范敏,王夢(mèng)松,劉慧,張惠玲,魏超昆*

1(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川,750021) 2(寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏 銀川,750021)

稀奶油干酪是由添加了稀奶油的全脂乳制得的新鮮軟質(zhì)干酪,不經(jīng)成熟,生產(chǎn)后即可食用,具有奶油和酸奶的風(fēng)味[1]。其口味柔和清淡,且含有許多對(duì)于人體有益的脂肪酸,如部分短鏈脂肪酸、α-亞麻酸、二十碳五烯酸[2]。目前,國(guó)內(nèi)在奶油干酪方面已經(jīng)做了一些研究;例如,姜姝等[3]以再制奶油干酪為研究對(duì)象,探究了不同條件超高壓對(duì)再制奶油干酪質(zhì)構(gòu)、流變及微觀結(jié)構(gòu)的影響。盧曉明等[4]探究了奶油干酪的關(guān)鍵工藝參數(shù)。然而,這些研究主要集中在奶油干酪工藝及質(zhì)構(gòu)上,對(duì)于稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)還鮮見(jiàn)報(bào)道。

干酪成熟過(guò)程中主要涉及三類生化反應(yīng),包括糖酵解、蛋白水解和脂肪分解;這些反應(yīng)不僅會(huì)改變干酪的物理化學(xué)性質(zhì),而且還會(huì)賦予干酪獨(dú)特的風(fēng)味。就目前而言,探究干酪成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)降解已成為研究熱點(diǎn),吳倩蓉等[5]通過(guò)對(duì)加工過(guò)程及不同殺菌溫度醬牛肉蛋白質(zhì)降解的研究,探究加工方式對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響。然而隨著研究的不斷深入,蛋白質(zhì)降解在產(chǎn)品品質(zhì)風(fēng)味方面的研究也引發(fā)了廣泛的討論,王蔚新[6]研究了酸魚發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)降解及對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)會(huì)在微生物及酶作用下降解成肽及氨基酸,能提高產(chǎn)品風(fēng)味。解春芝[7]研究了腐乳發(fā)酵后氨基酸代謝及風(fēng)味產(chǎn)生原理,最終得出,氨基酸會(huì)在轉(zhuǎn)氨酶、肽酶、蛋白酶及特定微生物的作用下產(chǎn)生小分子風(fēng)味物質(zhì),進(jìn)一步促進(jìn)腐乳成熟。而稀奶油干酪作為一種新型的產(chǎn)品,在蛋白質(zhì)降解與品質(zhì)控制方面還缺乏研究。此外,偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)作為一種多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法,在風(fēng)味物質(zhì)的分類、降維以及篩選方面提供了有力支撐[8]。孫細(xì)珍等[9]應(yīng)用風(fēng)味檢測(cè)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)醛異味樣品和正常樣品進(jìn)行判別分析,對(duì)兩種樣品進(jìn)行有效的區(qū)分。丁習(xí)林等[10]采用主成分分析和PLS-DA等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,對(duì)不同KCl替代組宣威火腿進(jìn)行有效區(qū)分。

稀奶油干酪的風(fēng)味特性以及風(fēng)味產(chǎn)生機(jī)理對(duì)于其品質(zhì)及應(yīng)用價(jià)值的提升非常重要,本研究以稀奶油干酪發(fā)酵階段為對(duì)象,在明晰不同發(fā)酵階段蛋白質(zhì)降解規(guī)律的基礎(chǔ)上,深入研究干酪發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化,并采用PLS-DA結(jié)合香氣活性值(odor activity value,OAV)和變量權(quán)重值(variable importance for the projection,VIP),篩選出不同發(fā)酵時(shí)間干酪的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì),為稀奶油干酪加工及品質(zhì)的提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稀奶油 (蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.6%,脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%,碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.6%),英國(guó)Pritchitts公司;2-辛醇,Sigma-Aldrich公司;BCA試劑盒,北京諾博萊德科技有限公司;醋酸、MRS培養(yǎng)基,Servicebio公司;三氯乙酸,上海宏瑞化工有限公司;鎘-茚三酮,青島海博生物;濃硫酸,上海裕納化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

島津Qp2010ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本Shimadzu公司;PHS-25酸度計(jì),廣州銘睿電子科技有限公司;UPT-K1800全自動(dòng)凱氏定氮儀,北京優(yōu)譜通用科技有限公司;WJ-3恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LT202E電子天平,常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司;XW-80A旋渦混合儀,上海嘉鵬科技有限公司;DILITCEN22離心機(jī),蘇州貝銳儀器科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)與方法

