羅國平，任婉婷，閆夢(mèng)茹，孟會(huì)寧

（1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安 710021；2.山東步長(zhǎng)醫(yī)藥銷售有限公司，山東菏澤 274418）

光動(dòng)力療法（PDT）是運(yùn)用特定波長(zhǎng)的光來激發(fā)光敏藥物，使其發(fā)生一定的光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞或分子發(fā)生形態(tài)及機(jī)能的改變，從而達(dá)到的診斷或治療作用[1]。5-氨基乙酰丙酸，又名5-氨基酮戊酸，目前市面上銷售的該產(chǎn)品大多以鹽酸鹽（5-ALA）的形式存在，屬于第二代光敏劑，可用于治療痤瘡、尖銳濕疣、銀屑病、鮮紅斑痣等皮膚疾病[2]，其作用的機(jī)理為：5-ALA 經(jīng)皮給藥后，能被病變細(xì)胞選擇性的吸收并大量積蓄于該類細(xì)胞中，然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂泻軓?qiáng)光敏活性的原卟啉IX（Pp IX），在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下，產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧，單線態(tài)氧可使病變細(xì)胞壞死，從而達(dá)到治療疾病的目的。

研究發(fā)現(xiàn)，5-ALA 在應(yīng)用時(shí)也存在一些問題，如穩(wěn)定性差[3]，尤其在堿性條件下；極性較大導(dǎo)致皮膚滲透性不好，難以到達(dá)皮膚深層，在外用制劑方面存在一定的限制。為此，本實(shí)驗(yàn)將5-ALA 采用熱敏醇質(zhì)體進(jìn)行包載，熱敏醇質(zhì)體是一種新型醇質(zhì)體[4，5]，其作用有：（1）可將5-ALA 封閉在類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)的水相中，提高藥物穩(wěn)定性[3，6]；（2）醇質(zhì)體[7]具有較好的變形性，能提高5-ALA 的透皮性能；（3）光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體由相變溫度（Tm）稍高于體溫的脂膜磷脂構(gòu)成[8]，用波長(zhǎng)為635nm 的紅光照射患處，紅光的熱效應(yīng)會(huì)使患處局部溫度升高，當(dāng)超過熱敏醇質(zhì)體的相變溫度時(shí)，醇質(zhì)體會(huì)釋放出5-ALA，產(chǎn)生相應(yīng)的治療作用。本文主要研究5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的制備工藝并進(jìn)行藥劑學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)[9]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽原料藥（99% 上海麥克林生化科技有限公司）；膽固醇（東巨榮生物工程有限公司）；大豆卵磷脂（藥用）；無水乙醇、1,2-丙二醇，分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司；KH2PO4、NaH2PO4、H3PO4，均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（色譜純天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；NaOH（AR 天津市化學(xué)試劑公司）。

DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Agilent Tech.1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；TG-1650-WS 型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；SB-5200DT 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BT125D 型電子天平（賽多斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；ZEN-3600Malvern 型馬爾文激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的制備 采用乙醇注入-超聲法[10]。精密稱取大豆卵磷脂和膽固醇，置100mL 燒杯中，加一定體積無水乙醇超聲溶解；另在避光條件下，將5-ALA 溶解于一定體積的PBS溶液中，在100r·min-1轉(zhuǎn)速攪拌條件下用注射器緩慢勻速注入到上述乙醇溶液中，繼續(xù)攪拌一定時(shí)間，超聲處理（250W，40kHz）一定時(shí)間，即得。

1.2.2 熱敏性評(píng)價(jià) 采用DSC 法進(jìn)行熱敏性評(píng)價(jià)。分別取上述制備的5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體，離心，將沉淀真空干燥后置于鋁制坩堝內(nèi)，在體積分?jǐn)?shù)為99.99%的N2氛圍下，升溫速度為1℃·min-1，于25~50℃范圍內(nèi)檢測(cè)樣品的熱量變化。

1.2.3 包封率的測(cè)定 取5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體混懸液4mL，15000r·min-1轉(zhuǎn)速高速離心15min，取上清液，用0.45μm 微孔濾膜（水系）過濾，取續(xù)濾液，采用高效液相色譜法測(cè)定5-ALA 的濃度，得到游離5-ALA 的濃度（C游），代入式（1）計(jì)算包封率（EE%）。

