王 馨，尹光耀，張志飛，陳 穎，劉珊瑚，滿金輝，石 玥，黃鈺瑩，張曉芹，王曉暉，魏勝利

? 藥材與資源 ?

北柴胡特異DNA條形碼篩選及種質(zhì)資源鑒定

王 馨1，尹光耀1，張志飛1，陳 穎1，劉珊瑚1，滿金輝1，石 玥1，黃鈺瑩1，張曉芹1，王曉暉2*，魏勝利1*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究院，北京 100029

基于北柴胡葉綠體基因組篩選特異性DNA條形碼，并利用特異DNA條形碼鑒定不同產(chǎn)地北柴胡種質(zhì)資源。利用Illumina HiSeq X Ten平臺對北柴胡進行葉綠體基因組測序，利用mVISTA軟件和核酸多樣性分析篩選特異性片段，基于特異性片段進一步分析不同產(chǎn)區(qū)北柴胡樣品單倍型。不同產(chǎn)地3份北柴胡葉綠體基因組全長為155 557～155 959 bp，均呈現(xiàn)典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，均編碼131個基因。、、、可以作為潛在的北柴胡種質(zhì)資源鑒定的特異性DNA條形碼?；跀U增效率，選擇和對來自4省7個產(chǎn)地177份北柴胡樣品進行序列分析，結(jié)果表明和分別有91和78個變異位點，分別鑒定到28、29個單倍型；兩段序列聯(lián)合分析形成40個單倍型（Hap1～Hap40），各單倍型的遺傳距離為0～0.022。6個產(chǎn)地?fù)碛刑赜袉伪缎?，可以將不同產(chǎn)地的北柴胡種質(zhì)資源進行區(qū)分。利用比較葉綠體基因組學(xué)篩選的特異DNA條形碼和可以用于北柴胡種內(nèi)種質(zhì)資源鑒定，為后續(xù)鑒定北柴胡的產(chǎn)地來源、種質(zhì)資源保護利用和育種等工作奠定基礎(chǔ)。

北柴胡；葉綠體基因組；序列對比；種質(zhì)資源；DNA條形碼

柴胡具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣之功效，是最常用的大宗藥材之一?！吨袊幍洹?020年版[1]規(guī)定柴胡為傘形科柴胡屬藥用植物北柴胡DC.或狹葉柴胡（紅柴胡）Willd.的干燥根。北柴胡是中藥柴胡的主要來源，現(xiàn)代藥理學(xué)作用研究表明其具有多種藥理活性，如解熱、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎保肝、抗病毒、抗腫瘤和正向調(diào)節(jié)免疫等功能[2-8]。因此對北柴胡進行種質(zhì)資源鑒別，對于北柴胡的質(zhì)量控制、安全合理利用及開展相關(guān)的研究具有重要意義。

葉綠體是一種擁有自身遺傳物質(zhì)的多功能細(xì)胞器，葉綠體基因組與核基因組和線粒體基因組相比，依賴母系遺傳，相對分子質(zhì)量較小，基因組成和結(jié)構(gòu)相對保守，葉綠體基因組包含的大量遺傳信息被廣泛應(yīng)用于植物分子進化及系統(tǒng)發(fā)育的研究[9-10]。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，多種植物的葉綠體基因組已經(jīng)解析。目前柴胡屬的北柴胡、紫花闊葉柴胡H. Wolff、竹葉柴胡Wall. ex DC.、紅柴胡、長莖柴胡Wall. ex DC.等[11-15]物種的葉綠體基因組已有研究報道，但是種內(nèi)葉綠體比較基因組學(xué)相關(guān)研究鮮有報道。

DNA條形碼是有關(guān)物種鑒定的新技術(shù)，通過用標(biāo)準(zhǔn)化的、較短的DNA序列作為條形碼，實現(xiàn)對物種進行快速、準(zhǔn)確的鑒定[16]，是傳統(tǒng)性狀鑒定和理化鑒定方法的有效補充。如能夠鑒別大黃不同基原及混偽品[17]；而、、、等條形碼為柴胡屬植物的分類鑒定與系統(tǒng)學(xué)研究提供了重要依據(jù)[18]。隨著葉綠體基因組測序技術(shù)和葉綠體比較基因組學(xué)的發(fā)展，通過比較葉綠體基因組序列差異獲得不同物種或不同基原的特異DNA條形碼也變得切實可行，如利用葉綠體基因組及比較基因組學(xué)方法獲得鑒定唐古特大黃、藥用大黃和掌葉大黃的特異性條形碼為、、、以及L[19]?；谌~綠體基因組測序和比較基因組學(xué)獲得黃芩的突變位點最多的3個特異DNA條形碼、、，利用3段葉綠體基因組DNA的聯(lián)合分析對黃芩的野生居群展開研究，共發(fā)現(xiàn)29個變異位點，形成50個單倍型[20]。但是目前基于北柴胡葉綠體比較基因組學(xué)的特異DNA條形碼研究還未見報道，因此本研究選取不同產(chǎn)地的3個北柴胡樣品進行葉綠體測序，進行比較基因組學(xué)研究，篩選特異性DNA條形碼，并利用篩選的特異DNA條形碼對4省7產(chǎn)地177份北柴胡樣品進行種質(zhì)資源鑒定，為后續(xù)北柴胡種質(zhì)篩選、質(zhì)量控制及相關(guān)的研究奠定基礎(chǔ)。

