周 艷,宿 露,王 云,范韋佟,李洪梅,李蓉濤,劉 丹

昆明理工大學生命科學與技術學院,昆明 650500

流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病,具有季節(jié)性和流行性的特點[1]。流感病毒屬于正粘病毒科,分為A型、B型、C型和D型四種類型。預防和治療流感,疫苗和抗病毒藥物仍是最有效的選擇。就降低發(fā)病率和死亡率而言,疫苗被認為是控制流感病毒大流行最理想的方法[2]。然而,流感疫苗只有在疫苗毒株與流行性病毒株相匹配時才有效[3]。流感最常見的臨床治療藥物主要是NA抑制劑,包括奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋,以及M2質子通道阻滯劑,包括金剛烷胺和金剛乙胺[4]。不幸的是,一些新出現(xiàn)的甲型流感病毒株,自然攜帶藥物突變基因,導致對這些藥物產生耐藥性[5]。因此尋找新型抗流感藥物刻不容緩。流感病毒感染機體后可觸發(fā)各種免疫反應,引起調控細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)等的釋放,而過度的免疫反應也會導致靶器官的炎性損傷,甚至影響臟器功能。據此,降低由流感病毒引起的炎性損傷也是治療流感的一個主要方面[6]。

苯丙素類是天然存在的一大類化合物,包括苯丙醇、苯丙醛、苯丙酸、香豆素、木質素等,現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)這類化合物具有減輕氧化應激損傷、抗腫瘤以及抗流感病毒的作用。有研究證明,中藥制劑板藍根的抗流感的作用也與其中的苯丙素類成分密切相關。苯丙素類小分子化合物ferulaldehyde(FDE)[7]廣泛存在于甘草、神經脂草、洋甘菊等植物中,被報道具有抗氧化和抗炎的活性[8]。我們從蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)和赤芍(Paeoniae Rubra Radix)中都分離獲得了FDE結構,并首次發(fā)現(xiàn)了其顯著的抗流感病毒的作用。蜘蛛香和赤芍作為我國傳統(tǒng)中藥,藥用歷史悠久,在流感治療方面也有相關的記載,因此從中篩選有效化合物并研究其活性成分的作用機理,對其綜合開發(fā)和利用具有重要的意義。因此本研究旨在探索FDE對流感病毒生命過程的影響以及對流感病毒感染引起的炎癥反應的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫;磷酸奧司他韋(Oseltamivir)(安耐吉化學,批號:CK030008);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國紐約Gibco公司,批號:8122554);胎牛血清(FBS)(美國紐約Gibco公司,批號:2176404);胰蛋白酶(中國Solarbio公司,批號:510T0419);MTT(中國Solarbio公司,批號:530R0515);DAPI染料(中國Beyotime公司,批號:073120201023);神經氨酸酶測定試劑盒(中國Beyotime公司,批號:071420211012);CellTiter-Glo?發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒(美國Promega公司,批號:0000424721);放射免疫沉淀測定(RI-PA)裂解液(中國Beyotime公司,批號:22308515);小鼠抗核蛋白(NP)單克隆抗體(英國Abcam公司,批號:GR3397701-3);山羊抗小鼠IgG結合FITC熒光二抗(中杉金橋生物技術公司,批號:133449);化合物FDE由本課題組通過各種色譜方法從蜘蛛香和赤芍中分離得到,并通過NMR和MS等波譜方法進行結構鑒定[9,10]。

1.2 儀器

多功能讀板儀Spectra Max M2(美國Molecular Devices);光學倒置顯微鏡CKX41(德國O-lympus);CO2細胞培養(yǎng)箱3111(美國Thermofisher);高速冷凍離心機1-14K(德國Sigma);尼康激光共聚焦顯微鏡A1R/A1(日本Nikon)。

