn)是醫(yī)學發(fā)展史上的重大里程碑,極大地降低了病菌感染的發(fā)生率和死亡率。目前已經發(fā)現(xiàn)的抗生素類約60%的是由鏈霉菌產生,然而,隨著抗生素的大量使用,耐藥性及超級細菌問題同樣日益突出[1]。為了應對耐藥性以及超級細菌的這一問題,我們急需挖掘新的抗生素。通過對鏈霉菌基因組數據進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)存在著很大一部分的基因處于沉默狀態(tài)[5]。因而,鏈霉菌中沉默基因簇的激活是當下重要的問題之一。越來越多的學者注意到了鏈霉菌發(fā)現(xiàn)新化合物的潛力,開始研究如何刺激沉默基因簇的激活。

根據激活的目標基因是否明確,我們將目前的激活策略分為定向激活策略和非定向激活策略。非定向激活策略包括改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件的激活策略、共培養(yǎng)策略、添加化學激發(fā)子和全局性調控等,與一些基于基因的手段如核糖體工程、啟動子工程、轉錄因子調控等相比,非定向激活策略有著自身的優(yōu)勢及局限性(見表4)。近些年,一些新的、前沿的手段被研發(fā),如微流體平臺[14]、微發(fā)酵與基因組尺度的代謝模型結合[97]、生物發(fā)生管與組學相結合[98]、HiTEs[99]等,在激發(fā)沉默基因簇中起著巨大的作用。將非定向激活策略與代謝物指紋圖譜分析結合已證明在挖掘次級代謝產物中取得重大成果[100]。

表4 非定向沉默基因簇激活策略的優(yōu)缺點Table 4 Advantages and disadvantages of non-directed strategies for activating silent gene clusters

本文僅僅是對改變培養(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件的激活策略、共培養(yǎng)策略以及添加化學激發(fā)子策略進行簡單的概括,未涉及或僅涉及到很少一部分基因層面的技術。目前,無論是非定向激活策略還是定向激活都有各自的優(yōu)勢及局限性,單獨使用某一種策略很難全面激活沉默基因簇。因此,在基因組測序技術的不斷進步的前提下,將基礎微生物學方法、計算方法和技術創(chuàng)新等更徹底地結合起來,將更有助于發(fā)現(xiàn)鏈霉菌巨大的次級代謝產物合成潛力。