趙金兵，王鐵軍，王莫離，石建州，姚倫廣

（1.南陽師范學院，河南 南陽 473061；2.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南 南陽 473000）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的豬科動物廣泛出血性、高病死率傳染?。?］。ASFV 是一種核質(zhì)大DNA 病毒［2］，病毒粒子的直徑260～300 nm，基因組為線性雙鏈DNA，大小為170～194 kb［3］，含有150～167 個開放閱讀框［4］。ASFV 基 因 組 編 碼 多 種 蛋 白［5］，包 括54 種 結(jié) 構 蛋白以及100 多種非結(jié)構蛋白［6］。ASFV 結(jié)構復雜，呈20 面體對稱形態(tài)，具有多層結(jié)構［7-8］，成熟病毒粒子的基因組依次包裹著內(nèi)核芯殼、內(nèi)膜、衣殼和外囊膜［9］。ASFV 基因組編碼的蛋白在病毒生命周期調(diào)控以及免疫逃逸中發(fā)揮著至關重要的作用［10-12］。

ASFV 基因pI215L 編碼的泛素結(jié)合酶的序列與E2 泛素結(jié)合酶的同源性較高。蛋白pI215L 是一種E2 泛素結(jié)合酶（ubiqutin-conjugating enzyme，UBC），也是目前已知的唯一由病毒基因編碼的UBC。pI215L 蛋白發(fā)揮著泛素-蛋白酶體系的核心功能。pI215L 蛋白調(diào)控病毒的感染和復制，具生物學活性，在體外實現(xiàn)自泛素化和泛素化組蛋白等重要功能［13］。pI215L 蛋白參與調(diào)控宿主細胞蛋白泛素化的機制尚不清晰。該研究對pI215L 進行生物信息學分析，解析蛋白結(jié)構和功能，探索其調(diào)控ASFV 復制和感染宿主的結(jié)構基礎及分子機制，也為研發(fā)抗ASFV 藥物和ASFV 新型減毒疫苗提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 pI215L 基因同源性分析

從ASFV 數(shù) 據(jù) 庫 （The African Swine Fever Virus Database，ASFVdb）（http：//asfvdb.popgenetics.net/）下載29 個不同毒株的pI215L 基因序列，使用DNAMAN 6.0 和DNAStar 7.0 軟件分析核苷酸序列的同源性及遺傳進化關系。

1.2 pI215L 蛋白理化性質(zhì)預測

利用ExPASy 網(wǎng)站ProtParam 在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析pI215L 蛋白的氨基酸組成等理化性質(zhì)。

1.3 pI215L 蛋白二級結(jié)構預測

利 用SOPMA（http：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page =npsa_sop -ma.html）對pI215L 蛋白的二級結(jié)構進行在線分析；運用SMART 程序預測pI215L 蛋白的功能結(jié)構域。利用在線軟件STRING （https：//cn.string-db.org/）分析與pI215L 相互作用的蛋白。

1.4 pI215L 蛋白線性表位預測與三維空間位置

使用DNAStar 7.0 軟件的Protean 程序預測pI215L 蛋白的B 細胞抗原表位，分析氨基酸序列，包括親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面暴露區(qū)。運用Kyte-Doolittle 的氨基酸親水標準進行疏水性預測；根據(jù)Karplus-Sohulz 的柔性蛋白預測方案分析柔性區(qū)域位；根據(jù)Emini 原則預測表面暴露區(qū)；根據(jù)Jameson-Wolf 抗原指數(shù)方案預測B 細胞抗原表位。利用SWISS-MODEL 同源建模，定位抗原表位的三維空間位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源性分析

DNAMAN 分析結(jié)果顯示，29 個不同ASFV 毒株的一致性是93.25%，分離自中國的5 個ASFV毒株（China_HLJ_2018、China_ASFV-SY18_2018、China_AnhuiXCGQ_2018、China_wbBS01_2018、China_LN_2018）的pI215L 基因核苷酸序列同源性為100%。DNAStar 分析結(jié)果顯示，不同毒株的pI215L 基因核苷酸序列同源性較高，29 個毒株的pI215L 基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果見圖1，進化樹分析結(jié)果見圖2。

圖1 29 種ASFV 毒株pI215L 核苷酸序列同源性比較

2.2 理化性質(zhì)

通過ExPASy 網(wǎng)站PortParam 在線軟件分析pI215L 蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，pI215L 蛋白共有3360 個原子組成，其分子式為C1087H1642N264O358S9，相對分子質(zhì)量為24 425.09；由212 個氨基酸組成，谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）所占比例較高，分別為13.2%、9.4%、8.5%；其中帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為19 個，帶負電荷的殘基（Asp+Glu）總數(shù)為48 個；理論等電點（pI）為4.21；在哺乳動物體外網(wǎng)織紅細胞中半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為71.79，不穩(wěn)定系數(shù)為58.16，歸類為不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.700。