1.3 細胞毒性實驗

使用MTT法測FDE的細胞毒性。將FDE倍比稀釋成5個濃度(6.25、12.5、25、50和100 μmol/L),分別加入到已長成單層細胞的96孔培養(yǎng)板中,設正常細胞對照組,每組設置3個復孔,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,采用MTT法測定細胞活度[11],使用Spetra Max M2檢測波長為490 nm的吸光度。

1.4 體外抗流感病毒活性篩選

1.5 噬斑實驗

MDCK細胞以3×105個/孔的數量接種于12孔板中,培養(yǎng)24 h,直至長成單層細胞。用WSN(250 TCID50)感染2 h,用預冷的PBS清洗兩遍,洗去未與細胞結合的病毒,加入含有不同濃度藥物的無血清培養(yǎng)基,待其完全凝固后,倒置放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)72 h后,4%多聚甲醛固定30 min,去除瓊脂糖覆蓋層,用0.1%結晶紫染色。

1.6 加藥時間點實驗

MDCK細胞以3 × 105個/孔接種于12孔板中,培養(yǎng)24 h。用WSN(250 TCID50)感染細胞,分別在0～2、0～5、0～8和0～10 h(采用預防給藥的方式,WSN和FDE共同作用前2 h,然后洗去WSN,加入FDE,0～2 h為WSN和藥物共同作用的2 h,下同)進行FDE(60 μmol/L)處理。收集裂解細胞,分析NP含量變化[14],到達給藥時間后,將細胞用80 μL裂解液(含1%的PI和PMSF)裂解40 min,收集裂解液,加入20 μL的5× loading buffer變性10～15 min后,用10% SDS-PAGE進行凝膠電泳,后將蛋白質從凝膠轉移至PVDF膜上,脫脂牛奶封閉,一抗、二抗孵育后通過化學發(fā)光顯影并拍攝分析。

1.7 免疫熒光實驗

MDCK細胞以1×105個/孔的數量接種于共聚焦皿中,培養(yǎng)24 h。WSN(250 TCID50)感染細胞,分別在0～2、0～5、0～8和0～10 h進行FDE(60 μmol/L)處理。處理后細胞經4 %多聚甲醛溶液固定10 min,0.1% Triton X-100打孔10 min后,一抗孵育過夜,二抗孵育1 h,DAPI染核10min后用共聚焦顯微鏡進行拍攝。

1.8 血凝素活性抑制試驗

根據病毒血凝滴度稀釋病毒。將一系列濃度(6.25、12.5、25、50和100 μmol/L)的化合物與稀釋后的病毒渦旋混勻后加入到V型96孔板中,之后加入等體積1%的紅細胞懸液,室溫靜置30 min,觀察并記錄V型96孔板中紅細胞的凝集效果。

1.9 神經氨酸酶抑制劑篩選實驗

通過神經氨酸酶抑制劑篩選試劑盒檢測化合物對NA活性的抑制作用。將70 μL NA緩沖液和10 μL NA溶液混合均勻,然后分別加入10 μL梯度稀釋的待測化合物,混合均勻后。加入10 μL顯色底物,混合均勻后室溫震蕩1 min,37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min,使用多功能酶標儀檢測激發(fā)波長322 nm和發(fā)射波長450 nm的熒光信號。根據熒光值計算化合物對NA活性的抑制作用。

1.10 ELISA檢測流感病毒感染巨噬細胞中IP-10表達量

巨噬細胞細胞以5 × 105個/孔的數量接種于12孔板中,將15、30、60 μmol/L三個濃度的FDE與100 TCID50的WSN共同作用細胞24 h,收集細胞上清,使用ELISA試劑盒檢測上清溶液中IP-10趨化因子的含量。

