屈雅琴,張倩玉,談相云,鄭國華,2,邱振鵬,田先翔*

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點實驗室,武漢 430065

膽管癌(cholangiocarcinoma,CCA)根據(jù)解剖部位分為肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma)和肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)[1]。ICC雖僅占原發(fā)性肝癌的10%～20%[2,3],但早期隱匿性強,術(shù)后復(fù)發(fā)率高且預(yù)后較差。近幾十年,ICC在亞洲乃至全球發(fā)病率及死亡率穩(wěn)步上升[4,5],ICC晚期的一線化療方案長期使用易產(chǎn)生耐藥性和藥物不良反應(yīng)[5],因此需探尋安全有效的治療藥物。

從動植物中篩選具有抗腫瘤作用的天然藥物活性成分一直是國內(nèi)外研究熱點[6]。荷葉堿(nuciferine,NUF)來源于睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn的干燥葉,具有一定抗腫瘤細(xì)胞活性[7],但其對ICC細(xì)胞的作用鮮有報道。本研究探究了荷葉堿對HuCCT1細(xì)胞增殖及糖酵解過程的影響,初步探討其作用機制,為研發(fā)安全有效ICC治療藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞(系)HuCCT1購自上海信裕生物科技有限公司,用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 儀器

MCO-15AC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo 公司);CKX31型倒置顯微鏡、TC20型細(xì)胞計數(shù)器(日本Olympus公司);CFX96型實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)儀、Power Pac Basic型電泳儀、x Mark型全波長酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad 公司)。

1.3 藥品與試劑

荷葉堿(純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司,批號T25S11Z125833);胎牛血清(美國Gibco公司,批號42F2391K);青霉素和鏈霉素、RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone 公司,批號分別為J200044、AH29714276、J210005);細(xì)胞培養(yǎng)級DMSO試劑、乳酸含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號分別為401Q033、20200612);MTT試劑(合肥博美生物科技有限公司,批號K191422);結(jié)晶紫(美國Sigma 公司,批號SLBP0250V);葡萄糖檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號012522220712);二代逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成(含基因組DNA去除)試劑盒、通用型彩色示蹤qPCR Master Mix、兔源HIF-1α單克隆抗體(賽維爾生物科技有限公司,批號分別為MPC2202024、MPC2201066、GB11031);InvitrogenTMTRIzolTMRNA提取試劑、M-PERTM 哺乳動物蛋白抽提試劑、BCA 蛋白定量試劑盒、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液(美國Thermo Fisher Scientific公司,批號分別為15596018、Vl311347、VC294999、VC297103);蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(康為世紀(jì)科技有限公司,批號分別為01392、01385);鼠源β-actin抗體(Proteintech 公司,批號HRP-60008);兔源磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)單克隆抗體(英國abcam 公司,批號ab109268);兔源磷酸化蛋白激酶 B(p-AktThr308)單克隆抗體、mTOR單克隆抗體、磷酸化真核翻譯抑制蛋白1(p4EBP1)單克隆抗體、己糖激酶2(HK2)單克隆抗體、丙酮酸激酶2(PKM2)單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔Ig G二抗(美國 CST 公司,批號分別為13038、2983、2855、2867、4053、7074)。

1.4 荷葉堿母液配制

精密稱取35.44 mg荷葉堿,溶于1 mL DMSO,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,得到濃度為120 mmol/L荷葉堿母液,分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前使用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.5 MTT比色法檢測細(xì)胞存活率

細(xì)胞以5×103個每孔接種于96孔板,設(shè)置空白組(只含培養(yǎng)基)、給藥組,于培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后,棄培養(yǎng)液,并分別加入等量不同濃度(0、10、20、40、60、100、200、400 μmol/L)的荷葉堿,空白組給予等體積培養(yǎng)基,每組設(shè)6個平行孔。給藥24、48 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,后棄上清,每孔加入150 μL DMSO,于570 nm波長處檢測吸光度,并按照公式(1)計算細(xì)胞存活率。

(1)

1.6 平板克隆實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力

細(xì)胞以1×103個/孔接種于6孔板,設(shè)置對照(control,Con)組和NUF低、中、高劑量(30、60、120 μmol/L)給藥組,待其貼壁后每2 d換一次液,給藥處理10 d后棄培養(yǎng)液,PBS清洗3次,4%多聚甲醛溶液固定15 min,0.5%結(jié)晶紫溶液染色30 min,并用Image J軟件進行細(xì)胞集落計數(shù)。

