姚雅鑫,劉函西,王偉偉,張禮寧,孫風麗,張 超,奚亞軍

(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)小麥生物學與遺傳育種重點實驗室,陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上栽培歷史悠久,且分布廣泛的三大谷物之一,人類約 21%食物熱量和 20%蛋白質(zhì)都是由小麥提供[1]。小麥主要依靠種子進行有性繁殖,種子的休眠與萌發(fā)是其生命周期中的關鍵過程,也是作物產(chǎn)量的重要性狀[2]。小麥生長開始于種子的萌發(fā),種子在適宜條件下萌發(fā)對幼苗形成以及后期的營養(yǎng)生殖階段都具有重要的意義[3-4]。而種子休眠決定了發(fā)芽時間[5],休眠在成熟期間建立[6],期間休眠水平逐漸增加,并在新鮮成熟的種子中達到最大值[7]。在隨后干燥儲存過程中,種子休眠被逐漸解除,直到種子可以通過感知和整合一系列環(huán)境信號來決定萌發(fā)的時間[8]。若在種子發(fā)育成熟期間遇到高溫多雨天氣,種子強休眠性能避免穗發(fā)芽現(xiàn)象發(fā)生,從而減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失[9-10]。小麥品種銘賢169是占我國小麥種植面積60%以上的黃淮麥區(qū)廣泛使用的抗條銹病育種誘發(fā)材料。有研究表明,銘賢169種子具有較高的抗穗發(fā)芽能力,休眠性極強,是研究作物抗穗發(fā)芽的理想材料[11-12]。然而,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上,對于小麥種子播種后需要快速均勻發(fā)芽和生長方面來說,種子休眠通常是一種不利特性,因為長時間的休眠會導致小麥出苗率低、萌發(fā)不整齊,且易產(chǎn)生秋季田間混雜,對作物產(chǎn)量非常不利[5,13-14]。因此挖掘種子萌發(fā)相關基因,對銘賢169的休眠性進行改良,在實際育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上都具有非常重要的現(xiàn)實意義。

TIFY家族是植物中一類特異性轉(zhuǎn)錄因子,是一組參與茉莉酸(JA)代謝過程的特異性蛋白,含有高度保守的TIF[F/Y]XG氨基酸序列[15]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的組成和進化特點,又可分成四個亞家族:TIFY、JAZ、ZML 和 PPD[16-17],其中,JAZ 亞家族屬于分布最廣泛及數(shù)目最多的一個家族[16]。目前已經(jīng)鑒定JAZ家族在植物的生長發(fā)育及脅迫響應等方面發(fā)揮著重要作用。在擬南芥中過表達甘藍型油菜(BrassicanapusL.)BnC08.JAZ1-1基因,可能通過調(diào)節(jié)參與泛素-蛋白酶體途徑和磷脂代謝途徑的下游反應基因的表達來調(diào)節(jié)種子重量,導致種子重量的增加[18]。過表達CmJAZ1的菊花(Chrysanthemummorifolium)植株中,由于Jas 結(jié)構(gòu)域的缺失導致菊花開花時間變晚[19]。在番茄(SolanumlycopersicumL.)中過表達SlJAZ2,可使植株葉片生長更快,降低株高和節(jié)間長度,使毛狀體減少,側(cè)芽萌發(fā)更早,進而使植株花期提前,并且調(diào)控開花時間的基因顯著上調(diào)表達,SlJAZ2加速了從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變[20]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中JAZ7的過表達可通過調(diào)節(jié)光合作用、氧化還原、氨基酸、植物激素以及防御代謝產(chǎn)物來提高植株的耐旱性[21]。OsJAZ1(OsTIFY3)可與OsbHLH148互作,提高水稻(OryzasativaL.)的耐旱性[22]。有研究表明,JAZ家族基因還參與種子萌發(fā)過程的調(diào)節(jié)[23]。擬南芥AtJAZ3通過與AtABI5互作,抑制AtABI5的轉(zhuǎn)錄活性參與調(diào)節(jié)種子萌發(fā),是種子萌發(fā)的正向調(diào)節(jié)因子,負調(diào)節(jié)ABA信號轉(zhuǎn)導途徑。在小麥中過表達TaJAZ1(與擬南芥JAZ3同源性最高)也能促進種子萌發(fā),是小麥穗發(fā)芽的正向調(diào)節(jié)因子,與擬南芥存在相同的互作關系[23]。