1. 材料與儀器

1.1 材料

用于葉綠體全基因組測序的北柴胡樣品分別采自遼寧省朝陽市、陜西省寶雞市和河南省洛陽市（表1）；用于種質(zhì)資源鑒定的7個產(chǎn)地177份樣品來源及單倍型分布如表2所示。所用樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)魏勝利教授鑒定為北柴胡DC.。

1.2 儀器

GL-88B型渦旋器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HH-S4A型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；TGL-16型冷凍高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；NanoDrop one型超微量分光光度計（Thermo Fisher）；JY300E型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；WD-9413B型凝膠成像儀（北京六一生物科技有限公司）。

表1 北柴胡葉綠體全基因組測序樣品來源

Table 1 Source of chloroplast whole genome sequencing samples from B. chinense

名稱采集地點經(jīng)度（E）緯度（N）海拔/m 北柴胡1遼寧省朝陽市朝陽縣臺子鎮(zhèn)孫丈子村120°16'46.44"41°40'91.13" 753 北柴胡2陜西省寶雞市106°18'00.00"33°35'00.00" 813 北柴胡3河南省洛陽市嵩縣車村鎮(zhèn)龍池峰村112°43'44.68"34°63'04.10"1539

表2 7個產(chǎn)地177份北柴胡樣品來源及單倍型分布

Table 2 Source and haplotype distribution of 177 samples of B. chinense from seven regions

編號樣品來源單倍型類型（數(shù)量） HNLY1～HNLY28河南省洛陽市Hap1(11)、Hap2(11)、Hap3(3)、Hap4(1)、Hap5(1)、Hap6(1) HBQHD1～HBQHD23河北省秦皇島市Hap7(9)、Hap8(9)、Hap9(2)、Hap10(2)、Hap11(1) SXLFHM1～SXLFHM53山西省臨汾市侯馬市Hap2(3)、Hap5(4)、Hap6(1)、Hap12(1)、Hap13(1)、Hap14(8)、Hap15(1)、Hap16(6)、Hap17(7)、Hap18(3)、Hap19(5)、Hap20(2)、Hap21(2)、Hap22(1)、Hap23(1)、Hap24(1)、Hap25(1)、Hap26(1)、Hap27(3)、Hap28(1) SXXZ1～SXXZ9山西省新絳縣西莊村Hap17(2)、Hap24(1)、Hap29(1)、Hap30(1)、Hap31(2)、Hap32(1)、Hap33(1) SXGJ1～SXGJ4山西省新絳縣古交村Hap17(1)、Hap27(1)、Hap30(1)、Hap34(1) SXBJ1～SXBJ18陜西省寶雞市Hap1(1)、Hap2(1)、Hap5(1)、Hap12(2)、Hap19(1)、Hap30(2)、Hap31(1)、Hap32(2)、Hap34(1)、Hap35(3)、Hap36(1)、Hap37(1)、Hap38(1) SXSL1～SXSL42陜西省商洛市商州區(qū)代街村Hap1(22)、Hap2(16)、Hap5(1)、Hap14(1)、Hap39(1)、Hap40(1)

2 方法

2.1 基因組DNA提取與測序

利用FastPure?Plant DNA Isolation Mini Kit（諾唯贊）提取植物總DNA，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，超微量分光光度計檢測DNA濃度。檢測合格的基因組總DNA構(gòu)建插入片段長度約350 bp的文庫，利用Illumina HiSeq X Ten平臺進行序列讀長為150 bp的雙端測序，并對原始序列進行4步處理，分別是去除質(zhì)量值連續(xù)≤20的堿基數(shù)達(dá)到40%的reads、去除含N的堿基數(shù)目總和達(dá)到10%的reads、去除adapter污染和去除duplication污染，得到高質(zhì)量待分析序列（clean reads）。

2.2 葉綠體基因組組裝、拼接和注釋

使用NOVOPlasty將待分析序列組裝成完整的葉綠體基因組，采用PGA軟件進行組裝結(jié)果進行注釋（默認(rèn)參數(shù)）。采用BWA將待分析序列比對北柴胡參考基因組（NC_046774）的葉綠體基因組序列，利用在線軟件tRNAscan-SE（http://lowelab. ucsc.edu/tRNAscan-SE/)確定所有tRNA基因的邊界，并通過CLC Sequence Viewer 8人工檢查確保組裝無誤。利用Organellar Genome DRAW（https:// chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw. html）在線繪制葉綠體全基因組圖譜。