1.3.1 樣品的制備

鮮奶油在15～18 MPa下均質(zhì)后,在95 ℃下殺菌10 min。隨后冷卻到60～70 ℃時(shí),加入檸檬酸(4.5%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))、攪拌,放置過(guò)夜排除乳清后,將成形的干酪置于真空包裝袋,于溫濕度為12 ℃、50%～55%的環(huán)境下成熟20 d。取樣點(diǎn)為0、5、10、15、20 d,以發(fā)酵0 d的樣品為對(duì)照組,放置于-20 ℃環(huán)境下等待檢測(cè)。

1.3.2 基礎(chǔ)理化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 水分、脂肪、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

水分含量測(cè)定參考GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》;脂肪含量測(cè)定參考GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》;蛋白質(zhì)含量測(cè)定按北京諾博萊試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2.2 pH值測(cè)定

參考王超等[11]方法,稍作修改。稱取5 g干酪于50 mL 去離子水中研磨勻漿后,用精密pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.3 蛋白水解程度的測(cè)定

總氮含量根據(jù)GB 5009.5—2016采用凱氏定氮法測(cè)定。pH 4.6-可溶性氮(pH 4.6-soluble nitrogen,pH 4.6-SN)和12%三氯乙酸-可溶性氮(12% trichloroacetic acid-soluble nitrogen,12% TCA-SN)根據(jù)賈宏信等[12]的方法測(cè)定。

1.3.3 蛋白酶活力及乳酸菌總數(shù)的測(cè)定

蛋白酶活力的檢測(cè):參照SB/T 10317—1999;乳酸菌總數(shù)測(cè)定參照GB 4789.35—2016。

1.3.4 總游離氨基酸的測(cè)定

參照曹瑛瑛等[13]的方法,采用鎘-茚三酮法測(cè)定干酪中總游離氨基酸。

1.3.5 感官評(píng)定

參照后鵬飛等[14]的方法,對(duì)稀奶油干酪進(jìn)行感官評(píng)定。

1.3.6 GC-MS定性及定量分析

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME):取4.0 g粉碎后的稀奶油干酪樣品于20 mL頂空瓶中,置于80 ℃頂空加熱爐內(nèi),加熱平衡30 min,將老化好的萃取頭插入頂空瓶中,吸附30 min。

GC條件:載氣為高純氦氣,流速:1.0 mL/min,不分流進(jìn)樣。E-WAX ETR 色譜柱(30 m×0.25 mm,0.50 μm),升溫程序:起始柱溫35 ℃,保持2 min,以4 ℃/min升至120 ℃,以6 ℃/min升至180 ℃,最后以10 ℃/min升至230 ℃,保持10 min。

MS條件:電子電離源(EI),電子能量70 eV,離子源溫度240 ℃,傳輸線溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,掃描方式為全掃描。

定性定量分析:揮發(fā)性物質(zhì)的定性是根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST14與NIST14S數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配得出,僅將相似度大于80%的化合物進(jìn)行定性。揮發(fā)物定量采用內(nèi)標(biāo)半定量法進(jìn)行,含量表示為mg/kg[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

樣品中GC-MS及質(zhì)構(gòu)的數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差分析。采用SIMAC14.1軟件對(duì)樣品進(jìn)行PLS-DA,SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05,差異顯著),利用Origin 2021b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀奶油干酪基礎(chǔ)指標(biāo)的分析

