薛 文，王凌云，王云峰，張振杰，趙愛云，王 甜，齊 萌

（1.塔里木大學動物科學與技術(shù)學院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾843300；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，新疆 烏魯木齊 830010）

細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus）的中絳期幼蟲——細粒棘球蚴，常寄生于人和多種動物的肝臟、肺臟等器官，導(dǎo)致機械性損傷、毒素作用和過敏反應(yīng)，嚴重威脅畜牧業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全［1］。羊是細粒棘球蚴重要的中間宿主，感染率可達90%以上，該病原引起的疾病以囊型包蟲?。╟ystic echinococcosis，CE）為主，是我國重點防治的人獸共患病之一［2］。羊感染細粒棘球蚴后，臨床多表現(xiàn)為生長緩慢、發(fā)育不良、消瘦、咳嗽和肝炎等［3］。羊感染細粒棘球蚴的活體診斷較為困難，常采用屠宰時檢查羊肝臟和肺臟中有無棘球蚴包囊作為確診方法［4］。

基于細粒棘球蚴線粒體細胞色素C 氧化酶1（mitochondria cytochrome C oxidase subunit 1）基因（cox1）和NADH 脫氫酶1 （NADH dehydrogenase subunit 1）基因（nad1）的核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，細粒棘球蚴有10 種基因型（G1～G10），不同國家或地區(qū)的基因型存在地理隔離分布和宿主適應(yīng)性差異［5-6］。在新疆維吾爾自治區(qū)，羊感染細粒棘球蚴呈高發(fā)態(tài)勢［7］。該研究旨在對新疆部分地區(qū)屠宰場羊源細粒棘球蚴進行分析鑒定和遺傳特征分析，為羊包蟲病的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本來源

于2020 年1 月—2022 年6 月，分別于新疆維吾爾自治區(qū)和靜縣、和碩縣、輪臺縣、尉犁縣、焉耆回族自治縣、烏魯木齊市米東區(qū)、吐魯番市高昌區(qū)、托克遜縣、特克斯縣、昭蘇縣、新源縣、伊寧縣、吉木薩爾縣、阜康市、木壘哈薩克自治縣和呼圖壁縣共計16 個縣（區(qū)）定點屠宰場采集96 份含細粒棘球蚴包囊的羊肝臟。將采集的肝臟樣本裝于采樣袋中帶回實驗室使用蒸餾水將表面沖洗干凈，用75%酒精進行擦拭，待提取基因組DNA。

1.1.2 主要試劑

組織基因組DNA 提取試劑盒（EasyPure Genomic DNA Kit）、2 × EasyTaq PCR SuperMix （+dye）、DNA Marker DL 2 000，均為北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

Sorvall Legend Micro 17 型微量離心機，Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；MC proS PCR 儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-7C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、JY 系列電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA 提取

對于無囊液的肝臟包囊樣本，取黃豆大小的包囊囊壁用組織研磨器研磨，將100 μL 研磨好的組織樣本按照組織基因組DNA 提取試劑盒說明書提取樣本的基因組DNA；對于有囊液的肝臟包囊樣本，用5 mL 無菌注射器抽取包囊液，將200 μL包囊液轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管，按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本的基因組DNA。每份樣本提取200 μL 的基因組DNA，置于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 引物設(shè)計

參照Guo 等［8］的文獻報道合成細粒棘球蚴線粒體cox1 基因PCR 擴增引物，參照Ohiolei 等［9］的文獻報道合成細粒棘球蚴線粒體nad1 基因PCR 擴增引物，引物信息見表1，由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

表1 細粒棘球蚴線粒體cox1 基因和nad1 基因的PCR 擴增引物信息

1.2.3 目的基因的PCR 擴增

2 個基因位點的PCR 反應(yīng)體系均為25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL；上、下游引物各0.3 μL；模板DNA 1 μL；ddH2O 10.9 μL。cox1 基因位點2 輪PCR 反應(yīng)條件均為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變 性1 min，56 ℃退 火1 min，72℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。nad1 基因位點的PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。PCR 擴增時，設(shè)置陽性對照與陰性對照，陽性對照為新疆羊源細粒棘球蚴基因組DNA，由塔里木大學獸醫(yī)寄生蟲學實驗室鑒定保存，陰性對照為滅菌ddH2O。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL 擴增產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。將陽性PCR 產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進行雙向測序。

1.2.4 序列分析

基于Chromas Pro（http：//technelysium.com.au/ChromasPro.html）對全部樣本測序圖譜進行序列校正及上、下游序列拼接；基于cox1 基因和nad1基因位點，分別將測序成功的序列用ClustalX 2.1軟件（http：//www.clustal.org）進行比對，將比對校正后的序列在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行同源性鑒定。利用Dna SP 5.10 軟件（http：//.www.ub.es/dnasp）分別對該研究所獲得的細粒棘球蚴cox1基因和nad1 基因序列進行單倍型分型。