2.3 重復(fù)序列分析

利用REPuter（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld. de/reputer）檢測葉綠體全基因組序列中的分散重復(fù)序列，參數(shù)設(shè)置為最小重復(fù)序列長度為30 bp，重復(fù)序列間的相似度＞90%。串聯(lián)重復(fù)序列利用Tandem repeats finder軟件（https://tandem.bu.edu/ trf/trf.html）進行檢測，參數(shù)選擇默認(rèn)值。利用MISA軟件（http://pgrc.ipk- gatersleben.de/misa/）檢測簡單重復(fù)序列位點類型與數(shù)目，對于單、二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)的最小值分別設(shè)置為10、5、4、3、3和3，2個SSR之間最小距離設(shè)置為100 bp。

2.4 葉綠體基因組比較分析

利用mVISTA在線軟件對測序獲得3份葉綠體基因組進行全局比對分析，利用Dna SP 6軟件檢測3條葉綠體基因組的核苷酸多樣性（nucleotide polymorphism，P）。

2.5 高變區(qū)域擴增、遺傳距離分析與進化樹構(gòu)建

為利用高變區(qū)基因?qū)Σ煌a(chǎn)區(qū)的種質(zhì)資源進行分析，以高變區(qū)基因為模板設(shè)計引物，對收集到的7個產(chǎn)區(qū)177份樣品進行PCR擴增分析。PCR混合體系共50 μL，包括ddH2O 37 μL，10×Buffer 5 μL,dNTP 4 μL，引物-F 1 μL，引物-R 1 μL，DNA模板0.5 μL，0.1%BSA 1 μL，TaKaRa Taq 0.5 μL。擴增程序為93 ℃、3 min，50 ℃、2 min，30個循環(huán)（93 ℃、30 s，44.4或36.8 ℃、45 s，70 ℃、45 s），70 ℃、5 min，4 ℃保存，同時根據(jù)不同的引物設(shè)定不同的退火溫度（表3）。通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和FastPure?Gel DNA Extraction Mini Kit（諾唯贊）對PCR產(chǎn)物進行純化，純化后的產(chǎn)物送北京六合華大公司進行雙向測序。

利用DNAMAN和Chromas軟件對測序結(jié)果進行核對和單倍型匯總。將匯總后的單倍型序列通過mafft軟件進行比對。比對后的序列通過MEGA X軟件計算單倍型間的遺傳距離，構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)進化樹，設(shè)置bootstrap重復(fù)值為1000。

表3 北柴胡2個基因引物信息

Table 3 Primer information of two genes of B. chinense

基因名引物名稱堿基序列退火溫度/℃ petN_psbMpetN_psbM-F5’-AGGTACTACGAATTGATTGAGGAATC-3’44.4 petN_psbM-R5’-TTAATTTTAATTAATGTTTACTTCTG-3’ ndhF_rpl32ndhF_rpl32-F5’-AAAAAAAGTTTTTTTTCTTAATTAAT-3’36.8 ndhF_rpl32-R5’-TTTAAAATGAAGAGGTTACTCGTTG-3’

3 結(jié)果與分析

3.1 葉綠體全基因組測序、序列組裝與拼接注釋

將北柴胡1、北柴胡2和北柴胡3的測序結(jié)果過濾去除低質(zhì)量序列和接頭序列等雜質(zhì),分別得到30 038 384條（4.50 Gb）、29 684 332條（4.45 Gb）和27 841 256條（4.18 Gb）clean reads。將3份北柴胡葉綠體全基因組組裝拼接后均得到完整的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，序列總長度分別為155 557、155 959和155 959 bp。環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)由1個大單拷貝區(qū)（large single copy area，LSC）、1個小單拷貝區(qū)（small single copy region，SSC）和2個反向重復(fù)區(qū)（inverted repeat regions，IRA和IRB）組成，其中LSC長度分別為85 431、85 831、85 831 bp，SSC長度均為17 546 bp，IRs長度分別為26 290、26 291和26 291 bp（圖1）。北柴胡2和北柴胡3的葉綠體全基因組序列及LSC、SSC和IRs的GC含量均相同，分別為37.68%、35.80%、31.48%和42.81%。北柴胡1的葉綠體全基因組序列及LSC、SSC和IRs的GC含量依次為37.69%、35.83%、31.43%和42.81%（表4）。