由表1可知,隨著成熟時(shí)間的推移,脂肪和蛋白質(zhì)含量發(fā)生顯著變化,分別從36.31%和9.34%下降到34.13%和7.65%。pH值總體呈下降的趨勢(shì),發(fā)酵0 d和5 d及10 d和15 d差異不顯著,但整個(gè)發(fā)酵階段有較大差異,從5.5下降到4.45;這可能是由于奶酪在成熟過(guò)程中在微生物及酶的作用下糖酵解產(chǎn)生乳糖,乳糖進(jìn)一步分解形成酸類物質(zhì),從而降低pH[16]。水分含量隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而降低;成熟初期水分含量較高,而到發(fā)酵中后期(10～20 d)水分流失較快。產(chǎn)生這種差異的原因可能是稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生降解,從而導(dǎo)致網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙逐漸變大,所以水分較易從空隙中脫落[17]?？偟恐饾u增加,這與稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中的蛋白質(zhì)降解有關(guān)。WSN含量是指在pH 4.6時(shí)干酪中游離大分子肽、小分子肽和游離氨基酸的總量[18]。由表1 可知,隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng),不同發(fā)酵階段稀奶油干酪中WSN含量差異顯著(P<0.05),其含量從0.45%增加到6.57%。12% TCA-SN主要包括小分子肽(2～20個(gè)殘基)和游離氨基酸的含量,主要是發(fā)酵劑中形成的微生物肽酶作用的結(jié)果[19];隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng),各發(fā)酵階段稀奶油干酪的12% TCA-SN差異顯著(P<0.05),由4.1%上升至6.6%,這是由于微生物衰退和自溶后,肽酶從凋亡的細(xì)胞體中釋放出來(lái),大分子肽在肽酶和殘余凝乳酶作用下降解為小肽和游離氨基酸,從而導(dǎo)致12% TCA-SN含量逐漸增加?？傆坞x氨基酸則在發(fā)酵0～20 d持續(xù)上升,且在發(fā)酵20 d達(dá)到最大值(22.68±1.7) μg/mL;這是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行,稀奶油干酪在微生物及內(nèi)源蛋白酶作用下會(huì)降解蛋白質(zhì),進(jìn)而產(chǎn)生游離氨基酸等非揮發(fā)性物質(zhì),有助于奶酪滋味的提升。而結(jié)合總氮含量、WSN和12% TCA-SN及游離氨基酸含量變化可以得出,稀奶油干酪在發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生降解。

表1 稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的測(cè)定

感官特征是消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品接受程度的重要因素。稀奶油干酪在發(fā)酵過(guò)程中的感官評(píng)分如表1所示,各個(gè)階段感官得分差異顯著,且發(fā)酵10 d的感官評(píng)分最高;發(fā)酵10～20 d評(píng)分相較于0～10 d更高一些?？赡艿脑蚴窃诎l(fā)酵初期,奶酪的風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)源于乳酸菌代謝乳糖和檸檬酸產(chǎn)生的;而到發(fā)酵后期,乳酸菌自溶釋放出肽酶、脂肪酶,從而加速脂質(zhì)和蛋白降解,產(chǎn)生更多風(fēng)味物質(zhì)。

2.2 稀奶油干酪乳酸菌總數(shù)和蛋白酶活力的分析

在稀奶油干酪成熟前期(0～10 d),蛋白酶活力隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,酶活力在10 d達(dá)到最高值(11.03±1.06) u/g,成熟10～20 d酶活力顯著下降(P<0.05)?？赡苁窍∧逃透衫以诎l(fā)酵后期菌種活力下降,且部分發(fā)生自溶及衰亡,從而導(dǎo)致蛋白酶活力下降。微生物在蛋白質(zhì)降解過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,由圖1可知,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,稀奶油干酪中的乳酸菌總數(shù)先增加后降低,且在發(fā)酵10 d乳酸菌總數(shù)達(dá)到最大值,為1.48×106CFU/g,這與蛋白酶活力的變化趨勢(shì)相似,這可能是由于隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng),干酪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗,碳源減少,不利于微生物的生長(zhǎng)。而且在發(fā)酵過(guò)程中乳糖代謝產(chǎn)生乳酸,干酪中pH持續(xù)降低,從而導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)受到抑制。

圖1 稀奶油干酪在不同發(fā)酵時(shí)間的乳酸菌總數(shù)和蛋白酶活力的變化

2.3 稀奶油干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

根據(jù)以上理化指標(biāo)和感官的測(cè)定,最終選取0、10、20 d研究其風(fēng)味物質(zhì)的變化。由表2可知,利用GC-MS對(duì)稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定,共鑒定出28種揮發(fā)性化合物,其中發(fā)酵0 d、發(fā)酵10 d和發(fā)酵20 d分別檢測(cè)出18、28和16種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。由圖2可知,隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng),稀奶油干酪中各類物質(zhì)在種類和含量上均存在不同程度的差異。其中酸類物質(zhì)的含量最高, 醛類物質(zhì)的含量最低;隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng), 醇類、酸類、酮類和內(nèi)酯類物質(zhì)的含量先升高后降低;而其他類物質(zhì)包括檸檬烯和二十一烷在發(fā)酵10 d達(dá)到最大值,發(fā)酵20 d沒(méi)有被檢測(cè)到。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間稀奶油干酪中揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量

