秦海霞，韓 菲，戴研平，劉改萍

（1.烏蘭察布醫(yī)學高等專科學校組胚教研室，內蒙古 烏蘭察布 012000；2.岳陽職業(yè)技術學院臨床醫(yī)學院，湖南 岳陽414000）

砷是一種生殖毒物，當達到一定濃度時，具有較強的雄性生殖毒性［1-2］。砷可損傷生精細胞，引起精子數(shù)量和質量的下降［3］。在精子發(fā)生過程中，各級生精細胞都會發(fā)生凋亡，它是機體清除過量或異常生精細胞的一種重要方式。越來越多的研究證實天冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）在細胞凋亡中起重要作用［4-6］。Caspase-9是線粒體介導的凋亡途徑中的關鍵啟動子，在大鼠的Leydig 細胞表達［7］。從線粒體釋放的細胞色素C與Caspase-9、凋亡蛋白酶激活因子1 結合形成復合物后激活Caspase-9，活化的Caspase-9 剪切并激活Caspase-3，進而促進細胞凋亡［8-9］。該研究通過建立亞慢性砷中毒大鼠模型，利用透射電鏡觀察附睪精子的超微結構，檢測睪丸組織中Caspase-9蛋白的表達，探討砷致生殖系統(tǒng)損害的機制，以期為進一步研究砷的生殖毒理學特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物

健康清潔級10 周齡雄性SD 大鼠40 只，體重為160～220 g，由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號為SCK（黔）2002-0001。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對濕度為60%～65%，正常光照。試驗期間，實驗動物可自由采食和飲水。

1.1.2 主要藥物與試劑

亞砷酸鈉，分析純，購自北京化工廠有限責任公司；Caspase-9 免疫組化鏈霉親和素-生物素復合物（SABC）法檢測試劑盒，武漢博士德生物有限公司產品；睪酮酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒，美國CSB 公司產品；醋酸鈾，上海瑞誠化工有限公司產品；Epon812 環(huán)氧樹脂，沈陽市強華試劑廠產品。

1.1.3 主要儀器設備

9905014 型輪轉式切片機，購自上海Leica 儀器有限公司；BSll0 型電子天平，德國Sartorius 公司產品；EG1150 型包埋機，德國Leica 公司產品；JEE-5B 型真空冷凍干燥機，北京永光明醫(yī)療儀器廠產品；HITCHE-1010 型離子濺射儀，日本日立公司產品；S-3400N 型掃描電鏡，日本日立公司產品；CX21 型普通光學顯微鏡，日本Olympus 公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 亞慢性砷染毒大鼠模型的建立

根據(jù)筆者所在課題組的前期研究并結合相關文獻［10-11］，適應性飼養(yǎng)1 周后，將大鼠隨機分為4組，分別為對照組以及低、中、高劑量染毒組，每組10 只。采用自由飲水方式進行染毒，低、中、高劑量染毒組染毒劑量分別為2.4、12、60 mg/L，連續(xù)染毒14 周。對照組給予蒸餾水。每天觀察大鼠的健康情況，每周測定并記錄大鼠體重。

1.2.2 檢測指標及方法

1.2.2.1 大鼠白細胞計數(shù)及血清TNF-a、IL-1 濃度的檢測

試驗結束時，用血常規(guī)管收集大鼠外周血，利用全自動動物血液分析儀進行白細胞計數(shù)；用采血EP 管收集心臟血液，3 000 r/min 離心8 min，取上清液，放入-20 ℃冰箱待測，嚴格按ELISA 試劑盒說明書步驟進行操作，通過公式換算，得出TNF-α 及IL-1 的濃度值。

1.2.2.2 透射電鏡觀察附睪精子的超微結構

觀察指標：①正常精子頭部形態(tài)（頂體為雙層膜性結構，雙層頂體膜間為低電子密度，核染色質較均勻）；②正常精子尾部形態(tài)（頸部和尾部結構完整，尾部自然彎曲，其中央纖維鞘呈平行排列，可見微管“9+2”結構）；③精子頂體完整狀況、頸部線粒體鞘腫脹情況。

每組隨機取4 只大鼠，在附睪尾部用眼科剪剪出約5 mm 小口，交替擠壓，將精子擠出，用PBS液洗滌3 次并離心（2 000 r/min），每次10 min；取1～2 滴精液標本，采用3%戊二醛固定3 h；PBS 洗3 次，每次15 min，1%鋨酸固定2 h；PBS 洗3 次，每次15 min；30%、50%、70%、90%丙酮梯度脫水各1 次，每次10 min，100%丙酮脫水3 次，每次10 min；環(huán)氧樹脂浸透、包埋、聚合；超薄切片機切片；醋酸鈾染色30 min；檸檬酸鉛染色10 min；透射電鏡觀察精子超微結構并攝片。

1.2.2.3 免疫組化法檢測睪丸組織中間質細胞Caspase-9 蛋白表達情況

染毒結束后，大鼠乙醚麻醉，股動脈放血處死，取左側睪丸分成4 份，迅速置于10%中性甲醛溶液（磷酸鹽緩沖液調節(jié)pH 值至7.4）中固定，備用。常規(guī)方法脫水，用石蠟包埋。取方位相同的標本連續(xù)切片4 張（厚度4 μm），采用免疫組化法檢測Caspase-9 蛋白的表達情況，嚴格按照試劑盒說明書操作。40 倍目鏡下觀察5 個視野，采用Biomias 圖像分析軟件測定陽性細胞的平均光密度值，數(shù)值越高表明Caspase-9 蛋白的表達量越高。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。試驗結果以“平均值±標準差”的形式表示，先進行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，然后進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。若方差齊時，組間兩兩比較用LSD 檢驗，反之用Games-Howell 檢驗；檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 大鼠白細胞計數(shù)及血清TNF-α、IL-1 濃度檢測結果