外圈基因逆時針轉(zhuǎn)錄，內(nèi)圈基因順時針轉(zhuǎn)錄；彩色條表示不同的功能組；內(nèi)圈較深的灰色區(qū)域表示GC含量，而較淺的灰色對應(yīng)于基因組的AT含量。LSC-大單拷貝區(qū) SSC-小單拷貝區(qū)域 IRA和IRB-反向重復(fù)區(qū)

表4 3份北柴胡的葉綠體基因組特征概述

Table 4 Summary of chloroplast genome characteristics of three B. chinense

樣本全基因組LSCSSCIRsCDS 長度/bp(G＋C)/%長度/bp(G＋C)/%長度/bp(G＋C)/%長度/bp(G＋C)/%長度/bp(G＋C)/% 北柴胡1155 55737.6985 43135.8317 54631.4352 58042.8177 79338.20 北柴胡2155 95937.6885 83135.8017 54631.4852 58242.8177 79338.21 北柴胡3155 95937.6885 83135.8017 54631.4852 58242.8177 79338.21

3個不同產(chǎn)地的北柴胡葉綠體全基因組序列都注釋了131個基因（表5），包括86個蛋白質(zhì)編碼基因、37個tRNA基因和8個rRNA基因。其中，SSC區(qū)含有11個蛋白質(zhì)編碼基因（、、、、、、、、、和）和1個tRNA（）；有17個基因分別在2個IR區(qū)出現(xiàn)1次，包含6個蛋白質(zhì)編碼基因（、、、、和），7個tRNA（、、、、、和）和4個rRNA（、、和）；LSC區(qū)含有61個蛋白質(zhì)編碼基因和22個tRNA。此外，蛋白質(zhì)編碼基因和分別橫跨LSC/IRb邊界和SSC/IRA邊界。含1個內(nèi)含子的基因有16個（、、、、、、、、、、、、、、和），含2個內(nèi)含子的基因有2個（和）。

表5 3份北柴胡葉綠體基因組的基因組成

Table 5 Gene composition of chloroplast genomes of three B. chinense

類別基因群基因名稱 光合系統(tǒng)基因光系統(tǒng)IpsaA、psaB、psaC、psaI、psaJ 光系統(tǒng)IIpsbA、psbB、psbC、psbD、psbE、psbF、psbH、psbI、psbJ、psbK、psbL、psbM、psbN、psbT、psbZ NADH脫氫酶ndhA*、ndhB*(2)、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK 細(xì)胞色素b/f復(fù)合體petA、petB*、petD*、petG、petL、petN ATP合成酶atpA、atpB、atpE、atpF*、atpH、atpI 二磷酸核酮糖羧化酶大亞基rbcL 遺傳系統(tǒng)基因核糖體蛋白大亞基rpl14、rpl16*、rpl2*(2)、rpl20、rpl22、rpl23(2)、rpl32、rpl33、rpl36 核糖體蛋白小亞基rps11、rps12、rps12*(2)、rps14、rps15、rps16*、rps18、rps19、rps2、rps3、rps4、rps7(2)、rps8 RNA聚合酶rpoA、rpoB、rpoC1*、rpoC2 核糖體RNArrn16(2)、rrn23(2)、rrn4.5(2)、rrn5(2) 轉(zhuǎn)運RNAtrnA-UGC*(2)、trnC-GCA、trnD-GUC、trnE-UUC、trnF-GAA、trnG-GCC、trnG-UCC*、trnH-GUG、trnI-CAU(2)、trnI-GAU*(2)、trnK-UUU*、trnL-CAA(2)、trnL-UAA*、trnL-UAG、trnM-CAU、trnN-GUU(2)、trnP-UGG、trnQ-UUG、trnR-ACG(2)、trnR-UCU、trnS-GCU、trnS-GGA、trnS-UGA、trnT-GGU、trnT-UGU、trnV-GAC(2)、trnV-UAC*、trnW-CCA、trnY-GUA、trnfM-CAU 其他基因成熟酶matK 蛋白酶clpP** 胞膜蛋白cemA 乙酰輔酶A羧化酶accD 細(xì)胞色素C合成酶ccsA 翻譯起始因子infA 未知功能基因假定葉綠體開放性閱讀框ycf1、ycf2(2)、ycf3**、ycf4