式中 m總：加入藥物的總質(zhì)量，mg；V總：未包封的5-ALA 質(zhì)量，mg。

1.2.4 HPLC 法測(cè)定5-ALA 的含量[11]色譜條件：Agilent 5 TC-C18型色譜柱（250mm×4.6mm，5μm；流動(dòng)相：乙腈∶1.36% KH2PO4溶液（用H3PO4調(diào)pH 值至2.0）=3∶97；柱溫：25℃；波長(zhǎng)：265nm；流速：1mL·min-1；進(jìn)樣體積：20μL。

1.2.5 變形性測(cè)定[13]取4mL 5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體混懸液和4mL 水，分別測(cè)定在0.8kg 重物的壓力下通過0.45μm 微孔濾膜的性能，按式（2）計(jì)算變形性（D）。

式中 V醇質(zhì)體∶光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的通過速度，mL·min-1，；V水：水的通過速度，mL·min-1。

1.2.6 平均粒徑和粒度分布的測(cè)定 取制備好的5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體，采用Malvern 激光粒度儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 單因素實(shí)驗(yàn)[13]

1.2.7.1 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對(duì)相變溫度（Tm）和包封率的影響 按照“1.2.1”項(xiàng)下的制備方法加入10mg 5-ALA，乙醇10mL，pH 值為7.4 的PBS 溶液12mL，攪拌20min，超聲2min?？疾靘（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）分別為6∶1、9∶1、12∶1 時(shí)，制備的5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的Tm和包封率的變化情況。

1.2.7.2 不同m（囊材）∶m（藥物）對(duì)包封率的影響 按照“1.2.1”項(xiàng)下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，乙醇10mL，pH 值為7.4 的PBS 溶液12mL，攪拌20min，超聲2min。考察囊材與藥物質(zhì)量比分別為35∶1、28∶1、21∶1 時(shí)，制備的5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的包封率的變化情況。

1.2.7.3 溶液pH 值對(duì)包封率的影響 按照“1.2.1”項(xiàng)下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，5-ALA 10mg，乙醇10mL，PBS 溶液12mL，攪拌20min，超聲2min。采用pH 梯度法，即在形成醇質(zhì)體前，PBS 溶液的pH 值為3.0，注入法制備醇質(zhì)體后，調(diào)節(jié)溶液的pH 值，考察pH 值分別為3.0、7.4、10.0 時(shí)，制備的5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的包封率的變化情況。

1.2.7.4 攪拌時(shí)間對(duì)包封率的影響 按照“1.2.1”項(xiàng)下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，5-ALA 10mg，乙醇10mL，PBS 溶液12mL，超聲2min?？疾鞌嚢钑r(shí)間分別為10、20、30min 時(shí)，制備的5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的包封率的變化情況。

1.2.7.5 乙醇體積對(duì)變形性的影響 按照“1.2.1”項(xiàng)下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，5-ALA 10mg，pH 值為7.4 的PBS 溶液12mL，攪拌20min，超聲2min?？疾煲掖俭w積分別為6、10、14mL 時(shí)，制備的5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的變形性變化情況。

1.2.7.6 超聲時(shí)間對(duì)粒徑分布系數(shù)（PDI）的影響按照“1.2.1”項(xiàng)下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，5-ALA 10mg，無水乙醇10mL，pH 為7.4的PBS 溶液12mL，攪拌20min，考察超聲時(shí)間分別為1、2、4、10min 時(shí)，制備的5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體平均粒徑和粒度分布的變化情況。

1.2.8 正交實(shí)驗(yàn)篩選最優(yōu)制備條件[14]在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)法，以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）（A）、m（囊材）∶m（藥物）（B）和攪拌時(shí)間（C）3 個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3 個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and their levels

1.2.9 藥劑學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià) 按照優(yōu)選出的條件制備5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體，分別采用“1.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定包封率，采用“1.2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定變形性，采用“1.2.6”項(xiàng)下方法測(cè)定平均粒徑和粒度分布。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對(duì)相變溫度（Tm）和包封率的影響（圖1、圖2）

圖1 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）制備的醇質(zhì)體DSC 圖Fig.1 DSC diagram of glycosome prepared with different mass ratios of soybean lecithin and cholestero

圖2 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對(duì)包封率的影響Fig.2 Effect of different proportions of soybean lecithin and cholesterol on encapsulation efficiency

由圖1 可見，m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）=12∶1 時(shí)，Tm值約為40℃；m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）=9∶1 時(shí)，Tm值約為41℃；m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）=6∶1 時(shí)，Tm值約為42.5℃?？梢?，Tm值隨著囊材中膽固醇的比例增加略有升高。另外，從圖的形狀可看出，大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為6∶1 時(shí)，相變特性最為明顯。