2.3 pI215L 蛋白二級結(jié)構、功能結(jié)構域分析與蛋白互作關系預測

通過ExPASy 網(wǎng)站的SOPMA 工具對pI215L蛋白氨基酸序列的二級結(jié)構進行預測。結(jié)果表明，其二級結(jié)構主要含有α-螺旋（Hh）、延伸鏈（Ee）、β-轉(zhuǎn)角（Tt）、無規(guī)卷曲（Cc）4 種形式。其中，Hh 有79 個氨基酸，占37.26%；Ee 有37 個氨基酸，占17.45%；Tt 有14 個氨基酸，占6.60%；Cc 有82 個氨基酸，占38.68%（見圖3），4 種結(jié)構貫穿整條氨基酸鏈。

圖3 pI215L 二級結(jié)構分析結(jié)果

SMART 分析pI215L 蛋白功能結(jié)構域結(jié)果見圖4，pI215L 蛋白有1 個泛素化結(jié)合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme E2）結(jié)構域，屬于催化結(jié)構同系物，位于第4～160 位氨基酸殘基處UBCc 結(jié)構域。位于第193～212 位氨基酸有1 個低復雜域。

圖4 pI215L 蛋白的結(jié)構域分析

pI215L 蛋白互作關系預測見圖5，pI215L 蛋白與UBE2Q1、UBE2H、UBE2U、UBE2J2 和UBE2G2、UBE2F、UBE2V2、CDC34、UBA1 等蛋白存在相互作用關系。

圖5 pI215L 蛋白互作關系預測

2.4 pI215L 線性表位預測結(jié)果與表位的三維空間位置

利用DNAStar 的Protean 預測pI215L 的親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面暴露區(qū)，結(jié)果見圖6。柔性區(qū)段主要有第15～22、25～32、38～52 氨基酸等15 處；親水區(qū)主要位于第7～9、12～33、41～50 氨基酸等7 處；B 細胞抗原表位可能有第1～2、12～33、35～46 氨基酸等12 處；表面暴露區(qū)主要在第10～11、16～20、26～32 氨基酸等17 處。綜合分析同時符合4 個指標（親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面暴露區(qū)）的肽段，預測結(jié)果顯示，pI215L 蛋白的抗原表 位 的 肽 段 位 共 16 處 ：16ELKSL20、26EGFRITLV32、41WEVAI45、58FKA60、64FPI66、81MW82、92VKISILH98、102DDPQSG107、120VRTILLS126、133EPNTFS138、140ANVDASVM147、15 2RDSKGKDK159、162AEIIRKQ168、180GV181、183 VPTTLAEYCI196、202YDDEDEEEEDD211（見表1）。

表1 Protean 預測的抗原表位

圖6 pI215L 蛋白的抗原表位的肽段位的預測

對pI215L 蛋白三級結(jié)構進行預測分析，使用SWISS-MODEL 軟件同源建模，與PDB 數(shù)據(jù)庫中的6NYO.1（ubiquitin-conjugating enzyme E2 R2 和ubiquitin）的同源性達46.06%，構建pI215L 蛋白三級結(jié)構模型。使用PyMOL 軟件將預測的pI215L蛋白抗原表位在模型中的分布準確定位，圖7 中綠色部分表示氨基酸個數(shù)超過5 個的表位，紅色部分表示氨基酸個數(shù)小于等于5 個的表位。

3 討論與結(jié)論

ASF 是我國當前最為嚴重的外來豬病，被列為一類動物傳染病。雖然該病已流行百年，但人們對ASFV 的蛋白結(jié)構與功能、病毒與宿主互作關系、病原致病與機體免疫機制等關鍵科學問題認識有限。解析ASFV 抗原蛋白結(jié)構與功能，繪制ASFV 與宿主的互作網(wǎng)絡，為深入研究病毒感染和免疫逃逸機制提供科學理論基礎［14］。泛素化是通過酶促反應進行的，泛素與泛素結(jié)合酶E2 的活性位點的半胱氨酸殘基結(jié)合形成硫酯鍵，泛素連接酶完成泛素由E2-UB 轉(zhuǎn)移至特定底物蛋白的生物過程，是一種可逆的蛋白翻譯后修飾，具有調(diào)控信號轉(zhuǎn)導、細胞轉(zhuǎn)錄、細胞凋亡、細胞周期、抗病毒應答等功能。蛋白酶體介導的蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解，這一途徑在調(diào)節(jié)細胞生存所需的多個基本生物過程中發(fā)揮作用。病毒借助泛素化修飾完成免疫逃逸，利用病毒自身編碼的泛素連接酶E3 或去泛素化酶實現(xiàn)免疫逃逸，增強病毒的感染力。pI215L 與泛素結(jié)合蛋白同源，病毒感染宿主，與細胞40S 核糖體蛋白RPS23 相互作用，pI215L 結(jié)合翻譯起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E），進而影響哺乳動物雷帕霉素靶蛋 白 （mammalian target protein of rapamycin，mTOR）信號通路，參與病毒DNA 復制與轉(zhuǎn)錄［15-16］。pI215L 調(diào)節(jié)宿主的翻譯機制，調(diào)控宿主細胞蛋白的表達和亞細胞定位，但發(fā)揮作用的功能機制有待于深入研究和探索［17-18］。