2 結果

2.1 FDE對流感病毒感染的MDCK細胞具有明顯的保護作用

研究發(fā)現(xiàn),FDE(見圖1)在6.25～100 μmol/L濃度范圍對WSN感染的MDCK細胞具有明顯的保護作用(見圖2A、2C),WSN感染MDCK細胞48 h,只加病毒的WSN組與未加病毒和FDE的對照組(control 1,Con 1)相比,細胞發(fā)生明顯病變,當用6.25～100 μmol/L的FDE與WSN共同作用時,細胞病變率顯著降低,其EC50為19.83±2.03 μmol/L,陽性藥奧司他韋(oseltamivir,OST)EC50為6.85±0.12 μmol/L,MTT法證實該化合物在該濃度范圍內對MDCK細胞活度幾乎沒有影響(見圖2B),CC50大于100 μmo/L。同時,噬斑實驗結果也證實了FDE的這一作用(見圖2D),WSN感染48 h后細胞大面積脫落形成較多空斑,未加WSN和FDE的對照組只有邊緣有部分細胞脫落,FDE治療組中空斑的數量隨藥物濃度的增加而減少。

圖1 Ferulaldehyde的化學結構Fig.1 The chemical structure of ferulaldehyde

圖2 FDE的抗流感病毒活性和對MDCK的細胞毒性Fig.2 The anti-influenza virus activity and cytotoxicity of MDCK cells of FDE注:A:與Con 1組比較,# # # P < 0.001;與WSN組比較,* * * P < 0.001;C:40×:于40倍光學倒置顯微鏡下拍攝。Note:A:Compared with the Con 1 group,# # # P < 0.001;Compared with the WSN group,* * * P < 0.001;C:40×:Photographed under a 40× optical inverted microscope.

2.2 FDE對流感病毒生命周期的影響

為了確定FDE作用于病毒感染受體細胞生命周期的哪一個階段,我們設計了加藥時間點實驗,分別在WSN感染的0～2、0～5、0～8、0～10 h時間段(見圖3A)進行FDE(60 μmol/L)處理,藥物作用時間分別覆蓋了病毒吸附、入核、復制和子代病毒釋放過程。免疫印記實驗結果(見圖3B)顯示,在該化合物作用的各時間段內,MDCK細胞內病毒NP蛋白的量與對照組(DMSO組:加入與FDE組等量WSN且加入了和FDE組所加藥物溶劑等量DMSO的對照組,DMSO)相比都具有不同程度的減少,在0～8 h內,FDE組與DMSO組和OST組相比NP蛋白的含量降低最為顯著。用250 TCID50的WSN感染MDCK細胞,在同樣給藥時間處理條件下,通過免疫熒光法顯示細胞內NP蛋白的定位從而追蹤病毒的活動(見圖3C),發(fā)現(xiàn)給藥2 h后,DMSO組和FDE組的病毒均可以吸附到宿主細胞上,FDE組病毒量略少于DMSO組。給藥5 h和8 h后,病毒進入細胞核進行復制,此時FDE組細胞核內的病毒量明顯少于DMSO組。而給藥8 h后,DMSO組中病毒依然大量復制并開始從細胞核輸出釋放到細胞質中,此時FDE組中感染病毒的細胞數量和細胞中的病毒量明顯要少,這也與免疫印跡結果相互印證,因此猜測該化合物可能抑制了流感病毒的復制。給藥10 h后,病毒大量從胞質釋放到細胞外,從免疫印跡的結果只能看出FDE組的病毒量顯著少于DMSO組,具體FDE對WSN的出胞是否有影響還需進一步研究。綜上可知,FDE對WSN的進入過程略有影響,但主要還是抑制了其復制過程。

圖3 FDE對流感病毒復制周期的影響Fig.3 Effects of FDE on replication cycle of influenza virus in cells注:B:與DMSO組比較,* * P < 0.01,* * * P < 0.001;C:60×:于60倍激光共聚焦顯微鏡下拍攝。Note:B:Compared with the DMSO group,* * P < 0.01,* * * P < 0.001;C:60×:Photographed under a 60× laser confocal microscope.