*-含有1個內(nèi)含子的基因**-含有2個內(nèi)含子的基因 (2)-有2個拷貝的基因

*-genes with one intron**-genes with two introns (2)-genes with two copies

3.2 重復(fù)序列分析

不同產(chǎn)地的北柴胡樣品葉綠體全基因組序列中北柴胡1發(fā)現(xiàn)66條分散重復(fù)序列，北柴胡2和北柴胡3均發(fā)現(xiàn)75條分散重復(fù)序列。其中北柴胡2和北柴胡3包括29條正向重復(fù)（forward repeats）、12條反向重復(fù)（reverse repeats）、29條回文重復(fù)（palindromic repeats）和5條互補重復(fù)（complement repeats）；北柴胡1包括30條正向重復(fù)、4條反向重復(fù)、28條回文重復(fù)和4條互補重復(fù)序列（圖2）。同時檢測到3份北柴胡樣品中長度為9～49 bp、重復(fù)次數(shù)為2～4次的串聯(lián)重復(fù)序列分別為37、38和38條。對不同產(chǎn)地北柴胡樣品的葉綠體全基因組簡單重復(fù)序列（SSR）的數(shù)量、類型及其在葉綠體基因組中的分布情況分析顯示，SSRs主要分布于葉綠體基因組的LSC區(qū)（71.83%～72.31%）和非編碼的基因間區(qū)序列中。編碼基因序列總長度占葉綠體全基因組的49.88%～50.00%，而編碼基因序列中分布的SSRs數(shù)量僅占其總數(shù)的15.38%～15.49%（表6、7）。

圖2 3份北柴胡葉綠體基因組中重復(fù)序列的數(shù)量

3.3 比較基因組學(xué)分析

為檢測3份北柴胡葉綠體基因組的種內(nèi)變異情況，以注釋過的北柴胡樣本葉綠體基因組（NC_046774）為參考，利用mVISTA在線軟件將獲得的其余3個葉綠體基因組進行全局對比（圖3）。結(jié)果顯示，葉綠體基因組序列中蛋白編碼區(qū)域變異低于非編碼區(qū)變異，且IRs區(qū)變異明顯小于其他LSC區(qū)和SSC區(qū)。此外，絕大多數(shù)基因的相似度在90%以上，rRNA基因（、、、）高度保守沒有變異?；騾^(qū)、、、和基因間區(qū)、、、、、等基因有不同程度的變異。同時，對3份北柴胡樣品的P進行分析顯示種內(nèi)變異度較小，P值范圍為0～0.017 78，LSC、SSC和IRs區(qū)的平均P值分別為0.001 32、0.001 63和0.000 24，與mVISTA分析結(jié)果一致（圖4）。基因區(qū)（0.008 89）和基因間區(qū)（0.006 67）、0.017 78）、（0.006 67）的P值較高。綜上可知，北柴胡種內(nèi)基因的保守程度很高，基因間區(qū)變異程度高于基因區(qū)，結(jié)合mVISTA和P結(jié)果，顯示基因區(qū)和基因間區(qū)、、可作為潛在的分子高變區(qū)域。

表6 SSRs在3份北柴胡葉綠體基因組中的分布

Table 6 Distribution of SSRs in chloroplast genomes of three B. chinense

樣本SSRs總量SSRs數(shù)量（占比/%） LSCIRsSSCCDS 北柴胡16547（72.31）17（26.15）1（1.54）10（15.38） 北柴胡27151（71.83）16（22.54）4（5.63）11（15.49） 北柴胡37151（71.83）16（22.54）4（5.63）11（15.49）

表7 3份北柴胡葉綠體基因組中SSRs種類及其數(shù)量

Table 7 Types and numbers of SSRs in chloroplast genomes of three B. chinense

樣本SSRs總量核苷酸類型占比（數(shù)量） 單核苷酸/%二核苷酸/%三核苷酸/%四核苷酸/%五核苷酸/%六核苷酸/% 北柴胡16540（61.54）12（18.46）6（9.23）4（6.15）2（3.08）1（1.54） 北柴胡27149（69.01）10（14.08）7（9.86）5（7.04）// 北柴胡37149（69.01）10（14.08）7（9.86）5（7.04）//

3.4 不同產(chǎn)地北柴胡樣品的petN_psbM和ndhF_rpl32的擴增

根據(jù)（643 bp）、（656 bp）、（1102 bp）、（1220 bp）序列設(shè)計引物，進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)（643 bp）、（656 bp）擴增效率不高，、的擴增效率為100%，因此本研究選擇、為北柴胡種內(nèi)鑒定的特異DNA條形碼，進行后續(xù)研究。以7個產(chǎn)地177份北柴胡樣品總DNA為模板對篩選的2個葉綠體基因組高變區(qū)進行PCR擴增，并對測序結(jié)果進行分析。利用設(shè)計的引物進行PCR擴增，全部樣品擴增到1000～2000 bp（圖5），對PCR產(chǎn)物純化后測序，與北柴胡1的序列對比可判斷其為序列；利用設(shè)計的引物進行PCR擴增，全部樣品擴增到1000～2000 bp（圖6），對PCR產(chǎn)物純化后測序，與北柴胡1的序列對比可判斷其為序列。