表2 不同發(fā)酵階段稀奶油干酪揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

GC-MS分析檢測(cè)到的10種酸包括乙酸、苯甲酸、異戊酸、癸酸、己酸、辛酸、壬酸、十一酸、丁二酸和3-甲基丙酸,其中大多數(shù)酸類化合物含量在成熟過(guò)程中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。稀奶油干酪成熟過(guò)程中酸類物質(zhì)形成主要來(lái)源于3個(gè)生化途徑:脂質(zhì)水解、蛋白質(zhì)降解和糖酵解。其中乳糖在微生物和酶的作用下經(jīng)糖酵解代謝為乙酸,乙酸是奶酪的特征風(fēng)味物之一,賦予奶酪酸味;其在稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中只在發(fā)酵0～10 d被檢測(cè)到,且發(fā)酵10 d達(dá)到最大值,為(0.221 6±0.009 6) mg/kg。此外己酸、丁酸、辛酸、壬酸和癸酸等的形成與脂質(zhì)水解有關(guān);稀奶油干酪中的甘油三酯被微生物和內(nèi)源酶水解成短鏈和中鏈脂肪酸以及脂肪進(jìn)一步降解形成游離脂肪酸,短鏈脂肪酸在稀奶油干酪風(fēng)味形成中起著重要作用;如癸酸會(huì)產(chǎn)生脂肪和柑橘氣味,己酸會(huì)產(chǎn)生甜味。但脂質(zhì)的過(guò)度降解會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的氣味,如己酸會(huì)產(chǎn)生汗味、刺鼻味和腐臭味,辛酸具有山羊味。最后,還有部分酸是由蛋白質(zhì)降解、氨基酸代謝產(chǎn)生的;例如,異戊酸、3-甲基丙酸,這些支鏈脂肪酸大多來(lái)源于亮氨酸、異亮氨酸降解,賦予奶酪腐敗、酸臭氣味,是奶酪成熟的標(biāo)志。

大部分醇類物質(zhì)含有較高的閾值,所以其對(duì)干酪整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大;在稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中醇類物質(zhì)可以與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng),從而影響奶酪的風(fēng)味。不同發(fā)酵階段共檢測(cè)到了4種醇類物質(zhì),包括1,2-戊二醇、2,3-丁二醇、2-苯乙醇和反-9-十八烯醇;大部分醇類在發(fā)酵0～10 d含量上升,而10～20 d則顯著下降,整個(gè)含量變化在成熟過(guò)程中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),這與酶活性有相似的趨勢(shì)。2,3-丁二醇和2-苯乙醇都源于氨基酸降解代謝;其中2,3-丁二醇在發(fā)酵0～10 d被檢測(cè)到,與多數(shù)醇類物質(zhì)變化趨勢(shì)不同,2,3-丁二醇在發(fā)酵過(guò)程中顯著下降,其可由戊糖乳桿菌降解氨基酸產(chǎn)生,且賦予奶酪水果味。而2-苯乙醇則來(lái)源于酵母對(duì)苯丙氨酸的降解,其為奶油干酪增添了玫瑰香味。

酮類化合物風(fēng)味獨(dú)特,閾值較低,對(duì)稀奶油干酪的風(fēng)味形成起著十分重要的作用。圖2結(jié)合表2可得,稀奶油干酪中共檢測(cè)到5種酮類化合物,包括2-庚酮、乙偶姻、2-壬酮、2-十一酮和2-癸酮。總的來(lái)說(shuō),在發(fā)酵過(guò)程中酮類化合物呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),這可能與酮類物質(zhì)的二次代謝有關(guān)。大部分酮類物質(zhì)的形成與脂質(zhì)的降解以及脂肪酸的β-氧化有關(guān);如在念球菌的作用下游離脂肪酸會(huì)發(fā)生β-氧化進(jìn)而形成2-庚酮和2-壬酮,這會(huì)賦予奶酪甜味、花香味和水果味。2,3-丁二酮(二乙酰)和乙偶姻是發(fā)酵乳制品中典型的風(fēng)味物質(zhì),賦予奶酪奶油和奶酪風(fēng)味,但本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到2,3-丁二酮,這可能與其穩(wěn)定性差有關(guān),其在還原酶的作用下很容易被還原為丙酮。