由圖2 可見，隨著大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比增大，包封率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，但差異不大。

2.1.2 不同m（囊材）∶m（藥物）對(duì)包封率的影響（圖3）

圖3 囊材與藥物質(zhì)量比對(duì)包封率的影響Fig.3 Effect of different quality ratios of capsule materials and drugs on encapsulation efficiency

由圖3 可見，包封率隨著m（囊材）∶m（藥物）的增大呈先增后降的趨勢(shì)，但差異較小。

2.1.3 溶液pH 值對(duì)包封率的影響（圖4）

圖4 pH 值對(duì)包封率的影響Fig.4 Effect of pH value on encapsulation efficiency

由圖4 可見，包封率隨溶液pH 值的增大而增大，但pH 值為7.4 和10 時(shí)的包封率相差不大。分析原因是，采用pH 梯度法制備醇質(zhì)體時(shí)，醇質(zhì)體形成之前用HCl 調(diào)節(jié)水溶液的pH 值偏酸性至5-ALA鹽酸鹽等電點(diǎn)以下，采用注入法形成醇質(zhì)體后，再調(diào)節(jié)溶液pH 值至5-ALA 鹽酸鹽等電點(diǎn)以上，結(jié)果醇質(zhì)體內(nèi)水相中藥物主要以解離型存在，而外水相則主要以非解離型存在，由于醇質(zhì)體膜屬于脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，外水相的非解離型藥物可通過被動(dòng)擴(kuò)散從膜外進(jìn)入膜內(nèi)，進(jìn)入膜內(nèi)的藥物受pH 值的影響轉(zhuǎn)變?yōu)榻怆x型；而膜內(nèi)的解離型藥物無法通過膜向外擴(kuò)散，因此，醇質(zhì)體中藥物的包封率就會(huì)增大。可見，pH 梯度法可顯著提高藥物的包封率?？紤]到皮膚用藥的刺激性問題，選取溶液pH 值為7.4。

2.1.4 攪拌時(shí)間對(duì)包封率的影響（圖5）

圖5 攪拌時(shí)間對(duì)包封率的影響Fig.5 Effect of mixing time on encapsulation efficiency

由圖5 可見，隨著溶液攪拌時(shí)間的增加，包封率持續(xù)增大，但趨勢(shì)逐漸減弱。

2.1.5 乙醇體積對(duì)變形性的影響（圖6）

圖6 乙醇體積對(duì)變形性的影響Fig.6 Effect of ethanol volume on deformability

由圖6 可見，隨著乙醇體積的增大，藥物的變形性逐漸增大，但趨勢(shì)逐漸減弱，因此，選擇乙醇體積為10mL。

2.1.6 超聲時(shí)間對(duì)粒徑分布系數(shù)（PDI）的影響（圖7）

圖7 超聲時(shí)間對(duì)粒徑分布系數(shù)（PDI）的影響Fig.7 Effect of ultrasound time on PDI

由圖7 可見，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，PDI 持續(xù)減小，即醇質(zhì)體的粒徑隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)變得更為均勻，但4min 后減小的趨勢(shì)顯著變緩，故選擇超聲時(shí)間為4min。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)篩選最優(yōu)制備條件[10]

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和直觀分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Design and results of the orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of the analysis of variance

由表2 可見，因素影響由大到小依次為：A>C>B，即m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）>攪拌時(shí)間>m（囊材）∶m（藥物）；篩選出的最佳搭配為A2B3C3，即m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）=9∶1，m（囊材）∶m（藥物）=23.3∶1，攪拌時(shí)間為30min。

2.3 最優(yōu)工藝條件制備的5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的藥劑學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)

2.3.1 包封率的測(cè)定 測(cè)得包封率為69.73%，包封率較高。

2.3.2 變形性的測(cè)定 測(cè)得變形性為19.15%，變形性較好。

2.3.3 粒度分布的測(cè)定（圖8）

圖8 5-ALA 光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體的粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of 5-ALA photodynamic-thermosensitive electrosol bodies

由圖8 可見，PDI 測(cè)得為0.280，平均粒徑為325.4nm，表明醇質(zhì)體的粒徑在納米級(jí)別且粒度分布均勻。

3 結(jié)論

本文以大豆卵磷脂和膽固醇為囊材，無水乙醇為柔軟劑，采用乙醇注入-pH 梯度法制備的5-ALA光動(dòng)力-熱敏醇質(zhì)體藥物的包封率高，具有較好的熱敏性和變形性，粒徑分布均勻。