王玉榮,雷炎,劉忠軍,張敏,李擎,郭壯*

1(湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心,湖北 襄陽,441053) 2(襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心,湖北 襄陽,441053) 3(清香型白酒生物技術(shù)襄陽市重點實驗室,湖北 襄陽,441053) 4(內(nèi)蒙古河套酒業(yè)集團股份有限公司,內(nèi)蒙古 巴彥淖爾,015400)

作為白酒釀造過程中重要的發(fā)酵劑、糖化劑和生香劑,大曲的質(zhì)量及其微生物群落結(jié)構(gòu)在白酒釀造中至關(guān)重要[1]。根據(jù)制曲溫度的不同可將釀酒大曲分為低溫大曲(40～50 ℃)、中溫大曲(50～60 ℃)和高溫大曲(60～70 ℃),不同類大曲的微生物群落豐度和多樣性存在差異,適用于不同香型的白酒,其中中溫大曲適用于生產(chǎn)濃香型白酒[2]。HOU等[3]對中溫大曲進行分析,表明大曲從發(fā)酵到貯存過程中其內(nèi)部和外部的微生物群落和理化特性發(fā)生明顯變化。YANG等[4]基于宏基因組學(xué)對中溫大曲中參與風(fēng)味代謝的微生物進行分析,表明大曲的品質(zhì)可以顯著影響白酒的感官特性,且不同微生物的代謝作用各有不同。肖辰[5]通過分析瀘型酒中溫大曲對酒醅發(fā)酵的作用發(fā)現(xiàn)曲中酯類、醇類以及酸類等揮發(fā)性物質(zhì)多出現(xiàn)在酒醅和基酒中,且酒醅和基酒中風(fēng)味物質(zhì)含量明顯提高。

高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing technology,HTS)為現(xiàn)代生命科學(xué)研究提供了前所未有的機遇[6]?；谠摷夹g(shù)研究人員實現(xiàn)了對大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的解析、微生物來源的探究以及不同階段大曲微生物群落結(jié)構(gòu)演替的分析等。周森等[7]利用HTS對清香型白酒大曲微生物多樣性結(jié)構(gòu)進行解析,結(jié)果顯示樣品中真菌豐度遠大于細菌豐度,且不同大曲樣品真菌群落主體均為扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera),細菌群落結(jié)構(gòu)則較為多樣化。周天慈等[8]對中高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)及其來源進行解析發(fā)現(xiàn)發(fā)酵初期大曲中細菌和真菌的主要來源分別為制曲原料和制曲環(huán)境,其中大曲中真菌53.7%來自于室外地面,23%來自于室內(nèi)屋頂。HE等[9]通過MiSeq高通量技術(shù)對濃香型白酒大曲發(fā)酵和貯存階段微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析可知,大曲發(fā)酵和貯存階段微生物群落組成基本不變,相對豐度含量有所變化,嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、根霉屬(Rhizopus)、畢赤酵母屬(Pichia)和根毛霉屬(Rhizomucor)為大曲中的優(yōu)勢真菌屬。由此可知,釀酒大曲中含有豐富的真菌群落結(jié)構(gòu),且大曲中微生物受到制曲原料和制曲環(huán)境的影響可能組成不同,因而對不同來源大曲中真菌類群進行解析是很有必要的。