本研究通過分析銘賢169小麥萌發(fā)種子和休眠種子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選獲得了差異表達基因TaJAZ1。以銘賢169為試驗材料,分離克隆TaJAZ1基因,并通過生物信息學分析、亞細胞定位、表達模式分析以及擬南芥jaz3突變體、過表達TaJAZ1擬南芥和水稻表型分析,進一步驗證TaJAZ1參與調(diào)節(jié)種子萌發(fā)的功能,為改良銘賢169等休眠性強的小麥品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥品種銘賢169、本氏煙草、水稻日本晴、Columbia(Col-0) 野生型擬南芥(均由西北農(nóng)林科技大學小麥與柳枝稷遺傳改良研究團隊提供),T-DNA插入突變體jaz3擬南芥(SALK_067825.56.00.x)購自擬南芥生物資源中心(TheArabidopsisBiological Resource Center, ABRC,美國)。

1.2 小麥TaJAZ1基因的克隆

研究基于前期對銘賢169小麥萌發(fā)和休眠種子的轉(zhuǎn)錄組測序分析(NCBI登錄號:PRJNA638000),篩選獲得了萌發(fā)與休眠的差異表達基因TaJAZ1(TraesCS5A02G204900.1),通過Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫下載獲得其CDS序列。以銘賢169萌發(fā)和休眠種子為材料,采用 Trizol試劑盒(江蘇,康為世紀)提取材料中的總 RNA,利用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 大連,中國)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Primer Premier 5.0設計基因特異引物TaJAZ1-F/R(表1),用高保真酶KOD FX(TaKaRa,京都,日本)擴增編碼區(qū)全長,PCR 反應體系為:PCR Buffer for KOD FX 25 mL,2 mmol·L-1dNTPs 10 mL,基因上下游混合引物(10 mmol·L-1) 1.5 mL,模板cDNA 1 mL,KOD FX (1.0 U·mL-1) 1 mL,無菌水補充至50 mL。PCR 擴增程序:94 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,68 ℃延伸2 min,32 個循環(huán);68 ℃終延伸5 min。PCR擴增后,用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,產(chǎn)物用DNA純化回收試劑盒(天根,北京)回收。使用T4DNA連接酶(Thermo, 美國)將目標片段與pMD18-T載體連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α(唯地, 上海)。經(jīng)PCR檢測正確的菌液送楊凌奧科生物公司進行測序,測序正確的提取質(zhì)粒命名為pMD18-T-TaJAZ1。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in thestudy

1.3 小麥TaJAZ1基因的生物信息學分析

對小麥TaJAZ1基因進行初步生物信息學分析:通過Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)網(wǎng)站獲取基因CDS、蛋白、編碼區(qū)上游2 000 bp序列;利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)在線網(wǎng)站分析TaJAZ1蛋白的理化性質(zhì)和親/疏水性;在SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)在線網(wǎng)站預測TaJAZ1蛋白的二級結(jié)構(gòu);于NCBI-BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上進行序列比對,獲取TaJAZ1在不同物種中的同源蛋白序列,結(jié)合DNAMAN8.0軟件對TaJAZ1在不同物種中的同源序列進行多重序列比對和同源性分析,用MEGA7.0.14軟件繪制系統(tǒng)進化樹;在PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/)在線網(wǎng)站分析基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp的啟動子區(qū)順式作用元件。

1.4 小麥TaJAZ1基因的亞細胞定位

利用Primer Premier 5.0設計引物TaJAZ1-GFP-F/R(表1),以pMD18-T-TaJAZ1質(zhì)粒為模板進行PCR擴增,并用限制性內(nèi)切酶BglⅡ(Thermo, 美國)對PCEGFP熒光載體進行單酶切。將回收純化的PCR產(chǎn)物以及酶切的線性化載體按照DNA 無縫克隆試劑盒 ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(Vazyme, 美國)說明書進行同源重組,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α。檢測正確的菌液提取重組質(zhì)粒pCEGFP-TaJAZ1-GFP。利用凍融法將pCEGFP空載和pCEGFP-TaJAZ1-GFP重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105(唯地, 上海)中,亞細胞定位參考王蒙蒙等[24]實驗方法進行。