由表1 可知，隨著亞砷酸鈉染毒濃度的升高，大鼠血清中TNF-α、IL-1 濃度及白細胞計數(shù)均呈上升趨勢。與對照組相比，中、高劑量染毒組大鼠血清中TNF-α、IL-1 濃度及白細胞計數(shù)均顯著升高（F=6.31，P=0；F=7.22，P=0；F=5.07，P=0）。

2.2 精子透射電鏡檢查結果

由圖1 可知，對照組大鼠精子頂體結構完整，厚度及染色均勻，頂體為雙層膜性結構，平行貼于核表面，雙層頂體膜間為低電子密度，胞核染色質均勻；低劑量染毒組與對照組相比，精子結構無明顯變化，頂體胞膜腫脹，核染色質較均勻；中劑量染毒組精子頂體與核分離，胞膜腫脹；高劑量染毒組精子尾部中斷，軸絲排列紊亂。

圖1 亞慢性砷染毒大鼠精子形態(tài)的透射電鏡圖（15 000×）

2.3 大鼠睪丸間質細胞中Caspase-9 蛋白表達檢測結果

光鏡下，各組大鼠睪丸組織中均可見Caspase-9 蛋白表達陽性信號，定位于睪丸間質細胞的細胞質中，呈棕黃色或棕褐色。對照組，陽性細胞染色淺；低劑量染毒組，陽性細胞較對照組染色深；中劑量染毒組，陽性細胞較對照組、低劑量染毒組染色深；高劑量染毒組陽性細胞染色深（見圖2）。由表2 可知，與對照組相比，各劑量染毒組陽性細胞平均光密度值均顯著升高（F=8.50，P＜0.05）。

圖2 免疫組化法檢測大鼠睪丸間質細胞中Caspase-9 蛋白表達情況（400×）

表2 大鼠睪丸間質細胞Caspase-9陽性細胞平均光密度檢測結果

3 討論

機體的生殖發(fā)育過程對外源化學物的作用比較敏感。外源化學物質可干擾機體生殖發(fā)育多個環(huán)節(jié)，并造成損傷作用，對生殖過程的影響范圍廣泛且深遠［12-13］。

動物實驗證實，睪丸巨噬細胞和生精細胞都能分泌大量的TNF，其中，TNF-α 參與影響FSH對支持細胞生精功能的調節(jié)［14］。TNF-α 可增加IL-1 對睪酮分泌的抑制作用，降低Leydig 細胞對促性腺激素的反應敏感性。IL-l 能改變血睪屏障的固有防御功能，增加細菌或氧自由基等有害物質進出睪丸的機會［15］。該研究結果表明，隨著染砷濃度的增加，大鼠血清中TNF-a、IL-1 濃度以及外周血白細胞計數(shù)也增加，中、高劑量染毒組3 項指標與對照組相比差異顯著，推測可能長期砷暴露導致了睪丸的炎癥反應。

電子顯微鏡是目前觀察精子形態(tài)的最有效工具，其分辨率超高［16］。精子分為頭部和尾部，頭部有一個高度濃縮的細胞核，核的前2/3 有頂體。頂體是一種特殊的溶酶體，內含多種水解酶，如頂體酶、透明質酸酶等，在受精過程中發(fā)揮重要作用。該研究中，透射電鏡觀察下可見中、高劑量染毒組大鼠精子胞膜受損，頂體與核分離，核內出現(xiàn)空泡，進一步證實亞砷酸鈉可使精子頂體超微結構改變，胞膜受損，主要表現(xiàn)為頂體內外膜分離，頂體內容物丟失或頂體膜上結合的透明質酸酶等活性降低［17-18］。

生精細胞的凋亡可以有效清除不正常的生精細胞，并嚴格控制生精細胞和支持細胞的適當比例，以保證精子的數(shù)量和質量［19］，維持精子發(fā)生與凋亡的動態(tài)平衡，保證遺傳穩(wěn)定性。但是，如果生精細胞的凋亡程序發(fā)生紊亂，則可能造成雄性不育。Caspase-9 是與線粒體凋亡途徑直接相關的功能蛋白，目前認為Caspase-9 是啟動酶［20］，無機砷通過ROS 積累的間接作用或巰基氧化性的直接作用，誘導線粒體的基質濃縮和滲透通道開放，從而誘發(fā)線粒體損傷并引發(fā)凋亡，使生精細胞凋亡增加，影響精子的發(fā)育，產生生殖毒性。該研究結果顯示，Caspase-9 陽性細胞表達在睪丸間質細胞的細胞質，隨著染砷劑量的增加，Caspase-9 蛋白的表達量增加。砷對睪丸生殖毒性可能的機制是其直接通過對線粒體的損傷，激活Caspase-9 蛋白，引起Caspase 的級聯(lián)反應，使間質細胞凋亡增加。

4 結論

睪丸間質細胞Caspase-9 蛋白表達水平升高可能是亞砷酸鈉致雄性大鼠慢性生殖毒性的機制之一。