1.7 細(xì)胞葡萄糖消耗及乳酸生成水平檢測

細(xì)胞正常接種于直徑為5 cm的培養(yǎng)皿中,待其生長至對數(shù)生長期時,按“1.6”項下分組給藥處理細(xì)胞。24 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,同時將細(xì)胞消化、計數(shù),并按試劑盒說明書進行操作,分別測定630、570 nm處各組吸光度值,計算葡萄糖消耗量和單位細(xì)胞乳酸生成量。

1.8 荷葉堿治療ICC的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.8.1 荷葉堿作用靶點獲取

借助PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得荷葉堿的SMILE號和InChI號,并于Swiss Target Prediction (http://swisstargetprediction.ch/)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)收集荷葉堿相關(guān)靶點。

1.8.2 與ICC治療有關(guān)靶點獲取

于Gene Cards(http://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org)和治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/),以“intrahepatic cholangiocarcinoma”為疾病關(guān)鍵詞,收集肝內(nèi)膽管癌相關(guān)靶點。

1.8.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

借由Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)對靶點進行基因名轉(zhuǎn)換,去除重復(fù)項,并對化合物和疾病作用靶點取交集,得到二者交集靶點。交集靶點導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,種屬選擇“Homo sapiens”,最低置信度為0.4,隱藏?zé)o相互作用的節(jié)點,并將其分析結(jié)果所屬的TSV文件導(dǎo)入至Cytoscape3.9.1軟件進一步修飾,并利用Analyze Network網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù),度值(degree)、緊密中心性(closeness centrality)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)篩選核心靶點。

1.8.4 GO生物功能注釋和KEGG通路富集分析

利用Metascape (https://metascape.org/gp)數(shù)據(jù)庫,對隱藏?zé)o相互作用后的交集靶點進行基因本體 (gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyotoencyclopedoa of genes and genomes,KEGG)功能富集分析,并利用微生信在線平臺(http://www.Bioinformatics.com.cn/)將富集結(jié)果繪制成柱狀圖及氣泡圖。

1.9 RT-qPCR法檢測細(xì)胞HIF-1α及HK2、PKM2 mRNA表達(dá)

細(xì)胞以2×106個每孔接種于6孔板,細(xì)胞分組及給藥濃度同“1.6”項。細(xì)胞處于對數(shù)生長期時收集細(xì)胞,并采用TRIZol試劑抽提細(xì)胞RNA,測定RNA濃度和純度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以其為模板,β-actin為內(nèi)參,用PCR儀進行擴增,每個基因重復(fù)三次試驗,每組3個復(fù)孔,最后以2-ΔΔCt法計算相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。主要引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.10 Western blot法檢測細(xì)胞糖酵解及Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

收集經(jīng)不同濃度NUF(0、30、60、120 μmol/L)處理24 h后的細(xì)胞,4 ℃充分裂解后,提取細(xì)胞總蛋白,并采用BCA法進行蛋白定量。取30 μg細(xì)胞蛋白凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂牛奶封閉1 h,一抗1∶1 000于4 ℃孵育過夜后,TBST洗膜,二抗1∶10 000室溫孵育1 h,TBST清洗3次,每次10 min,均勻滴加等量ECL發(fā)光液后,于成像系統(tǒng)顯影。結(jié)果用Image J軟件進行分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 荷葉堿抑制人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HuCCT1增殖

MTT檢測結(jié)果顯示,不同濃度NUF(0～400 μmol/L)處理HuCCT1細(xì)胞24 h及48 h后,細(xì)胞存活率顯著降低(見圖1)。

圖1 荷葉堿對HuCCT1細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of NUF on the survival rate

當(dāng)以30 μmol/L NUF處理細(xì)胞48 h時,細(xì)胞存活率降至約90%,其它各組細(xì)胞存活率均降低,其中400 μmol/L NUF作用最強,細(xì)胞存活率降至約25%。

克隆形成實驗結(jié)果顯示,與Con組相比,不同濃度荷葉堿處理后,細(xì)胞集落形成數(shù)目顯著降低(P<0.05、0.01)(見圖2)。

圖2 荷葉堿對HuCCT1細(xì)胞集落形成能力的影響Fig.2 Effect of NUF on colony formation of HuCCT1

2.2 荷葉堿降低HuCCT1細(xì)胞糖酵解代謝物葡萄糖消耗及乳酸生成量

與Con組相比,60、120 μmol/L NUF可以減少HuCCT1細(xì)胞葡萄糖消耗量(P<0.05)。30、60、120 μmol/L NUF均可顯著降低HuCCT1細(xì)胞乳酸生成量(P<0.05,0.01)(見圖3)。