大多數(shù)的酯類化合物閾值較低,且常帶有花香和水果香味,其可以平衡脂肪酸帶來(lái)的刺激味和氨基酸產(chǎn)生的苦味[20]。本實(shí)驗(yàn)中,沒(méi)有檢測(cè)到酯類物質(zhì),但檢測(cè)到4種內(nèi)酯類物質(zhì)包括丁位壬內(nèi)酯、丁位癸內(nèi)酯、丁位辛內(nèi)酯和丁位十二內(nèi)酯。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),這些內(nèi)酯類物質(zhì)含量先上升后降低,但總的來(lái)說(shuō)內(nèi)酯類物質(zhì)是發(fā)酵20 d含量最高的物質(zhì)。大多數(shù)內(nèi)酯類物質(zhì)都是脂質(zhì)加熱氧化而產(chǎn)生的。

醛類物質(zhì)主要源于脂質(zhì)和脂肪酸的β-氧化以及氨基酸的降解。稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)到兩種醛包括苯乙醛和十一醛,且都只出現(xiàn)在發(fā)酵10 d,這是因?yàn)槿╊惖幕瘜W(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,易被還原成相應(yīng)的醇,因此這類化合物在乳制品中含量較低。苯乙醛是苯丙氨酸在腸球菌、芽孢桿菌和芳香氨基酸轉(zhuǎn)移酶等共同作用下產(chǎn)生的,其賦予奶酪花香和蜂蜜般的香氣。

2.3.1 稀奶油干酪中揮發(fā)性化合物的PLS-DA

PLS-DA是一種將數(shù)據(jù)進(jìn)行降維,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜數(shù)據(jù)的可視化及判別分析和預(yù)測(cè)[21];同時(shí)還可以揭示不同發(fā)酵時(shí)間段與相應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)之間的相關(guān)性,具有相似風(fēng)味物質(zhì)的樣品相互靠近,否則距離較遠(yuǎn)。由圖3-a可知,樣品分布分散,所以該建模方法能較好地區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)間稀奶油干酪。擬合模型預(yù)測(cè)成分的累計(jì)統(tǒng)計(jì)量R2X=0.91、模型解釋率參數(shù)R2Y=0.989、預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2=0.965,均高于0.5,說(shuō)明該模型對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的稀奶油干酪具有較好的預(yù)測(cè)能力。最后還觀察到發(fā)酵10 d位于第三象限;0 d和20 d則分別位于第二和第四象限,其中發(fā)酵10 d與中心原點(diǎn)距離較遠(yuǎn),所以其對(duì)模型貢獻(xiàn)率較大。

a-得分圖;b-載荷圖;c-置換檢驗(yàn)圖;d-VIP排序圖

揮發(fā)性化合物對(duì)模型的貢獻(xiàn)還可以通過(guò)PLS載荷圖反映出來(lái)(圖3-b),距離樣品及中心點(diǎn)越近,其對(duì)模型的貢獻(xiàn)越大。由圖3-b可知,乙偶姻、丁二酸、苯乙醇、辛酸、異戊酸、苯甲酸、丁位辛內(nèi)酯、丁位癸內(nèi)酯在載荷圖中位于第3象限,表明這幾種物質(zhì)為發(fā)酵10 d主要風(fēng)味物質(zhì)。同理,癸酸、壬酸和丁位壬內(nèi)酯等揮發(fā)性物質(zhì)為發(fā)酵0 d的主要風(fēng)味物質(zhì)。

最后,采用置換檢驗(yàn)(重復(fù)次數(shù)200)對(duì)PLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證,由圖3-c可知,R2=0.2,Q2=-0.2,且Q2與y軸的截距小于零,表明該模型未過(guò)擬合,模型穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力較好,可以用于解釋不同發(fā)酵時(shí)間稀奶油干酪風(fēng)味的差異。

VIP可進(jìn)一步直觀反映變量對(duì)模型分類的整體貢獻(xiàn)度,VIP(VIP>1)越高,化合物對(duì)稀奶油干酪的貢獻(xiàn)就越大。由圖3-d可知,VIP>1.0的風(fēng)味物質(zhì)有11種,這些物質(zhì)可以作為判別不同發(fā)酵時(shí)間段的重要物質(zhì),分別為癸酸、苯甲酸、二十一烷、丁位癸內(nèi)酯、2-癸酮、己酸、2,3-丁二醇、2-庚酮、反-9-十八烯醇、檸檬烯、異戊酸。其中苯甲酸和異戊酸分別為氨基酸代謝的產(chǎn)物,賦予奶酪堅(jiān)果味和奶酪奶油味,是干酪特征風(fēng)味物質(zhì)。丁位癸內(nèi)酯是脂質(zhì)在高溫下β-氧化而產(chǎn)生,賦予奶酪水果味和甜味[22]。癸酸和己酸分別提供綿羊般的氣味,是奶酪不愉快氣味的來(lái)源;然而己酸的含量在發(fā)酵后期下降,這可能歸因于脂多酸會(huì)經(jīng)歷二次代謝(氧化和酯化)以產(chǎn)生醛,醇和酯[23]。2-庚酮的閾值較低,為140 μg/L,賦予奶酪草本氣味。2,3-丁二醇是由脂肪酸的自動(dòng)氧化還原甲基酮而產(chǎn)生的,它表現(xiàn)出奶油的特征氣味[24]。