河套地區(qū)屬于溫帶大陸性氣候,位于黃河中上游地區(qū),擁有良好的自然環(huán)境和土壤條件,是中國西北最主要的農(nóng)業(yè)區(qū)之一。本研究使用HTS技術(shù)對采集自河套地區(qū)某酒廠制曲車間的5份中溫大曲樣品進行真菌群落結(jié)構(gòu)的解析,通過對大曲理化特性指標(biāo)的測定分析大曲品質(zhì),從而進一步探究大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)對理化特性的影響,并通過傳統(tǒng)微生物技術(shù)對大曲樣品中的酵母菌進行解析。本研究側(cè)重于對中溫大曲真菌微生物群落結(jié)構(gòu)的解析,有助于篩選大曲中優(yōu)良發(fā)酵菌株,從而提升白酒品質(zhì),同時為釀酒大曲的規(guī)范化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中溫大曲,河套地區(qū)某酒廠制曲車間;QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒,德國QIAGEN公司;Axygen清潔試劑盒,康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司;引物ITS3F/ITS4R、ITS1/ITS4和M13F(-47)/M13R(-48),武漢天一輝遠生物科技有限公司;5×TransStartTMFastPfu Buffer、dNTPs、FastPfu Fly DNA Polymerase、牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)、2×PCR Buffer、rTaq酶、PMD 18-T載體,北京全式金生物技術(shù)有限公司;Escherichiacolitop10,湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心制備;氫氧化鈉、鹽酸、次甲基藍、可溶性淀粉、硫酸、甲醛、己酸,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;無水乙酸鈉、氯化鈉、冰乙酸、氯化鈷、無水乙醇,西隴化工股份有限公司;葡萄糖和重鉻酸鉀,天津市福晨化學(xué)試劑廠;PDA培養(yǎng)基,上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BF-10小型高速粉碎機,河北本辰科技有限公司;5810R型臺式高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;DYY-12型電泳儀,北京六一儀器廠;vetiri梯度基因擴增儀,美國AB公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng),美國ProteinSimple公司;ND-2000C微量紫外分光光度計,美國Nano Drop公司;Miseq PE300型高通量測序平臺,美國Illumina公司;R920型機架式服務(wù)器,美國DELL公司;GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海博迅實業(yè)有限公司;DHS-16水分測定儀,寧波市鄞州華豐電子儀器廠;K1100全自動凱氏定氮儀,山東海能科學(xué)儀器有限公司;KSL-1200X-M馬弗爐,合肥科晶材料技術(shù)有限公司;HR40-IIB2生物安全柜,海爾集團電子商務(wù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 中溫大曲樣品的制備和采集

制曲的工藝流程如下[10]:

制曲原料(優(yōu)質(zhì)冬小麥)→潤料→粉碎→拌料壓曲→入房臥曲→噴酒強化→培曲翻曲→出房入庫→大曲貯存

樣品的采集和預(yù)處理:從制曲車間選擇顏色均勻、厚度適中、有特殊香氣[11]的中溫大曲共5份,編號為HT1～HT5。在實驗室條件下,將整塊大曲進行切割粉碎,置于無菌自封袋中低溫貯存。

1.3.2 樣品宏基因組DNA提取、真菌ITS區(qū)PCR擴增和MiSeq測序

本研究參考QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒中的方法,提取中溫大曲樣品中宏基因組DNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min)對樣品總DNA進行檢測,將檢測合格的DNA作為模板進行PCR擴增[12]。經(jīng)過檢測將擴增出目的片段的PCR產(chǎn)物使用清潔試劑盒進行清潔,并通過微量紫外分光光度計檢測PCR清潔產(chǎn)物的濃度[13],用無菌ddH2O將濃度稀釋至100 nmol/L后寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。

1.3.3 序列下機處理和生物信息學(xué)分析

MiSeq高通量測序數(shù)據(jù)下機后根據(jù)重疊關(guān)系將序列的雙端序列進行拼接,并進行序列質(zhì)量控制[14],將拼接過程中不合格的序列刪除,獲取高質(zhì)量序列。通過QIIME(V1.9.1)平臺對獲取的高質(zhì)量序列進行真菌群落注釋和多樣性分析,具體流程:(1)去除嵌合體序列[15];(2)按照97%相似度結(jié)合UNITE數(shù)據(jù)庫進行序列的操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)劃分和物種注釋[16-17];(3)計算樣品中α多樣性指數(shù)[18]。