圖3 荷葉堿對HuCCT1細(xì)胞糖酵解代謝產(chǎn)物的影響Fig.3 Effect of NUF on glycolytic metabolites of HuCCT1

2.3 荷葉堿治療肝內(nèi)膽管癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 荷葉堿治療肝內(nèi)膽管癌作用靶點

Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出Probability大于0.1的有100個,TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到27個,BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫篩選得到164個。由3個疾病數(shù)據(jù)庫Gene Cards、OMIM、TTD依次篩選出1 593、44、4個作用靶點。去重后,分別得到荷葉堿作用相關(guān)靶點282個,肝內(nèi)膽管癌相關(guān)靶點1 546個,二者交集靶點共52個。

2.3.2 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

荷葉堿治療肝內(nèi)膽管癌靶點的網(wǎng)絡(luò)(見圖4)中,包含了50個節(jié)點(2個節(jié)點與其他節(jié)點無相互作用),300條邊。該網(wǎng)絡(luò)度值的中位數(shù)為11,緊密度的中位數(shù)為0.515 789,介數(shù)中位數(shù)為0.005 948,圖中節(jié)點個頭越大、顏色越深代表其在該網(wǎng)絡(luò)中的度值越大,由上述3個拓?fù)鋮?shù)篩選出與該網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)度最高的15個關(guān)鍵靶點(見表2),主要與葡萄糖代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長等有關(guān)。

圖4 荷葉堿治療肝內(nèi)膽管癌的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein-protein interaction network diagram of NUF against intrahepatic cholangiocarcinoma

表2 荷葉堿治療肝內(nèi)膽管癌關(guān)鍵靶點及拓?fù)鋮?shù)Table 2 Key targets and topological parameters of NUF against intrahepatic cholangiocarcinoma

2.3.3 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果

通過Metascape數(shù)據(jù)庫,以P<0.01為條件,共得到1 054條GO功能富集條目,按P值由小到大排列,篩選排名前10的結(jié)果繪制柱形圖。結(jié)果顯示,NUF參與并調(diào)控ICC細(xì)胞眾多生理生化過程,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞運動、激酶活性等(如圖5)。KEGG篩選出109條通路,同樣P值按由小到大排序,再結(jié)合文獻(xiàn)進一步篩選出與肝內(nèi)膽管癌相關(guān)的主要通路20條。富集氣泡圖(見圖6)顯示其主要涉及調(diào)控磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、鈣信號、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)等信號通路與動脈粥樣硬化病理過程。

圖5 荷葉堿治療肝內(nèi)膽管癌的潛在作用靶點GO功能富集分析Fig.5 GO terms of NUF against intrahepatic cholangiocarcinoma

圖6 荷葉堿治療肝內(nèi)膽管癌的潛在作用靶點KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway of NUF against intrahepatic cholangiocarcinoma

2.4 荷葉堿對HuCCT1細(xì)胞HIF-1α及HK2、PKM2 mRNA水平的影響

與Con組相比,中、高濃度(60、120 μmol/L)NUF組細(xì)胞HIF-1α、HK2、PKM2的mRNA水平顯著降低(P<0.05,0.01)(見表3)。

表3 荷葉堿對HuCCT1細(xì)胞HIF-1α及糖酵解相關(guān)基因HK2、PKM2 mRNA水平的影響Table 3 Effect of NUF on the mRNA levels of HIF-1α and glycolysis-related genes HK2 and PKM2 in HuCCT1 cells

2.5 荷葉堿對HuCCT1細(xì)胞糖酵解及Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá)的影響

與Con組相比,不同濃度(30、60、120 μmol/L)NUF處理后HuCCT1細(xì)胞HIF-1α、HK2、PKM2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01,0.001)。120 μmol/L NUF處理后的HuCCT1細(xì)胞p-mTOR、p-4EBP1表達(dá)量相較30、60 μmol/L處理組降低更顯著,而p-AktThr308表達(dá)量則在120 μmol/L NUF處理后略微上調(diào)(P<0.05,0.01,0.001)(見圖7)。

圖7 荷葉堿對HuCCT1細(xì)胞糖酵解及Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of NUF on the expression of glycolysis and Akt/mTOR signaling pathway related proteins in HuCCT1

