李尹琳，王 勃，夏方山，張杰敏，張金成，李嘉俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，山西 太谷 030801）

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的起點(diǎn)，是植物種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要原料和有效保存體，在我國農(nóng)業(yè)發(fā)展中有著不可替代的作用［1］。但是，種子會(huì)隨著貯藏年限的延長不斷老化，其內(nèi)部生理機(jī)能也會(huì)發(fā)生不同程度的惡化，導(dǎo)致種子萌發(fā)及幼苗生長能力下降［2-3］。這已在杜仲（Eucommia ulmoides）［4］、少花蒺藜 草（Cenchrus pauciflorus）［5］、蒲 公 英（Taraxacum mongolicum）［6］、藜麥（Chenopodium quinoa）［7］、老芒麥（Elymus sibiricus）［8］等 老 化 種 子 的 研 究 中 被 證明。種子引發(fā)是一種能夠提高逆境脅迫下植物種子活力的種子處理技術(shù)，還具有促進(jìn)種子萌發(fā)、增加植物產(chǎn)量等功能［9］，因此，種子引發(fā)是當(dāng)下種子研究領(lǐng)域一個(gè)熱點(diǎn)。

油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BR）是一種新發(fā)現(xiàn)的存在于油菜花粉中的新型植物激素［10］，同時(shí)也是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，能夠參與細(xì)胞分裂過程，從而調(diào)控種子萌發(fā)、植物生長等多種生理活動(dòng)［11-12］，對植物的萌發(fā)及生長發(fā)育有著至關(guān)重要的影響［13-14］。研究發(fā)現(xiàn)，施用BR 可以促進(jìn)番茄（Solanumlycopersicum）［15］、大麥（Hordeumvulgare）［16］、紫花苜蓿（Medicagosativa）［17］、大豆（Glycinemax）［18］、水稻（Oryza sativa）［19］、玉米（Zea mays）［20］等種子的萌發(fā)。BR 對種子萌發(fā)的影響常常表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的現(xiàn)象，例如在干旱脅迫下，5、25 μg/L 的BR 處理是大麥種子萌發(fā)的最佳處理［16］；干旱脅迫下，0.1、0.01 μmol/L 的BR 處理顯著促進(jìn)紫花苜蓿種子的萌發(fā)［17］；在NaCl 脅迫下，0.05 mg/L的BR 對玉米種子萌發(fā)和幼苗生長表現(xiàn)促進(jìn)作用［20］。目前，關(guān)于BR 對植物的萌發(fā)及生長的研究多集中在非生物脅迫領(lǐng)域，尚無關(guān)于BR 引發(fā)如何影響老化種子活力的研究報(bào)道。

燕麥（Avena sativa）是禾本科燕麥屬一年生草本植物，它的栽培類型主要分為2 種，一種是帶稃型，另一種是裸粒型［21］。燕麥具有耐瘠薄、耐干旱、耐嚴(yán)寒等耐極端環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)［22-23］，適宜種植在高寒地區(qū)和干旱半干旱地區(qū)，是世界范圍內(nèi)廣泛種植的糧飼兼用作物品種［24］。燕麥富含豐富的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等人體必需的物質(zhì)，是健康、安全的食物來源之一，因此，越來越多的人在飲食中加入燕麥［25-26］。燕麥因產(chǎn)量高、適口性好、營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，成為草地畜牧業(yè)中青貯和調(diào)制干草的材料，可解決冬春季節(jié)牧草供給不足的重大問題，推動(dòng)畜牧業(yè)的發(fā)展［23，27-28］。此外，燕麥種子中含有大量的不飽和脂肪酸，由于脂肪衍生物容易酸敗或劣變，致使其利用價(jià)值降低［1，29］。因此，在產(chǎn)業(yè)需求、飼料安全和國家政策的支持和引導(dǎo)下，研究燕麥種子活力水平對種質(zhì)資源的利用與保存具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，無論是自然老化還是人工老化都能降低燕麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等［22］，但通過種子引發(fā)的方式可以提高老化燕麥種子的發(fā)芽率，緩解老化對其種子活力的破壞［30］。因此，該研究以老化燕麥種子為試驗(yàn)材料，分析不同濃度外源BR 溶液引發(fā)不同時(shí)間后其種子活力的變化規(guī)律，以期揭示老化燕麥種子響應(yīng)BR 引發(fā)的種子活力的差異，篩選出最佳濃度及引發(fā)時(shí)間，為外源BR 引發(fā)影響老化種子活力的機(jī)理研究提供參考依據(jù)，也為種子的貯藏提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試燕麥種子品種為“太陽神”，2021 年5 月購買于北京正道農(nóng)業(yè)股份有限公司，后密封保存于-20 ℃種子庫內(nèi)至2022 年7 月進(jìn)行試驗(yàn)，其初始含水量為9.56%，初始發(fā)芽率為99%。