2.3.2 稀奶油干酪中揮發(fā)性化合物的OAV分析

根據(jù)OAV可以確定不同發(fā)酵階段下稀奶油干酪的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)(表2),其中4種風(fēng)味物質(zhì)在整個(gè)發(fā)酵階段都存在,包括2-庚酮、乙偶姻、2-十一酮和丁位癸內(nèi)酯;乙偶姻是一種具有乳制品和過(guò)熟水果氣味的特征風(fēng)味化合物,通過(guò)乳酸菌的作用與檸檬酸鹽和乳糖代謝有關(guān),也可以通過(guò)氨基酸分解代謝產(chǎn)生,它可以在發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)化為2,3-丁二醇[25]。檸檬烯和2,3-丁二醇只在發(fā)酵前期被檢測(cè)到,苯乙醛只在發(fā)酵10 d被檢測(cè)到,這可能微生物及蛋白酶活性有關(guān)。丁位十二內(nèi)酯只在發(fā)酵后期被檢測(cè)到,這與脂質(zhì)發(fā)生β-氧化有關(guān)。

2.3.3 OAV結(jié)合VIP確定關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)

OAV結(jié)合VIP最終確定2-庚酮、乙偶姻、2-十一酮和丁位癸內(nèi)酯、2,3-丁二醇、丁位十二內(nèi)酯、癸酸、苯甲酸、二十一烷、2-癸酮、己酸、反-9-十八烯醇、檸檬烯、異戊酸和苯乙醛為稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)。2,3-丁二醇、苯甲酸、異戊酸和苯乙醛的產(chǎn)生與蛋白質(zhì)降解有關(guān),分別是亮氨酸和苯丙氨酸在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶和芳香氨基酸轉(zhuǎn)移酶作用下的代謝產(chǎn)物。異戊酸和苯乙醛在發(fā)酵10 d達(dá)到最大值,這與蛋白酶活性及菌落總數(shù)變化趨勢(shì)一致。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了稀奶油干酪在0～20 d成熟過(guò)程中理化指標(biāo)、蛋白質(zhì)降解量、酶活力、乳酸菌總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果表明,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),微生物發(fā)酵干酪導(dǎo)致pH和水分逐漸下降,蛋白質(zhì)分解量增加,而到發(fā)酵后期(10～20 d)蛋白酶活力和乳酸菌總數(shù)顯著下降,可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境對(duì)微生物生長(zhǎng)有抑制作用,且在發(fā)酵后期菌種會(huì)衰退自溶,導(dǎo)致酶活性下降。通過(guò)對(duì)揮發(fā)性化合物檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味化合物的總量呈下降趨勢(shì),發(fā)酵10 d的風(fēng)味物質(zhì)最豐富;2-庚酮、乙偶姻、2-十一酮、丁位癸內(nèi)酯、2,3-丁二醇、丁位十二內(nèi)酯、癸酸、苯甲酸、二十一烷、2-癸酮、己酸、反-9-十八烯醇、檸檬烯、異戊酸和苯乙醛為稀奶油干酪發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì),其中,2,3-丁二醇、苯甲酸、異戊酸和苯乙醛與蛋白質(zhì)降解有關(guān),分別賦予奶酪水果味、堅(jiān)果味、奶酪味和杏仁味。綜上所述,在稀奶油干酪成熟期間,微生物和酶會(huì)促進(jìn)其蛋白質(zhì)降解,并產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì);進(jìn)一步結(jié)合感官評(píng)價(jià)的結(jié)果,我們最終得出稀奶油干酪最佳成熟時(shí)間是發(fā)酵10 d,此期間的干酪香氣濃郁,微彈性、易于吸收,營(yíng)養(yǎng)豐富。因此本研究可為稀奶油干酪加工和產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù),但稀奶油干酪風(fēng)味形成的內(nèi)在機(jī)理有待進(jìn)一步研究。