1.5 小麥TaJAZ1基因的表達模式分析

選取銘賢169花后10、15、20、25、30、35和40 d大小均勻一致的籽粒,液氮速凍后保存在-80 ℃?zhèn)溆?。取完熟期飽滿大小均勻一致的銘賢169種子,經(jīng)消毒后放于培養(yǎng)皿中 ,加入50 μmol·L-1ABA溶液進行處理(25 ℃暗培養(yǎng)箱),分別在0、2、6、12、24和48 h后取樣,液氮速凍后保存在-80 ℃?zhèn)溆谩Ｓ肨rizol法提取材料中的總 RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以小麥Actin基因為內(nèi)參,以TaJAZ1-q-F/R為引物(表1),參照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa,日本)說明書進行qRT-PCR,反應程序為: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s; 60 ℃ 30 s;40 個循環(huán)。每個樣品重復3次,采用2-△△CT方法計算相對表達量。

1.6 小麥TaJAZ1基因過表達擬南芥的轉(zhuǎn)化和jaz3突變體的鑒定及表型分析

以pMD18-T-TaJAZ1質(zhì)粒為模板,利用帶有Hind Ⅲ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點的引物TaJAZ1-OE-F/R進行PCR擴增,并用這兩個內(nèi)切酶(Thermo, 美國)對pGreenⅡ-OE過表達載體雙酶切,將二者回收后按照DNA 無縫克隆試劑盒操作說明進行同源重組,后續(xù)方法同1.4,最終獲得pGreenⅡ-OE-TaJAZ1重組質(zhì)粒。利用凍融法將其轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101(唯地, 上海)中,采用花絮侵染法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。通過噴施草甘膦(4 mg·L-1)篩選陽性苗,并采用超光速Mix(MF848)試劑盒(聚合美生物,北京)獲取葉片PCR擴增模板,利用Bar基因引物檢測,去除假陽性植株并繼續(xù)篩選至T3代,得到純合單拷貝株系。用Trizol法提取材料中的總 RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以擬南芥Actin為內(nèi)參基因,通過半定量檢測TaJAZ1能否在過表達擬南芥中正常表達。利用三引物法檢測jaz3突變體擬南芥,通過超光速Mix(MF848)試劑盒獲取葉片擴增模板,分別用左邊界序列(LP)引物 +右邊界序列(RP)引物和通用(LBb1.3)引物+ RP引物(表1)進行PCR反應。

將擬南芥種子經(jīng)消毒處理后點播在含有ABA (0、0.25、0.5和0.75 μmol·L-1)的1/2 MS 培養(yǎng)基上,經(jīng)4 ℃低溫春花后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(23 ℃, 16 h 光照/8 h 黑暗),每天統(tǒng)計一次發(fā)芽率并拍照,重復3次,每個株系不少于30粒。

用0.75 μmol·L-1ABA處理擬南芥種子,分別于0、2和6 h后取樣,提取RNA,檢測ABA信號通路中ABI5基因的相對表達量變化,方法同1.5。

1.7 小麥TaJAZ1基因過表達水稻的獲得及鑒定

用1.4相同的方法克隆獲得帶有酶切位點KpnⅠ和BglⅡ的基因產(chǎn)物,并將其連接到改造后的過表達載體pCAMBIA1302+ubi+NOS上,得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1302+ubi+NOS-TaJAZ1。用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105中,將PCR檢測正確的菌液送至武漢伯遠生物有限公司進行水稻日本晴的遺傳轉(zhuǎn)化,獲得T1代轉(zhuǎn)化植株。用Hyg基因引物檢測陽性苗,以水稻Actin為內(nèi)參基因,檢測TaJAZ1在過表達水稻中的表達量。將水稻種子消毒處理后,放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中,在光照培養(yǎng)箱(28 ℃/25 ℃,16 h 光照/8 h 黑暗)做萌發(fā)實驗,每天統(tǒng)計發(fā)芽率并拍照,重復三次,每皿不少于35粒。

用20 μmol·L-1ABA處理水稻種子,分別于處理0、2和6 h后取樣,用Trizol法提取材料中的總 RNA,檢測 ABA信號通路中ABI5基因的相對表達量變化,方法同1.5。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析,用SPSS 軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaJAZ1基因的克隆

以銘賢169休眠與萌發(fā)種子總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用特異性引物TaJAZ1-F/R進行PCR擴增,克隆TaJAZ1的CDS序列(1 230 bp),結(jié)果顯示約1 300 bp處有特異性條帶(圖 1),與預期大小相符,并且測序結(jié)果與基因序列完全一致。

M:DL2000;1～2:TaJAZ1圖1 小麥銘賢169TaJAZ1基因CDS擴增 Fig. 1 CDS amplification product of TaJAZ1 gene from Mingxian 169