圖4 3份北柴胡葉綠體基因組核苷酸多樣性

3.5 不同產(chǎn)地樣品DNA條形碼分析

基因共檢測到91個變異位點，共形成28個單倍型（圖7）。其中位于249、396、576、612、837和926 bp的6個位點突變類型為插入；位于932～976 bp的45個位點突變類型為缺失，同時942～944 bp和950 bp伴有單點突變；其他40個位點為單點突變，分別位于219、228、303、327、331、362、401、403、428、445、485、536、578、581、607、620、621、626、628～631 bp、633、636、639、641～644、646、652、682、708、716、749、869、873、883、928、1013 bp。

M-Marker 1-HNLY10 (Hap3) 2-HBQHD1 (Hap7) 3-SXLFHM19 (Hap20) 4-SXXZ2 (Hap29) 5-SXGJ1 (Hap34) 6-SXBJ1 (Hap35) 7-SXSL7 (Hap39) 8-陰性對照，圖6同

圖6 北柴胡樣品ndhF_rpl32序列PCR擴增

基因共檢測到78個變異位點，共形成29個單倍型（圖8）。其中位于255、256、280、331、749、794、803、807、950、1001bp的10個位點突變類型為插入，此外，749 bp位點也存在缺失突變和單點突變；位于258、750、775～780、819～827、853～856 bp的21個位點突變類型為缺失，同時853 bp伴有單點突變；其他47個位點為單點突變，分別位于132、134、167、178、179、184、207、223、224、262、279、286、317、318、343、353、356、423、449、462、472、478、482、518、570、574、577、594、647、656、713、741、742、790、796、809、839、874、876、877、886、960、1 011、1014、1015、1022和1044 bp。

對2基因聯(lián)合分析共形成了40個單倍型（表2），占比最多分布最廣的單倍型為Hap1，占全部樣品的19.21%，其次是Hap2，占比為17.51%（圖9），而特異的單倍型可作為該產(chǎn)地特有的種質(zhì)資源加以擴繁，也可以作為鑒定北柴胡產(chǎn)地來源的DNA分子標(biāo)簽。河南省洛陽市的DNA分子標(biāo)簽為Hap3和Hap4，河北秦皇島市的DNA分子標(biāo)簽為Hap7、Hap8、Hap9、Hap10和Hap11，山西省臨汾市侯馬市的DNA分子標(biāo)簽為Hap13、Hap15、Hap16、Hap18、Hap20、Hap21、Hap22、Hap23、Hap25、Hap26和Hap28，山西省新絳縣西莊村的DNA分子標(biāo)簽為Hap29和Hap33，陜西省寶雞市的DNA分子標(biāo)簽為Hap35、Hap36、Hap37和Hap38，陜西省商洛市商州區(qū)代街村的DNA分子標(biāo)簽為Hap39和Hap40。

*-核酸與Hap1相同 “-”-核酸缺失，圖8同

*-nucleic acid is the same as Hap1 “-”-nucleic acid deletion, same as fig.8

圖7基因的單倍型變異位點

Fig. 7 Haplotypes variation outliers ofgene

3.6 遺傳距離分析

使用Mega X對2個基因聯(lián)合分析的單倍型進行遺傳距離分析，結(jié)果顯示40個單倍型的遺傳距離為0～0.022，平均遺傳距離為0.010，表明北柴胡樣品間親緣關(guān)系差別不大。最大遺傳距離0.022存在于Hap3和Hap20之間，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；最小遺傳距離為0.000存在于多個單倍型之間，分別在Hap6、Hap16、Hap17和Hap33之間，Hap14、Hap23和Hap24之間，Hap26和Hap27之間，Hap35和Hap38之間，親緣關(guān)系最近。占比較多的Hap1和Hap2之間遺傳距離為0.017，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)合表2中每個產(chǎn)地樣品的單倍型發(fā)現(xiàn)，Hap35和Hap38為陜西省寶雞市的特異單倍型，Hap16為山西省臨汾市侯馬市特異單倍型，Hap33為山西省新絳縣西莊村特異單倍型。此外，陜西省寶雞市的另2個特異單倍型Hap36和Hap37之間遺傳距離為0.001，親緣關(guān)系較近。山西省臨汾市侯馬市的另一特異單倍型Hap15和山西省新絳縣西莊村的另一特異單倍型Hap29之間遺傳距離為0.003，親緣關(guān)系較近。河北省秦皇島市的2個特異單倍型Hap7和Hap11之間遺傳距離為0.001，親緣關(guān)系較近。陜西省商洛市商州區(qū)代街村的特異單倍型Hap40和河南省洛陽市的特異單倍型Hap4之間遺傳距離為0.002，親緣關(guān)系較近。