1.3.4 樣品理化指標(biāo)的測定

參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》對中溫大曲樣品的水分含量、酸度、淀粉含量、發(fā)酵力、液化力、糖化力、酯化力、灰分、氨基酸態(tài)氮和酒化力進行測定,使用水分活度測定儀進行樣品中水分活度的測定,使用凱氏定氮儀對樣品中含氮量進行測定,從而計算樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 樣品中酵母菌的分離純化與鑒定

霉菌和酵母計數(shù):參考GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》中平板計數(shù)法進行大曲樣品中菌落計數(shù),依照菌落計數(shù)原則計算樣品中霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。

酵母菌的分離純化:5份中溫大曲等量混合均勻取樣,用0.85%的無菌生理鹽水對樣品進行梯度稀釋,選擇合適梯度的稀釋液100 μL涂布于PDA固體平板上,28 ℃培養(yǎng)3～5 d后挑取菌落形態(tài)和顏色不同的單菌落進行純化,并使用30%的甘油保藏菌體。

酵母菌的鑒定:參考CHOW等[19]研究并略做調(diào)整對樣品中分離株進行DNA提取和ITS區(qū)擴增,經(jīng)過清潔、連接和轉(zhuǎn)化操作后將陽性單克隆產(chǎn)物送往上海桑尼生物科技有限公司進行測序,對反饋回的序列進行引物的查找與去除后在GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast同源性比對,明確其微生物學(xué)地位。

1.3.6 核酸登錄號申請

本研究5份中溫大曲高通量測序數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫申請核酸登錄號,ID號為mgp104048。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理和可視化分析

經(jīng)生物信息學(xué)分析后在Excel 2021中進行數(shù)據(jù)可視化處理和表格繪制,使用在線繪圖工具jvenn(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)繪制韋恩(Venn)圖,利用Spearman相關(guān)性分析進行優(yōu)勢真菌屬與理化特性指標(biāo)間的相關(guān)性分析,使用R-4.1.3軟件繪制瀑布圖、堆積柱狀圖和相關(guān)性熱圖,利用MEGA7構(gòu)建樣品中分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及質(zhì)量評估

采用Illumina MiSeq測序技術(shù)對采集自河套地區(qū)的5份中溫大曲進行真菌群落結(jié)構(gòu)分析,測序后的原始序列經(jīng)過拼接和質(zhì)量控制篩選出優(yōu)質(zhì)序列,并對其進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,結(jié)果如表1所示。

表1 樣品ITS基因測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

由表1可知,本次測序共得到高質(zhì)量序列293 433條,劃分為2 100個OTU,平均每個樣品含有58 686條序列。α多樣性指數(shù)可以有效評估樣品中微生物的豐度和多樣性,香農(nóng)指數(shù)又稱為多樣性指數(shù),用以衡量樣品中物種類群的多少,超1指數(shù)又稱為豐富度指數(shù),用以衡量樣品中物種數(shù)量的多少。其中,樣品HT4香農(nóng)指數(shù)最大,樣品HT3超1指數(shù)最大,表明樣品HT4中物種類群最多,樣品HT3中物種數(shù)量最多。

2.2 不同中溫大曲樣品中OTU分析

為解析大曲中真菌群落結(jié)構(gòu),本研究對樣品中OTU分布進行可視化分析,在所有樣品中均存在的OTU被稱為核心OTU。由圖1-A可知,本研究的5份中溫大曲樣品中核心OTU數(shù)有61個,包含239 613條序列,占總序列數(shù)的81.66%,且平均相對含量>1%的核心OTU有5個。

A-韋恩圖;B-瀑布圖

為進一步明確核心OTU的分布情況和分類學(xué)地位,本研究對平均相對含量>1%的核心OTU進行分析。由圖1-B可知,平均相對含量>1%的核心OTU包括OTU1929(嗜熱真菌屬,Thermomyces)、OTU2005(曲霉屬,Aspergillus)、OTU2178(雙足囊菌屬,Dipodascus)、OTU2411(酵母菌目,Saccharomycetales)和OTU710(Rhizomucor),累積平均相對含量達77.15%。2.3 不同中溫大曲樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分析