2.2 TaJAZ1基因生物信息學分析

2.2.1 TaJAZ1蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy-ProtParam對TaJAZ1蛋白序列分析顯示,TaJAZ1基因CDS序列長度為1 230 bp,編碼409個氨基酸,該蛋白的等電點為10.09,相對分子質(zhì)量為43 254.63 Da,不穩(wěn)定系數(shù)為67.98,是不穩(wěn)定蛋白。在組成TaJAZ1蛋白的所有氨基酸中,丙氨酸(Ala)含量最高,占總氨基酸量的13.9%;色氨酸(Trp)含量最低,占比為0.2%;其中,含有26個帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu),43個帶正電荷的氨基酸殘基殘基 (Arg+Lys);脂肪族氨基酸總數(shù)為58.14;該蛋白的平均疏水指數(shù)為-0.474,是疏水性蛋白(圖2A)。二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)(圖2B),TaJAZ1蛋白含有22.00%α-螺旋,12.96%延伸鏈,2.93%β-轉(zhuǎn)角和62.10%無規(guī)則卷曲。

A:TaJAZ1蛋白親/疏水性; B:TaJAZ1蛋白二級結(jié)構(gòu),藍色代表α-螺旋,紅色代表延伸鏈,綠色代表β-轉(zhuǎn)角,紫色代表無規(guī)則卷曲。A: Nucleophilic and hydrophobic of TaJAZ1 protein; B: Secondary structure of TaJAZ1 protein, with α-helix in blue, extended strand in red,β-turn in green, and random coil in purple.圖 2 TaJAZ1蛋白親疏水性及二級結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Analysis of hydrophobicity and secondary structure of TaJAZ1 protein

2.2.2 TaJAZ1蛋白同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI-Blast數(shù)據(jù)庫進行同源比對,篩選與TaJAZ1親緣關系較近的蛋白序列,并利用MEGA7.0構(gòu)建進化樹。結(jié)果(圖3)顯示,TaJAZ1與野生二粒小麥(XP_037434392.1)、水稻(NP_001390678.1)和玉米(NP_001141029.1)等單子葉植物中JAZ蛋白處于一大分支,而雙子葉植物擬南芥(NP_566590.1)和大豆(XP_003525246.2)中JAZ蛋白聚為單獨的一支。其中TaJAZ1與野生二粒小麥的JAZ蛋白親緣關系最近,并且麥類作物都聚為一支,說明TaJAZ1蛋白在麥類作物中具有高度的保守性。

圖3 TaJAZ1蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of TaJAZ1

2.2.3TaJAZ1啟動子順式作用元件分析

為了進一步解析TaJAZ1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,利用在線預測網(wǎng)站PLANTCARE對TaJAZ1基因起始密碼子上游約2 000 bp序列進行分析,結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn),TaJAZ1的啟動子區(qū)域除含有TATA-box、CAAT-box兩個基礎順式作用元件外,還含有許多光、激素響應元件和逆境響應元件。如茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif、TGACG-motif,脫落酸響應元件ABRE,水楊酸響應元件TCA-element。此外還有光響應元件G-box、GATA-motif、TCCC-motif、I-box、AE-box、Sp1、ox 4,參與干旱誘導的響應元件MBS,參與晝夜節(jié)律控制順式作用調(diào)節(jié)元件circadian,低溫響應元件LTR,與分生組織表達相關順式作用元件CAT-box以及參與缺氧特異性誘導的作用元件GC-motif、ARE。啟動子分析結(jié)果表明,TaJAZ1基因可能受光、多種植物激素及生物和非生物脅迫調(diào)控。

2.3 TaJAZ1亞細胞定位

將含有重組載體PCEGFP-TaJAZ1-GFP和空載PCEGFP的菌液分別注射煙草葉片,通過煙草瞬時表達驗證該蛋白的具體定位。結(jié)果(圖 4)表明,空載PCEGFP在細胞膜和細胞核中都具有較強的熒光信號,而含有目的基因的重組載體PCEGFP-TaJAZ1-GFP也在細胞膜和細胞核中均能觀察到熒光信號,表明TaJAZ1定位在細胞膜和細胞核中。