對表2中每個產(chǎn)地的特異單倍型之間遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，河南省洛陽市的特異單倍型Hap3與河北省秦皇島市的特異單倍型Hap7之間遺傳距離為0.021；Hap3與山西省臨汾市侯馬市特異單倍型Hap20之間遺傳距離為0.022，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。河南省洛陽市的另一特異單倍型Hap4與山西省新絳縣西莊村的特異單倍型Hap29之間遺傳距離為0.018；Hap7與Hap29之間的遺傳距離為0.019；Hap20與Hap29之間的遺傳距離為0.020，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Hap4與陜西省寶雞市的特異單倍型Hap35之間遺傳距離為0.019；Hap7與Hap35之間的遺傳距離為0.020；Hap20與Hap35之間的遺傳距離為0.021，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Hap4與陜西省商洛市商州區(qū)代街村的特異單倍型Hap39之間遺傳距離為0.019；Hap7與Hap39之間遺傳距離為0.020；Hap20與Hap39之間遺傳距離為0.021；Hap29與陜西省商洛市商州區(qū)代街村的另一特異單倍型Hap40之間遺傳距離為0.017；Hap35與Hap40之間遺傳距離為0.017，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這些結(jié)果表明每個產(chǎn)地的特異單倍型之間的遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖9 2個基因聯(lián)合分析的單倍型占比圖

3.7 系統(tǒng)進化分析

將2個基因聯(lián)合分析后的單倍型序列對比后構(gòu)建NJ Tree，從而進一步分析各單倍型的親緣關(guān)系。如圖10所示，Hap1、Hap3、Hap14、Hap18、Hap19、Hap23、Hap24、Hap28、Hap35和Hap38聚在同一支上，其他單倍型聚為一支，同一支的單倍型之間親緣關(guān)系較近。占比較多的Hap1和Hap2分別屬于2個不同的單系分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

結(jié)合表2分析各產(chǎn)地的特異單倍型發(fā)現(xiàn)，部分單倍型之間親緣關(guān)系較近，與遺傳距離分析結(jié)果一致。陜西省寶雞市的特異單倍型Hap35和Hap38聚為同一支，支持率為62%；陜西省寶雞市的另2個特異單倍型Hap36和Hap37聚為同一支，支持率為98%；河北省秦皇島市的2個特異單倍型Hap7和Hap11聚為同一支，支持率為96%；陜西省商洛市商州區(qū)代街村的特異單倍型Hap40和河南省洛陽市的特異單倍型Hap4聚為同一支，支持率為92%；山西省臨汾市侯馬市的特異單倍型Hap16與山西省新絳縣西莊村的特異單倍型Hap33聚為同一支，支持率為23%；山西省臨汾市侯馬市的另一特異單倍型Hap15和山西省新絳縣西莊村的另一特異單倍型Hap29聚為同一支，支持率為62%。

結(jié)合表2中每個產(chǎn)地的特異單倍型發(fā)現(xiàn)，與遺傳距離分析結(jié)果一致，遺傳距離較大的特異單倍型均不聚在同一支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖10 2個基因聯(lián)合分析的單倍型NJ Tree

4 討論

據(jù)報道北柴胡葉綠體基因組為典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，總長度為155 458～155 869 bp，GC含量為37.68%～37.70%，IR長度為52 596～52 620 bp，LSC長度為85 343～85 772 bp，SSC長度為17 495～17 505 bp；共包含129～133個基因，其中蛋白質(zhì)編碼基因為19～84個，tRNA基因為30～37個，rRNA基因為4-8個[11, 21-22]。北柴胡及其同屬植物的分散重復(fù)序列為33～49條，串聯(lián)重復(fù)序列為22～30條，簡單重復(fù)序列為57～72條[21-22]。本研究所測的3個北柴胡葉綠體全基因組大小和結(jié)構(gòu)與上述北柴胡研究結(jié)果基本相符。

目前已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報道[19, 23-25]利用葉綠體測序和比較基因組進行篩選高變區(qū)作為特異DNA條形碼用于物種的鑒定，但是用篩選的特異DNA條形碼驗證的比較少。如通過比較葉綠體基因組學(xué)研究有學(xué)者推薦、、、、等葉綠體基因組高變區(qū)作為鑒定石豆蘭屬藥用植物的特異DNA條形碼[23]；、、、、是通過葉綠體基因組學(xué)分析篩選的龍膽屬植物鑒定的高變片段[24]。目前也有少量研究對葉綠體基因組高變區(qū)用于鑒定物種進行了驗證，如基于葉綠體基因組篩選的秦艽的特異性DNA片段和2個高變區(qū)，能夠用于長梗秦艽、全萼秦艽的鑒別[25]；高變區(qū)、、、與能作為特異DNA條形碼鑒定大黃藥材3個基原[19]。但是也有相關(guān)報道證明利用葉綠體基因組測序獲得特異DNA條形碼后擴增效果不理想，如豆蔻屬的特異性DNA片段擴增效果不理想，不適合豆蔻屬的鑒定[26]。綜合文獻(xiàn)研究表明[25-26]，在篩選高變區(qū)域后，需要經(jīng)過實際擴增效率驗證。近期已有學(xué)者通過比較基因組學(xué)分析柴胡屬植物葉綠體基因組高變區(qū)為、、、、、為柴胡屬種間高變區(qū)，但是沒有相應(yīng)的實驗驗證[22]。本研究基于mVISTA和Pi結(jié)果分析北柴胡葉綠體基因組的高變區(qū)，結(jié)果表明、、、是北柴胡種內(nèi)的潛在DNA條形碼，結(jié)合以前的文獻(xiàn)[22]報道結(jié)果表明、既可以作為北柴胡種內(nèi)特異性DNA片段也可以作為種間鑒定的DNA條形碼。基于擴增效率，選擇、用于后續(xù)北柴胡種質(zhì)資源的鑒定。