1.2.5 種系發(fā)育分析

在GenBank 數(shù)據(jù)庫中，下載細粒棘球絳蟲以及多房棘球絳蟲 （Echinococcus multilocularis）、少節(jié)棘球絳蟲（Echinococcus oligarthra）、石渠棘球絳蟲 （Echinococcus shiquicus）、獅 棘 球 絳 蟲（Echinococcus felidis）等絳蟲的mt-cox1 及mtnad1 基因組序列作為參考序列。在cox1 基因和nad1 基因位點，以泡狀帶絳蟲（Taenia hydatigera）為外群。使用MEGA 7.0 軟件（https：//megasoftware.net），采用最大似然法（maximum likelihood，ML）的時間可逆取代模型（general time reversible，GTR）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。進化樹的可靠性用Bootstrap 分析進行檢測，進行1 000 個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰場羊源細粒棘球蚴PCR 鑒定情況

采用PCR 法對96 份肉眼觀察為細粒棘球蚴的基因組DNA 樣本進行擴增，基于cox1 基因位點，擴增出目的條帶的有81 份樣本（84.37%，81/96），細粒棘球蚴cox1 基因的PCR 擴增結(jié)果見圖1；基于nad1 基因位點，擴增出目的條帶的有67份樣本（69.79%，67/96），細粒棘球蚴nad1 基因的PCR 擴增結(jié)果見圖2；結(jié)合2 個基因位點，共有91份樣本擴增出目的條帶（94.79%，91/96），在2 個位點同時擴增出目的條帶的有57 份樣本。

圖1 細粒棘球蚴cox1 基因的PCR 擴增結(jié)果

圖2 細粒棘球蚴nad1 基因的PCR 擴增結(jié)果

2.2 cox1 基因位點的序列分析與鑒定

cox1 基因位點序列比對分析結(jié)果顯示，81 份陽性樣本序列均屬細粒棘球蚴G1 基因型（n=81）?；贒na SP 5.10 軟件分析顯示，81 條序列存在15 個單倍型（Hap_1～Hap_15）。其中，Hap_3 為該研究優(yōu)勢單倍型，所占比例為71.60%（58/81），與我國西部地區(qū)綿羊源 （GenBank 登錄號：OQ345777）、意大利牛源和羊源 （GenBank 登錄號：ON606456、ON606453）的細粒棘球蚴序列同源性為100%。

Hap_15 有5 條序列，占比為6.17%（5/81）；Hap_1、Hap_4、Hap_8、Hap_10、Hap_14 分 別 有2條序列，占比均為2.47%（2/81）；Hap_2、Hap_5、Hap_6、Hap_7、Hap_9、Hap_11、Hap_12、Hap_13 各有1 條序列，占比均為1.23%（1/81）。上述15 個單倍型彼此間堿基差異較小，其同源性為99.1%～99.7%。

2.3 nad1 基因位點的序列分析與鑒定

nad1 基因位點序列比對分析結(jié)果顯示，67 份陽性樣本序列鑒定出2 種基因型，分別為細粒棘球蚴G1 基因型（n=66）和G3 基因型（n=1）?；贒na SP 5.10 軟件分析顯示，67 條序列存在19 個單倍型（Hap_1～Hap_19），其中，Hap_10 為該研究優(yōu)勢單倍型，所占比例為52.23%（35/67），與哈薩克斯坦、蒙古人源（GenBank 登錄號：MG672257、MG672255），伊朗、阿根廷綿羊源（GenBank 登錄號：MG672243、MG672253），巴西、智利牛源（Gen-Bank 登錄號：MG672230、MG672221），墨西哥、阿根 廷 豬 源 （GenBank 登 錄 號：MG672259、MG672208）的細粒棘球蚴序列同源性為100%。

Hap_3 有4 條序列，占比為5.97%（4/67）；Hap_2、Hap_8、Hap_17、Hap_19 分別有3 條序列，占比均為4.48%（3/67）；Hap_1、Hap_4、Hap_11 分別有2 條序列，占比均為2.99%（2/67）；Hap_5、Hap_6、Hap_7、Hap_9、Hap_12、Hap_13、Hap_14、Hap_15、Hap_16、Hap_18 各有1 條序列，占比均為1.49%（1/67）。上述19 個單倍型彼此間堿基差異較小，其同源性為99.5%～99.9%。

2.4 種系發(fā)育分析

根據(jù)cox1 基因位點序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可知，該研究所獲新疆綿羊源細粒棘球蚴G1 基因型序列與參考株G1 基因型和G3 基因型序列聚類形成一個進化支，與其他基因型形成不同進化支。優(yōu)勢單倍型Hap_3 與我國四川省人源細粒棘球蚴序列（GenBank 登錄號：AB786664）遺傳距離較近，單倍型Hap_4～6、Hap_10～11、Hap_12～13 分別聚類成單獨亞群，其他單倍型由于單核苷酸多態(tài)性各自形成小的獨立分支，提示新疆綿羊源細粒棘球蚴在cox1 基因位點上呈現(xiàn)遺傳多樣性分布（見圖3）。