為進一步分析不同中溫大曲樣品間的差異性,本研究基于真菌門和屬水平解析不同樣品中群落結(jié)構(gòu),對樣品中平均相對含量>1%的優(yōu)勢真菌門和屬進行可視化分析,結(jié)果如圖2所示。

A-優(yōu)勢真菌門;B-優(yōu)勢真菌屬

由圖2-A可知,中溫大曲樣品中優(yōu)勢真菌門主要隸屬于Ascomycota、Mucoromycota和擔(dān)子菌門(Basidiomycota),平均相對含量分別為81.24%、10.22%和8.15%,與襄陽地區(qū)中溫大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)相似[20]。由圖2-B可知,樣品中優(yōu)勢真菌屬有7個,分別隸屬于Thermomyces(60.08%)、Aspergillus(13.37%)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia,7.76%)、橫梗霉屬(Lichtheimia,6.63%)、Rhizomucor(2.79%)、Dipodascus(1.69%)和Rhizopus(1.02%),占總測序量的93.36%。根據(jù)可視化分析結(jié)果顯示,不同樣品中真菌群落豐度和多樣性存在一定差異,與表1中α多樣性分析結(jié)果基本一致。

2.4 樣品中優(yōu)勢真菌與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

依據(jù)1.3.4節(jié)對5份中溫大曲樣品的理化指標(biāo)進行測定,其結(jié)果如表2所示。

表2 樣品中理化指標(biāo)的分析

由表2可知,在糖化力指標(biāo)上樣品平均值為528.56 U,標(biāo)準(zhǔn)差為141.98,在酯化力指標(biāo)上樣品平均值為534.41 U,標(biāo)準(zhǔn)差為210.99。樣品間糖化力和酯化力數(shù)值波動較大,這可能與本研究中溫大曲的貯存期較長有關(guān)[21],且樣品HT2糖化力和酯化力最小。尉嘉眙等[22]對不同類大曲的理化性質(zhì)與白酒產(chǎn)品風(fēng)味進行分析發(fā)現(xiàn),大曲的發(fā)酵力與正丙醇呈顯著正相關(guān)(P<0.05),酯化力與β-苯乙醇和乙醛、液化力與總酸總酯呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。MA等[23]對濃香型大曲發(fā)酵過程中微生物群落演替進行研究發(fā)現(xiàn),細菌群落演替的主要驅(qū)動因素是酸度、濕度和溫度,真菌群落演替的主要驅(qū)動因素是水分,據(jù)此推測大曲中水分含量可能與真菌群落之間存在相關(guān)性。

為進一步深入探究中溫大曲樣品中優(yōu)勢真菌屬與理化指標(biāo)的相關(guān)性,本研究使用Pearsom系數(shù)法對7個優(yōu)勢真菌屬和12個理化指標(biāo)進行可視化相關(guān)性分析,結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知,優(yōu)勢真菌屬與中溫大曲理化酶活性(糖化力、液化力、發(fā)酵力、酯化力)和水分含量之間具有顯著相關(guān)性,Lichtheimia與大曲液化力(r=0.937,P<0.05)和糖化力(r=0.932,P<0.05)均呈顯著正相關(guān)性,Dipodascus與大曲液化力(r=0.929,P<0.05)和水分含量(r=0.898,P<0.05)正相關(guān)性顯著,且與大曲糖化力呈極顯著正相關(guān)(r=0.981,P<0.01),Wallemia與大曲發(fā)酵力正相關(guān)性顯著(r=0.881,P<0.05),Rhizomucor與大曲酒化力呈顯著負相關(guān)(r=-0.928,P<0.05)。欒春光等[24]對清香型大曲研究顯示,Lichtheimia與清茬曲的酯化力提升密切相關(guān)。杜向軍等[25]通過對大曲微生物群落結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵影響因素研究顯示,Rhizomucor是影響大曲糖化力、液化力和酒化力的主要微生物之一。HE等[9]分析亦顯示,糖化力與濃香型大曲中Rhizomucor呈現(xiàn)正相關(guān)。唐鰻秋等[26]對8種中日酒曲進行分析可知,酒曲種群結(jié)構(gòu)與其理化指標(biāo)存在明顯相關(guān)性,其中Aspergillus與水分、糖化力、液化力、酸度和還原糖呈正相關(guān),與發(fā)酵力呈負相關(guān),且發(fā)酵力和液化力對微生物物種分布影響最大。