2.3 FDE對流感病毒HA和NA的影響

血凝素HA是流感病毒上的一種包膜蛋白,在病毒入侵細胞中起關鍵作用。成熟的HA由兩個亞基HA1和HA2組成。HA1主要介導病毒與細胞表面唾液酸受體的結合,HA2主要介導膜融合和vRNP脫殼過程。血凝素活性抑制實驗常用于確認藥物的作用靶點是否為HA1[15]。血凝素活性抑制試驗結果如圖所示(見圖4A),未加入WSN的對照組(control 2,Con 2),紅細胞沉降于孔底呈點狀,當加入以1:128倍稀釋的WSN后,紅細胞發(fā)生凝集在孔底平鋪呈網狀,而當有FDE和WSN共同作用時,100 μmol/L FDE處理能在一定程度上抑制紅細胞的凝集,25、50 μmol/L FDE有微弱的作用但并不顯著。結果表明,該化合物在高濃度時(100 μmol/L)可能會對流感病毒與宿主細胞的結合有一定的抑制作用,可能是通過與流感病毒的表面抗原HA1結合,抑制WSN的早期吸附過程,但濃度低于50 μmol/L其影響作用有限。

圖4 FDE對流感病毒HA和NA的影響Fig.4 Effect of FDE on influenza virus HA and NA

甲型流感病毒的子代病毒顆粒從細胞表面出芽后,病毒表面的神經氨酸酶能使病毒本身從細胞表面脫落,能切割細胞表面與糖結合的N-乙酰神經氨酸,釋放子代病毒,完成感染周期[16]。神經氨酸酶抑制實驗結果顯示(見圖4B),化合物FDE具有一定的抑制神經氨酸酶作用,且抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴關系。

2.4 FDE能與NP和NA功能域結合

為了進一步探索FDE與流感病毒的相互作用,我們用AutoDock進行分子對接,模擬FDE與NP和NA蛋白質氨基酸殘基之間的相互作用。FDE與NP蛋白分子對接結果顯示(見圖5A),FDE能以氫鍵與NP蛋白342位精氨酸(Arg342)、417位天冬酰胺(Asn417)結合,以Π-烷基作用(疏水作用力的一種)與419位賴氨酸(Pro419)結合,這3個位點剛好處于核定位信號(Nuclear localization signal,NLS3)320～400殘基和NP-NP結合區(qū)371～465殘基的區(qū)域之中[17]。另外有研究報道,Ile408、Pro410、Phe412、Val414和Pro419的疏水側鏈位于核蛋白尾環(huán)中,該處的環(huán)結合腔可能是小分子藥物的理想靶點,并且尾環(huán)的結構特征預計會干擾核蛋白的寡聚[18]。因此,說明FDE可能通過與NP蛋白的結合干擾NP蛋白的功能從而抑制病毒的復制。

圖5 FDE與NP(A)和NA(B)的分子對接結果Fig.5 Molecular docking results of FDE with NP(A) and NA(B)

FDE與NA蛋白分子對接結果顯示(見圖5B),FDE能以氫鍵與NA蛋白97位絲氨酸(Ser97)、247位絲氨酸(Ser247)、295位天冬酰胺(Asn295)結合,以Π-烷基作用(疏水作用力的一種)與106位纈氨酸(Val106)、110位異亮氨酸(Ile110)結合,以碳氫鍵與111位甘氨酸(Gly111)、112位絲氨酸(Ser112)結合。已有研究報道NA蛋白的247位的絲氨酸突變可能具有很高的抵抗流感病毒的作用[19]。因此,說明FDE很可能通過與NA蛋白的結合干擾流感病毒的出胞。