DNA條形碼技術(shù)在藥用植物物種鑒定及種內(nèi)資源鑒定方面起到重要的作用，具有簡便、高效、客觀等特點。目前DNA條形碼技術(shù)也在柴胡屬藥用植物鑒定方面取得顯著進展，如趙晴等[27]利用ITS序列鑒定了北柴胡、紅柴胡、三島柴胡的種子；曾偉萍[28]考察了DNA條形碼候選序列、、、在柴胡屬藥用植物的鑒定能力，發(fā)現(xiàn)序列和序列可作為柴胡屬藥用植物鑒定的候選序列。但是目前關(guān)于北柴胡種內(nèi)資源鑒別的研究比較少。本研究基于葉綠體高變區(qū)篩選的2條DNA條形碼和對北柴胡的遺傳多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)了大量的變異位點和較全面的遺傳信息。其中6個產(chǎn)地的特異單倍型作為該產(chǎn)地特有的種質(zhì)資源，為后續(xù)鑒別不同產(chǎn)地北柴胡樣品奠定基礎(chǔ)；各單倍型之間遺傳距離較小，北柴胡種內(nèi)親緣關(guān)系較近，但主流單倍型Hap1和Hap2之間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，部分產(chǎn)地特異單倍型之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此本研究基于比較葉綠體基因組學(xué)篩選的北柴胡鑒定的特異性片段和可以有效鑒定北柴胡種質(zhì)資源，為北柴胡種質(zhì)資源保護和后續(xù)育種工作奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening of specific DNA barcoding and identification of germplasm resources of

WANG Xin1, YIN Guang-yao1, ZHANG Zhi-fei1, CHEN Ying1, LIU Shan-hu1, MAN Jin-hui1, SHI Yue1, HUANG Yu-ying1, ZHANG Xiao-qin1, WANG Xiao-hui2, WEI Sheng-li1

1. School of ChineseMateria Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To screen the specific DNA barcodes based on Beichaihu () chloroplast genome, so as to identify the plasm resource offrom different producing areas.The Illumina HiSeq X Ten platform was used to sequence the chloroplast genome of three samples of. Specific DNA barcodes was analyzed with mVISTA soft and nucleotide polymorphism analysis. The haplotype offrom different producing areas was identified with specific DNA barcodes.The total length of chloroplast genomes of three samples from different habitats was 155 557—155 959 bp, all of which had typical circular tetrad structure and coded 131 genes.,,andcan be used as specific DNA barcodes for identification of potential germplasm resources of. Based on amplification efficiency,andwere selected to analyse the sequence of 177 samples offrom seven places in four provinces. The results showed thatandhad 91 and 78 mutation loci, and 28 and 29 haplotypes were identified; The two sequences were analyzed together to form 40 haplotypes (Hap1—Hap40), and the genetic distance of each haplotype was 0—0.022. Six producing areas had unique haplotypes, which can distinguish the germplasm resources offrom different producing areas.The specific DNA barcodesand, identified bychloroplast genome analysis,could be used to demonstrate the genotypes of, which provides values for the identification ofproducing area, the protection and utilization of germplasm resources and breeding work.

DC.; chloroplast genome; sequence comparison; germplasm resources; DNA barcoding

R286.12

A

0253 - 2670(2023)17 - 5703 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.023

2023-02-03

北京市科學(xué)技術(shù)委員會基金項目（Z201100005420005）；北柴胡精準(zhǔn)藥材批次分子防偽技術(shù)研究項目（2020071720419）

王 馨（1999—），碩士，主要從事中藥資源與分子生藥學(xué)研究。Tel: 18813062869 E-mail: nz18813062869@163.com

王曉暉，副研究員，主要從事中藥活性成分生物合成調(diào)控研究。Tel: 18810722975 E-mail: wangxhui2014@163.com

魏勝利，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥資源研究。Tel: 13683336930 E-mail: wsl7491@126.com

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