1.2 種子處理

所購買種子均帶稃殼，在不破壞其種胚結(jié)構(gòu)的情況下去除稃殼，獲得脫殼后的燕麥種子。參照劉備等［31］報(bào)道的方法將燕麥種子含水量調(diào)整至10%左右，并置于鋁箔袋中密封，最后放于45 ℃恒溫水浴箱中進(jìn)行控制老化處理，至種子發(fā)芽率為75%左右時(shí)將其取出，然后，將老化后的燕麥種子置 于 不 同 濃 度（0、0.01、0.10、0.50、1.00、10.00 μmol/L）的BR 溶液中引發(fā)0（CK）、1、6、12、18、24 h，快速濾出并用蒸餾水沖洗3 遍，并迅速用濾紙吸干種皮表面水分后于20 ℃黑暗條件自然風(fēng)干至含水量為引發(fā)前含水量（鮮重基礎(chǔ)），置于4 ℃冰箱中備用。

1.3 發(fā)芽試驗(yàn)

參照國際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)的種子檢驗(yàn)規(guī)程（2020）［32］對BR 引發(fā)后的燕麥種子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)。在鋪有雙層蒸餾水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中放入50 粒顆粒飽滿的燕麥種子，放入20 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期10 d 的發(fā)芽試驗(yàn)，每日記錄燕麥種子的發(fā)芽數(shù)，在第10 天測定其正常種苗的苗長。每個(gè)處理重復(fù)4 次，具體操作步驟參照文獻(xiàn)［30］。

1.4 測定指標(biāo)

發(fā)芽率的計(jì)算參照國際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)的種子檢驗(yàn)規(guī)程（2020）［32］；發(fā)芽指數(shù)和幼苗活力指數(shù)參照Abdul-Baki 等［33］報(bào)道的方法進(jìn)行計(jì)算；平均發(fā)芽時(shí)間參照Ellis 等［34］報(bào)道的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，利用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對各指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和雙因素方差分析，采用Duncan's 法進(jìn)行組間均數(shù)多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源油菜素內(nèi)酯引發(fā)對老化燕麥種子發(fā)芽率的影響

由表1 可知，BR 濃度為0 μmol/L 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽率隨著引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈先降低后升高的趨勢，在引發(fā)時(shí)間為24 h 時(shí)達(dá)到最高；BR 濃度為0.01 μmol/L 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽率隨著引發(fā)時(shí)間的增加呈上升趨勢，在引發(fā)24 h 時(shí)顯著（P＜0.05）高于其他時(shí)間，并達(dá)到發(fā)芽率最大值88.50%；BR 濃度為0.10、0.50、10.00 μmol/L 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽率隨引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈先升高后降低的趨勢；BR 濃度為1.00 μmol/L 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽率隨引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈降低的趨勢，在引發(fā)1 h 達(dá)到最大值。相同引發(fā)時(shí)間下，不同濃度BR 處理的燕麥種子發(fā)芽率存在很大差異。引發(fā)1 h 時(shí)，燕麥種子的發(fā)芽率隨著BR 濃度的增加呈下降趨勢，但在0～1.00 μmol/L 濃度內(nèi)無顯著變化（P＞0.05）；引發(fā)6～18 h 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽率隨BR 濃度增加呈先升高后降低的趨勢；引發(fā)24 h 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽率隨BR 濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，在濃度為0.01 μmol/L 時(shí)顯著（P＜0.05）高于其他處理。濃度為0.01 μmol/L 引發(fā)24 h 可能是油菜素內(nèi)酯引發(fā)的最適濃度及時(shí)間。