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,荷葉中提取的活性成分荷葉堿對肝癌[8]、肺癌[9]、乳腺癌[10]等多種腫瘤細(xì)胞[11-13]均表現(xiàn)出一定的抗生長作用,并能提高其對化療藥物的敏感性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的荷葉堿能明顯抑制體外HuCCT1細(xì)胞增殖,且與降低葡萄糖消耗與乳酸生成呈一定正相關(guān)。糖類是細(xì)胞生命活動中的重要供能物質(zhì),瓦氏效應(yīng)(Warburg effect)表明:即使在氧含量正常狀態(tài)下,癌細(xì)胞也會優(yōu)先通過糖酵解作用而非有氧代謝途徑供能[15]。高水平的糖酵解可為癌細(xì)胞的生長快速供能,其產(chǎn)物如丙酮酸和乳酸,亦為癌細(xì)胞物質(zhì)合成提供原料,并促進癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。故推測荷葉堿抑制HuCCT1細(xì)胞的增殖與其抑制細(xì)胞糖酵解代謝有關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)荷葉堿與HIF-1α和TNF、INS、EGFR等靶點關(guān)聯(lián)度較高。HIF-1α參與腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)等多個環(huán)節(jié)[16,17],能激活葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)及多種糖酵解酶如HK2、PKM2、丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)的活性進而直接參與糖酵解過程[18],極大地促進了腫瘤進展。己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)是糖酵解過程中較為關(guān)鍵的2種激酶,分別調(diào)控糖酵解過程的初始和結(jié)尾階段。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞HIF-1α及糖酵解關(guān)鍵酶HK2、PKM2的mRNA水平和蛋白表達(dá)均隨荷葉堿濃度的升高而逐漸降低,故推測荷葉堿可能通過降低HIF-1α的活性進而影響HuCCT1細(xì)胞糖酵解過程。

HIF-1是細(xì)胞應(yīng)對低氧或缺氧環(huán)境而做出反應(yīng)的一類轉(zhuǎn)錄因子,由HIF-1α和 HIF-1β兩個亞單位組成。HIF-1α的脯氨酸殘基在常氧環(huán)境下易受到羥基化,并與其調(diào)節(jié)子(von hippel-lindau,pVHL)結(jié)合,之后被泛素化而降解。而在低氧環(huán)境下,脯氨酰4-羥化酶結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(prolyl hydroxylase domain-containing proteins,PHD)活力降低,使HIF-1α大量累積,隨后移位至細(xì)胞核與HIF-1β形成二聚體,二聚體繼而與低氧反應(yīng)元件(hypoxic response element,HRE)結(jié)合以促進HIF-1靶基因的轉(zhuǎn)錄[19]。此外,HIF-1α還可被不依賴于氧氣的方式激活,例如PI3K/Akt/mTOR信號級聯(lián)反應(yīng)可通過破壞真核翻譯起始因子4E(eIF4E)結(jié)合蛋白1(4EBP1)的完整性,上調(diào)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄和翻譯[16]。有學(xué)者將這種與氧氣無關(guān)的HIF-1α信號的激活機制稱為“假性缺氧”[20]。本研究中,KEGG分析發(fā)現(xiàn)荷葉堿作用于ICC的潛在通路中,PI3K/Akt信號通路顯著性較高,免疫印跡發(fā)現(xiàn)荷葉堿可降低HuCCT1細(xì)胞mTOR、4EBP1蛋白的磷酸化水平,p-AktThr308蛋白整體呈下降趨勢,提示荷葉堿下調(diào)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平可能與抑制Akt/mTOR/4EBP1信號通路有關(guān)。

多項研究指出荷葉堿除了能體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制侵襲和轉(zhuǎn)移并將其阻滯至不同周期外,還能延緩裸鼠異位移植瘤的生長,發(fā)揮顯著抗腫瘤作用。主要機制與荷葉堿調(diào)節(jié)周期及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[8]、直接靶向特定基因[9]、抑制信號通路如PI3K-Akt[11]、Wnt/β-catenin[21]、SOX2-Akt與STAT3[12]及TLR4/NF-κB[13]等有關(guān)。而本研究初步發(fā)現(xiàn)荷葉堿抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖,可能是通過抑制Akt/mTOR/4EBP1信號級聯(lián)通路調(diào)控的細(xì)胞糖酵解過程而發(fā)揮作用,二者間的內(nèi)在邏輯關(guān)系將在下一步研究中展開探索,以期闡明荷葉堿的抗ICC機制,為深度開發(fā)荷葉資源和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。