圖3 基于細粒棘球蚴cox1 基因位點構(gòu)建的種系發(fā)育進化樹

根據(jù)nad1 基因位點序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果，該研究所獲新疆綿羊源細粒棘球蚴G1 基因型和G3 基因型序列與參考株G1 基因型和G3 基因型序列聚類形成一個進化支，與其他基因型形成不同進化支。以G1 為流行基因型（Hap_1～13、Hap_15～19），而G3 基因型僅有1 個分離株，為單倍型Hap_14。優(yōu)勢單倍型Hap_10 與其他各單倍型基于單核苷酸多態(tài)性分別成為獨立分支；Hap_14 與我國四川省人源細粒棘球蚴（GenBank登錄號：KJ559023）遺傳距離較近，歸于同一進化分支上，提示新疆綿羊源細粒棘球蚴在nad1 位點上同樣呈現(xiàn)遺傳多樣性分布（見圖4）。

圖4 基于細粒棘球蚴nad1 基因位點構(gòu)建的種系發(fā)育進化樹

3 討論

世界范圍內(nèi)，羊感染細粒棘球蚴的病例均有報道，在以畜牧業(yè)發(fā)展為主的國家地區(qū)呈現(xiàn)高發(fā)流行態(tài)勢。在伊朗開展的調(diào)查顯示，不同養(yǎng)殖環(huán)境和調(diào)查點，羊細粒棘球蚴的感染率存在較大差異，感染率為5.1%～74.4%［10］。Guo 等［11］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆北疆4 個屠宰場的羊細粒棘球蚴感染率為3.5%（44/1 270），不同地區(qū)的感染率存在差異，以阿勒泰地區(qū)羊的感染率較高，為4.6%（9/196），烏魯木齊市羊的感染率較低，為2.5%（13/518）。在克孜勒蘇柯爾克孜自治州屠宰場檢查羊、牛、牦牛等家畜臟器中發(fā)現(xiàn)，羊細粒棘球蚴攜帶率最高，為8.62%（283/3 283）［12］。Gao 等［13］統(tǒng)計分析 我 國1983—2020 年綿羊棘球蚴病的相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)我國綿羊棘球蚴平均感染率仍較高，為30.9%（192094/826 406），分析結(jié)果提示在高海拔、寒冷、潮濕、高降雨的地區(qū)，綿羊棘球蚴的感染率更高。我國新疆地區(qū)羊常見感染細粒棘球蚴，嚴重危害當?shù)厝祟惤】?、公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)健康發(fā)展，應(yīng)長期加強人和動物細粒棘球蚴病的監(jiān)測和防治。

目前，細粒棘球絳蟲分為10 種不同基因型（G1～G10），其中，G1 基因型和G2 基因型常見于綿羊；G3 基因型和G5 基因型常見于牛；G4 基因型常見于馬；G6 基因型常見于駱駝科動物；G7 基因型和G8 基因型分別感染豬和鹿科動物；G9 基因型在波蘭豬體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)；G10 基因型在亞歐大陸的馴鹿體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)［6，14-16］。Mehmood 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，G1 基因型具有廣泛的宿主范圍和人獸共患風險，在羊和人之間易傳播流行。在新疆地區(qū)，羊主要感染的是細粒棘球蚴G1 基因型，在伊犁哈薩克自治州、塔城地區(qū)和烏魯木齊市等地發(fā)現(xiàn)羊還可感染G3 基因型［2，17-18］。Vural 等［19］對土耳其羊源細粒棘球蚴分離株樣本進行PCR 擴增和序列分析，發(fā)現(xiàn)G1 型基因為優(yōu)勢感染基因型，同時發(fā)現(xiàn)感染G3 基因型。該研究對新疆部分地區(qū)81 條細粒棘球蚴cox1 基因序列進行分析，所有樣本均為G1 基因型，存在15 個單倍型，不同單倍型之間存在多個單核苷酸差異，其中，優(yōu)勢單倍型與意大利、伊朗以及我國新疆維吾爾自治區(qū)、甘肅省等地牛源、羊源和人源的分離株基因序列同源性為100%。對67 條細粒棘球蚴nad1 基因序列進行分析，66 條鑒定為G1 基因型，1 條鑒定為G3 基因型，存在19 個單倍型，不同單倍型之間具有單核苷酸多態(tài)性，優(yōu)勢單倍型與非洲、南美洲、歐洲及亞洲的人、牛、羊和豬等多種動物源細粒棘球蚴基因序列同源性為100%［20］。上述研究結(jié)果表明，新疆部分地區(qū)羊源細粒棘球蚴具有遺傳多樣性分布特征和較有廣泛的中間宿主范圍，提示存在潛在的人獸共患風險，在流行地區(qū)應(yīng)進一步加強細粒棘球蚴病的分子流行病學調(diào)查。

4 結(jié)論

新疆維吾爾自治區(qū)羊源細粒棘球蚴呈現(xiàn)遺傳多樣性分布特征，常見的基因型為G1 基因型。研究結(jié)果為我國羊的細粒棘球蚴感染情況調(diào)查和遺傳進化特征分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。