表1 外源油菜素內(nèi)酯引發(fā)對老化燕麥種子發(fā)芽率的影響

2.2 外源油菜素內(nèi)酯引發(fā)對老化燕麥種子發(fā)芽指數(shù)的影響

由表2 可知，BR 濃度為0 μmol/L 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽指數(shù)隨著引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈先降低后升高的趨勢；BR 濃度為0.01 μmol/L 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽指數(shù)隨著引發(fā)時(shí)間的增加呈上升趨勢，在引發(fā)24 h 時(shí)顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間；BR 濃度為0.10、0.50、10.00 μmol/L 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽指數(shù)隨引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈先升高后降低的趨勢，在0.10 μmol/L 引發(fā)18 h 時(shí)燕麥種子發(fā)芽指數(shù)顯著 （P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間，在0.50 μmol/L 引發(fā)12 h 時(shí)燕麥種子發(fā)芽指數(shù)顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間，在10.00 μmol/L 引發(fā)1 h 時(shí)燕麥種子發(fā)芽指數(shù)顯著（P＜0.05）低于其他引發(fā)時(shí)間；BR 濃度為1.00 μmol/L 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽指數(shù)隨引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈降低的趨勢，在引發(fā)24 h 時(shí)達(dá)到最小。相同引發(fā)時(shí)間下，不同濃度BR 處理的燕麥種子發(fā)芽指數(shù)存在很大差異。引發(fā)1 h 時(shí)，燕麥種子的發(fā)芽指數(shù)隨著BR 濃度的增加整體呈降低的趨勢；引發(fā)6～12 h 時(shí)，燕麥種子的發(fā)芽指數(shù)隨著BR 濃度的增加整體呈先升高后降低的趨勢；引發(fā)18～24 h 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽指數(shù)隨BR 濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，引發(fā)18 h 濃度為0.10 μmol/L 時(shí)燕麥種子發(fā)芽指數(shù)顯著（P＜0.05）高于其他濃度，引發(fā)24 h濃 度為0.01 μmol/L 時(shí)顯著（P＜0.05）高于其他濃度。

表2 外源油菜素內(nèi)酯引發(fā)對老化燕麥種子發(fā)芽指數(shù)的影響

2.3 外源油菜素內(nèi)酯引發(fā)對老化燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響

由表3 可知，BR 濃度為0 μmol/L 時(shí)，燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間隨著引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈先升高后降低的趨勢，在引發(fā)時(shí)間為6 h 時(shí)顯著（P＜0.05）高于除引發(fā)12 h 外的其他引發(fā)時(shí)間；BR濃度為0.01 μmol/L 時(shí)，燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間隨著引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈降低的趨勢，在引發(fā)時(shí)間為1 h 時(shí)顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間；BR 濃度為0.10、0.50、10.00 μmol/L 時(shí)，燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間隨引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈先降低后升高的趨勢；BR 濃度為1.00 μmol/L 時(shí)，燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間隨引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈升高的趨勢。相同引發(fā)時(shí)間下，不同濃度BR 處理的燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間存在很大差異。引發(fā)1 h時(shí)，燕麥種子的平均發(fā)芽時(shí)間隨著BR 濃度的增加整體呈上升趨勢；引發(fā)6～12 h 時(shí)，燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間隨BR 濃度增加整體呈先降低后升高的趨勢，引發(fā)6 h 濃度為10.00 μmol/L 時(shí)燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間顯著（P＜0.05）高于其他濃度；引發(fā)18～24 h 時(shí)，燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間隨BR 濃度的增加呈先降低后升高的趨勢，均在濃度為10.00 μmol/L 時(shí)燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間最高 （P＜0.05），引發(fā)24 h 濃度為0.01 μmol/L 時(shí)燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間顯著（P＜0.05）低于其他濃度。