2.5 中溫大曲樣品中酵母菌分析

本研究參考國標(biāo)對5份中溫大曲樣品進行霉菌和酵母菌計數(shù),樣品中霉菌和酵母菌總數(shù)在1.41×105～2.88×106CFU/g。將采集樣品等量混合均勻后通過傳統(tǒng)微生物技術(shù)進行大曲中酵母菌的分離,其菌落形態(tài)和顯微鏡形態(tài)如圖4所示。

A-分離株菌落形態(tài);B-顯微鏡形態(tài)

由圖4可知,兩株分離株的菌落形態(tài)和顯微鏡形態(tài)相似,菌落呈乳白色、有光澤、較平坦、邊緣整齊,分離株細胞呈橢圓形或圓筒形。

為進一步明確分離株的分類學(xué)地位,對分離株進行ITS區(qū)PCR擴增與鑒定,分離株序列在數(shù)據(jù)庫中經(jīng)過同源性分析獲取可靠信息,其與標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的同源性分析如圖5所示。

圖5 樣品中分離株系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖5可知,分離株HBUAS61816和HBUAS61817與標(biāo)準(zhǔn)菌株S.fibuligeraATCC 36309和S.fibuligeraNRRL Y-2388之間同源性均達到100%。由此可知,本研究中分離株HBUAS61816和HBUAS61817隸屬于S.fibuligera。

根據(jù)霉菌和酵母菌總數(shù)測定結(jié)果顯示,樣品中含有豐富的可培養(yǎng)霉菌和酵母菌。霉菌、酵母菌和細菌作為大曲中3種重要菌群,在白酒釀造中發(fā)揮著重要作用,其中霉菌作為糖化動力,酵母菌作為發(fā)酵動力,細菌作為生香動力,相輔相成,對白酒的發(fā)酵及風(fēng)味的產(chǎn)生具有重要意義。PU等[27]使用接種酵母菌的強化大曲進行白酒釀造,發(fā)現(xiàn)強化大曲釀造的白酒其風(fēng)味物質(zhì)含量更高,感官評分更佳。YI等[28]研究表明,曲霉和青霉等真菌為醬香大曲中活性最強的微生物,能表達與芳香類化合物降解相關(guān)的功能酶,在白酒香氣前體物質(zhì)形成中具有不可忽視的作用。因此在后續(xù)研究中采用“培養(yǎng)組學(xué)”策略[29],進一步挖掘其中的微生物資源,解析大曲中真菌群落自發(fā)式構(gòu)建機制,探究其對白酒品質(zhì)的影響十分必要。

3 結(jié)論

本研究采集自河套地區(qū)的中溫大曲主要真菌微生物,主要隸屬于Ascomycota、Mucoromycota和Basidiomycota,且不同樣品間真菌群落組成和多樣性存在差異。大曲中優(yōu)勢真菌屬Thermomyces、Aspergillus、Wallemia、Lichtheimia、Rhizomucor、Dipodascus、Rhizopus與理化指標(biāo)間存在一定相關(guān)性,其中優(yōu)勢菌屬與大曲水分含量和理化酶活性之間均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。S.fibuligera是大曲樣品中主要的酵母菌分離株。