生物信息學分析結(jié)果顯示，29 個不同毒株的同源性分析證實pI215L 的核苷酸序列大概分為歐洲分支和非洲分支，分離自中國的毒株與歐洲分支的親緣關系較近。pI215L 蛋白是由212 個氨基酸組成，分子量24.4 kDa，等電點4.21，性質(zhì)不穩(wěn)定，親水蛋白。二級結(jié)構影響線性B 細胞表位，蛋白親水性氨基酸含量越高，肽段越柔韌，越容易抗原抗體嵌合［19］。pI215L 蛋白有1 個E2 泛素化結(jié)合酶功能結(jié)構域，屬于催化結(jié)構同系物，這與蛋白互作關系預測結(jié)果一致，推測pI215L 蛋白與UBE2Q1、UBE2H、UBE2U、UBE2V2、CDC34、UBA1等存在相互作用關系，這些蛋白具有類同的功能。線性表位預測有16 處的肽段是潛在的表位。采用SWISS-MODEL 軟件同源建模，與PDB 數(shù)據(jù)庫中的6NYO.1 的同源性達46.06%，利用PyMOL 定位了表位肽段在蛋白三維空間的相對位置。該研究為ASFV 蛋白后續(xù)結(jié)構解析、功能深入研究、疫苗和藥物研制等提供了重要的數(shù)據(jù)基礎。

pI215L 啟動干擾泛素機制，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、復制和衣殼化等過程，催化位點Cys85 是ASFV 發(fā)揮泛素結(jié)合功能和抑制宿主蛋白合成功能的酶的活性位點［15］。UBCv1 蛋白環(huán)境耐受性較強，pH 值為4～9，4～42 ℃保持催化能力［20］。在酸性依賴去甲基化或EIPA 抑制前，動態(tài)蛋白和網(wǎng)格蛋白介導的細胞進入后，UBCv1 的表達隨即開始。UBCv1 在細胞質(zhì)和細胞核中的彌散分布可能與病毒蛋白和宿主蛋白的泛素化作用有關，感染早期主要分布在細胞核；晚期，在細胞質(zhì)中也能夠檢測到，動態(tài)穿梭于細胞核和細胞質(zhì)［18］。鑒定感染細胞可溶性成分存在單泛素化、雙泛素化以及多泛素化，產(chǎn)生不同的底物泛素化結(jié)構對不同靶標的宿主或病毒蛋白至關重要，表明pI215L 可能參與了多種調(diào)控途徑。pI215L 是一種非常早期的病毒蛋白，不依賴病毒DNA 復制，與早期表達蛋白CP204L 表達譜相似，在感染晚期逐漸積累。病毒感染早期開始轉(zhuǎn)錄，2 h和16 h 出現(xiàn)兩個轉(zhuǎn)錄高峰，表明pI215L 可能參與病毒轉(zhuǎn)錄、基因組復制等不同階段的病毒生命周期，在感染宿主過程中發(fā)揮著重要作用［15］。感染4～20 h 后，pI215L 被招募到“病毒工廠”。pI215L參與病毒的晚期轉(zhuǎn)錄，pI215L 下調(diào)導致B646L 轉(zhuǎn)錄本減少，ASFV 基因組復制、病毒晚期轉(zhuǎn)錄和子代產(chǎn)生是通過泛素途徑介導的，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在ASFV 感染宿主中發(fā)揮著作用［20］。

機體先天免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防線，干擾素（IFN）是先天免疫應答的重要組成成分，ASFV 如何逃逸宿主的先天免疫系統(tǒng)的防御，干擾素與病毒感染關系不明晰。新的研究通過siRNA 降低蛋白pI215L 的表達，ASFV 復制抑制顯著，但增強了病毒誘導IFN-β 和ISG56 的生成；通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜檢測到和pI215L 互作的E3 泛素連接酶RNF138，pI215L 招募RNF138；促 進RNF138 降 解RNF128，抑 制RNF128 對TBK1 的K63 位泛素化修飾，最終抑制了IFN-β的生成；研究發(fā)現(xiàn)pI215L 能夠抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，并且顯著影響干擾素產(chǎn)生的抑制作用，進而闡明了pI215L 抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機制，揭示了ASFV 免疫逃逸的新機制［21］。拮抗干擾素產(chǎn)生的基因與病毒致病力密切相關，如果缺失病毒拮抗IFN 產(chǎn)生的基因?qū)闇p毒疫苗的研發(fā)提供新思路，是研制ASFV 疫苗的有效策略之一。

綜上所述，該研究利用生物信息學分析了ASFV 的基因編碼的pI215L 蛋白的進化和同源性、理化性質(zhì)、結(jié)構與功能以及抗原的表位等，可為pI215L 的生物學功能以及病毒相關致病性機制的進一步研究提供必要的數(shù)據(jù)參考。