表3 外源油菜素內(nèi)酯引發(fā)對老化燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響

2.4 外源油菜素內(nèi)酯引發(fā)對老化燕麥種子幼苗活力指數(shù)的影響

由表4 可知，BR 濃度為0、0.01 μmol/L 時(shí)，燕麥種子幼苗活力指數(shù)隨著引發(fā)時(shí)間的增加（1～24 h）呈上升的趨勢，在0 μmol/L 引發(fā)18、24 h 時(shí)燕麥種子幼苗活力指數(shù)顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間，在0.01 μmol/L 引發(fā)24 h 時(shí)燕麥種子幼苗活力指數(shù)顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間；BR 濃度為0.10 μmol/L 時(shí)，燕麥種子幼苗活力指數(shù)隨著引發(fā)時(shí)間的增加呈上升的趨勢；BR 濃度為0.50、1.00、10.00 μmol/L 時(shí)，燕麥種子幼苗活力指數(shù)隨引發(fā)時(shí)間的增加 （1～24 h）呈先升高后降低的趨勢，在0.50 μmol/L 引發(fā)12 h 時(shí)燕麥種子幼苗活力指數(shù)顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間，在1.00 μmol/L引發(fā)12、18 h 時(shí)燕麥種子幼苗活力指數(shù)顯著 （P＜0.05）高于其他引發(fā)時(shí)間，在10.00 μmol/L 引發(fā)12 h 時(shí)燕麥種子幼苗活力指數(shù)顯著（P＜0.05）高于除18 h 外的其他引發(fā)時(shí)間。相同引發(fā)時(shí)間下，不同濃度BR 處理的燕麥種子幼苗活力指數(shù)存在很大差異。引發(fā)1、12 h 時(shí)，燕麥種子的幼苗活力指數(shù)隨著BR 濃度的增加整體呈先升高后降低趨勢；引發(fā)6 h 時(shí)，燕麥種子的幼苗活力指數(shù)隨著BR 濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，在濃度為0.01 μmol/L 時(shí)顯著（P＜0.05）高于其他濃度；引發(fā)18 h時(shí)，燕麥種子幼苗活力指數(shù)隨BR 濃度的增加呈降低的趨勢；引發(fā)24 h 時(shí)，燕麥種子發(fā)芽指數(shù)隨BR 濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，濃度為0.01 μmol/L 時(shí)顯著（P＜0.05）高于其他濃度，濃度為10.00 μmol/L 時(shí)顯著（P＜0.05）低于其他濃度。

表4 外源油菜素內(nèi)酯引發(fā)對老化燕麥種子幼苗活力指數(shù)的影響

2.5 外源油菜素內(nèi)酯濃度和引發(fā)時(shí)間對老化燕麥種子活力的雙因素方差分析

如表5 所示，不同外源BR 濃度、引發(fā)時(shí)間以及兩者之間的交互作用對老化燕麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時(shí)間、幼苗活力指數(shù)均存在極顯著（P＜0.01）影響。

表5 外源油菜素內(nèi)酯濃度及引發(fā)時(shí)間對老化燕麥種子活力影響的雙因素分析

3 討論

外源物質(zhì)引發(fā)能夠修復(fù)種子的老化損傷，提高其萌發(fā)和幼苗生長的能力［1］。這在外源物質(zhì)引發(fā) 蒲 公 英［6］、草 地 早 熟 禾（Poa pratensis）［35］、菘 藍(lán)（Isatis indigotica）［36］、玉米［37］等老化種子的研究中已經(jīng)得到驗(yàn)證。該研究表明，與外源BR 濃度為0 μmol/L 相比，濃度為0.01 μmol/L 引發(fā)24 h 時(shí)，老化燕麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)升高，平均發(fā)芽時(shí)間降低，這說明BR 能夠有效緩解燕麥種子的老化損傷；外源BR 濃度超過1.00 μmol/L 引發(fā)時(shí)間超過18 h，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)顯著降低（P＜0.05），平均發(fā)芽時(shí)間顯著升高（P＜0.05）。低濃度的BR 會(huì)促進(jìn)老化燕麥種子萌發(fā)，而高濃度抑制其萌發(fā)，這與外源BR 調(diào)控下促進(jìn)蕎麥（Fagopyrum esculentum）［38］、黑麥草（Lolium perenne）［39］、大麥［16］植物種子萌發(fā)的研究結(jié)果一致，說明BR 對老化燕麥種子活力的修復(fù)作用也具有雙重效應(yīng)。