2.5 FDE能降低流感病毒感染的巨噬細胞的炎癥相關蛋白和趨化因子的表達

FDE曾被發(fā)現(xiàn)在LPS誘導的巨噬細胞炎癥模型中抑制NO的產生[20]。巨噬細胞在流感病毒感染后也會被激活并激發(fā)免疫反應,抵抗流感病毒的同時也可能造成機體的損傷。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶(COX-2)在炎癥發(fā)生中是影響NO和PGE2生成的關鍵酶,我們檢測發(fā)現(xiàn)FDE處理影響WSN感染的巨噬細胞中iNOS、COX-2(見圖6A)的表達,如圖所示,與Con 1(與結果2.1中對照設置方法一樣,也為未加WSN和FDE)相比,WSN感染后巨噬細胞中iNOS、COX-2表達顯著增加,而FDE處理劑量依賴性明顯抑制細胞中的iNOS和COX-2的表達。同時,我們還發(fā)現(xiàn),FDE還影響趨化因子IP-10的分泌(見圖6B)。WSN感染引起的巨噬細胞中IP-10表達量的增加可以被FDE有效的抑制,提示FDE還可能影響進一步的炎性細胞的招募聚集。

圖6 FDE治療對流感病毒感染的巨噬細胞的iNOS、COX-2蛋白和趨化因子IP-10的影響Fig.6 Effect of FDE treatment on iNOS,COX-2 protein and chemokine IP-10 in influenza virus-infected macrophages注:與Con 1組比較,# # # P < 0.001;與WSN組比較,* * * P < 0.001。Note:Compared with the Con 1 group,# # # P <0.001;Compared with the WSN group,* * * P <0.001.

3 討論與結論

我們從蜘蛛香和赤芍兩種藥材中都分離獲得了苯丙素類化合物FDE,含量分別為0.02%和0.012%,盡管苯丙素類成分并不是蜘蛛香和赤芍的主成分,但其在這兩種中藥的抗流感應用中很可能發(fā)揮了重要的作用,本研究就發(fā)現(xiàn)FDE具有顯著的抗流感病毒的作用。高濃度的FDE能夠影響紅細胞的凝集,提示其可能干擾流感病毒與受體細胞的結合,但其在低濃度時作用并不顯著。進入宿主細胞的流感病毒借助宿主細胞的多種元件進行轉錄和復制,病毒vRNP是流感病毒最基本的復制單位,是由病毒RNA和堿性聚合酶1(PB1)、堿性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)及核蛋白(NP)組成的復合體。vRNP通過運輸進入細胞核,并通過引物依賴的方式進行轉錄合成病毒mRNA,mRNA出核翻譯合成病毒蛋白[4]。通過加藥時間點實驗我們發(fā)現(xiàn)FDE可以降低病毒NP蛋白的生成,很可能干預了病毒的復制過程,分子對接結果顯示FDE確實可以與NP蛋白的活性位點結合,NP有可能是FDE的有效靶點,另外,我們通過神經氨酸酶活抑制實驗發(fā)現(xiàn)了FDE對NA活性的影響,分子對接實驗也支持這一結果,提示FDE很可能還抑制了流感病毒的出胞過程。此外,流感病毒本身并不是導致重癥及致死的關鍵,病毒導致的肺組織損傷或更加嚴重的急性呼吸窘迫綜合征是流感病毒尤其是高致病性流感病毒的高致病力和致死的主要原因[6]。我們檢測發(fā)現(xiàn)FDE可減弱流感病毒感染的巨噬細胞中iNOS、COX-2的表達,還抑制了病毒引起的巨噬細胞中IP-10的表達量,提示FDE還可能影響進一步的炎性細胞的招募聚集,降低炎性反應。以上結果說明FDE發(fā)揮抗流感病毒活性可能不止一個作用靶點,小分子化合物存在多個作用靶點有可能使其更高效和更不易產生耐藥現(xiàn)象,但也往往使其在體內的作用也更為復雜甚至可能有更多的毒副作用。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛香和赤芍中的苯丙素FDE在體外具有抗流感病毒活性。通過探索FDE對流感病毒的生命周期的影響,發(fā)現(xiàn)其抗流感機制主要是干擾了流感病毒的復制和釋放過程,流感病毒NP和NA蛋白很可能是它作用的靶點。同時,該化合物還能抑制由流感病毒引起的炎癥相關蛋白和趨化因子的表達,從而緩解病毒感染引起的機體的免疫損傷。