外源BR 促進(jìn)種子萌發(fā)不僅與其濃度有關(guān)，還與其引發(fā)時(shí)間關(guān)系密切。該研究表明，相同濃度下，隨著引發(fā)時(shí)間的增加，種子各個(gè)指標(biāo)間也呈現(xiàn)不同的變化趨勢。當(dāng)BR 濃度較低時(shí)（0.01 μmol/L），隨著引發(fā)時(shí)間的增加可以增加其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)，降低其平均發(fā)芽時(shí)間，這可能是因?yàn)橐l(fā)時(shí)間較短時(shí)，不能充分啟動(dòng)種子的萌發(fā)前代謝，隨著引發(fā)時(shí)間的延長，種子內(nèi)完成萌發(fā)前的代謝啟動(dòng)，促進(jìn)萌發(fā)。在濃度為0.10～0.50 μmol/L，隨著引發(fā)時(shí)間的增加，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)先升高后降低，平均發(fā)芽時(shí)間呈相反趨勢，此時(shí)也可促進(jìn)老化燕麥的萌發(fā)能力。當(dāng)濃度為1.00 μmol/L 時(shí)，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)隨引發(fā)時(shí)間的增加呈先升高后下降趨勢，平均發(fā)芽時(shí)間延長，在濃度為1.00 μmol/L 引發(fā)1 h 時(shí)，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)已達(dá)最大值，隨著引發(fā)時(shí)間的延長逐漸降低，可能是因?yàn)橐l(fā)時(shí)間過久，造成種子吸脹損傷，甚至因引發(fā)物質(zhì)富集而產(chǎn)生毒害作用［40］。當(dāng)BR 濃度較高時(shí)（10.00 μmol/L），其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)低于其他濃度，平均發(fā)芽時(shí)間高于其他濃度，這可能是因?yàn)闈舛冗^高，引發(fā)時(shí)間的長短均會(huì)對其產(chǎn)生毒害作用，引發(fā)時(shí)間過長或過短時(shí)毒害作用尤為明顯。

該試驗(yàn)的雙因素方差分析結(jié)果表明，不同外源BR 濃度及引發(fā)時(shí)間對老化燕麥種子發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)均存在極顯著（P＜0.01）影響。濃度較高引發(fā)時(shí)間較長時(shí)會(huì)降低老化燕麥種子活力，此時(shí)兩者的累積可能對種子造成損傷，從而降低種子活力。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，燕麥種子在BR 濃度為0.01 μmol/L 引發(fā)24 h 時(shí)其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)最高，分別由CK 的74.00%、14.94、10.70 提高至88.50%、20.08、15.16，此時(shí)，該處理下平均發(fā)芽時(shí)間也是最低，由CK 的2.89 降至2.40；在濃度為10.00 μmol/L 引發(fā)1 h 時(shí)，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)最低，平均發(fā)芽時(shí)間最高。這與在番茄中的研究結(jié)果類似，這可能是因?yàn)槭褂肂R 能夠積極促進(jìn)種子中物質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進(jìn)萌發(fā)能力［41］。

4 結(jié)論

外源油菜素內(nèi)酯引發(fā)對老化燕麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時(shí)間和幼苗活力指數(shù)的影響與其濃度及引發(fā)時(shí)間有密切關(guān)系。低濃度的油菜素內(nèi)酯溶液能有效緩解燕麥種子的老化現(xiàn)象，提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗活力指數(shù)，降低平均發(fā)芽時(shí)間，緩解老化對燕麥種子造成的傷害；高濃度則反之。在該試驗(yàn)中，油菜素內(nèi)酯濃度為0.01 μmol/L 引發(fā)24 h 為最佳處理。