圖4 TaJAZ1 蛋白的亞細胞定位Fig. 4 Subcellular localization of TaJAZ1 protein

2.4 TaJAZ1表達模式分析

2.4.1TaJAZ1在種子發(fā)育不同時期的表達模式

種子發(fā)育時期是研究種子休眠與萌發(fā)基因功能的關鍵時期,本研究對花后不同時間的銘賢169種子取樣,通過實時熒光定量PCR檢測TaJAZ1的表達量。結(jié)果(圖5A)顯示,隨著小麥種子的發(fā)育,TaJAZ1的表達呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。尤其是花后30 d時,該基因的表達量是花后10 d表達量的2倍多,此時隨著種子的發(fā)育,種子活力最高,淀粉含量增加[25],可能是是穗發(fā)芽極易發(fā)生的時期。之后隨著種子的成熟,該基因的表達量又迅速下降,在花后40 d時,其表達量相較于花后初期下降了五分之四,進一步說明TaJAZ1對種子休眠起負調(diào)控作用,是種子萌發(fā)的正向調(diào)控因子。

A:TaJAZ1在種子發(fā)育不同時期的表達模式;B:ABA處理對小麥TaJAZ1的誘導;圖柱上無相同字母表示相對表達量在不同時間之間差異達顯著水平(P<0.05)。下圖同。A: Expression pattern of TaJAZ1 at different stages of seed development; B: Expression level of TaJAZ1 induced by ABA treatment.Different normal letters above the columns indicate significant differences of relative expressions among different stages (P<0.05). The same in the following figures.圖5 小麥TaJAZ1基因的表達模式Fig. 5 Expression profiles of wheat TaJAZ1 gene

2.4.2TaJAZ1在ABA處理下的表達模式

在許多物種中,脫落酸ABA是種子休眠誘導和維持的正調(diào)控因子,是種子萌發(fā)的負調(diào)控因子[26]。因此本研究用50 μmol·L-1ABA對銘賢169種子進行處理,通過qRT-PCR分析對TaJAZ1的誘導。在ABA處理下(圖5B),該基因受到上調(diào)表達,但隨時間變化表達量各不相同。TaJAZ1的表達呈先上升后下降的變化趨勢,在24 h處理時表達量達到最大,顯著高于處理0 h的表達量,處理48 h后表達量有所下降,但仍顯著高于0 h的表達量,是0 h表達量的8.9倍,表明ABA能誘導TaJAZ1的表達。

2.5 TaJAZ1過表達擬南芥和jaz3突變體表型分析

2.5.1TaJAZ1過表達擬南芥和jaz3突變體陽性苗鑒定

通過花絮侵染法獲得TaJAZ1過表達擬南芥,經(jīng)篩選共獲得5個TaJAZ1過表達T3代陽性株系(圖6A)。jaz3突變體利用三引物法檢測,結(jié)果(圖6B)顯示,LP+RP引物對只在野生型擬南芥中擴增出條帶,而在jaz3突變體中沒有帶,LBb1.3+RP引物對只在jaz3突變體有條帶,表明所獲得擬南芥jaz3突變體是純合突變體。

M:DL2000;1～2:水;3～4:野生型擬南芥(WT); A:TaJAZ1過表達擬南芥PCR檢測。 5～9:TaJAZ1過表達擬南芥;B:擬南芥jaz3突變體PCR檢測。5～10:jaz3突變體;1、3、5、7、9所用引物為LP+RP,2、4、6、8、和10所用引物為 LBb1.3+RP;C:過表達擬南芥TaJAZ1的表達鑒定. 5～9:TaJAZ1過表達擬南芥。M: DL2000; 1-2: Water; 3-4: Wild type Arabidopsis (WT); A: PCR detection of TaJAZ1 in overexpressed Arabidopsis. 5-9: TaJAZ1 overexpressed Arabidopsis; B: PCR detection of Arabidopsis jaz3 mutant. 5-10: jaz3 mutant; The primers used for 1, 3, 5, 7 and 9 were LP+RP, and the primers used for 2, 4, 6, 8 and 10 were LBb1.3+RP ; C: Expression and identification of TaJAZ1 in overexpressed Arabidopsis. 5-9: TaJAZ1 overexpressed Arabidopsis.圖6 TaJAZ1過表達擬南芥和jaz3突變體檢測Fig. 6 Detection of TaJAZ1 in overexpression lines of Arabidopsis and jaz3 mutant

2.5.2 RT-PCR檢測過表達擬南芥TaJAZ1的表達

通過 RT-PCR 進行半定量分析發(fā)現(xiàn),TaJAZ1在這5個過表達株系中均能正常表達,而在野生型擬南芥中不表達(圖 6C)。

2.5.3TaJAZ1過表達擬南芥和jaz3突變體種子萌發(fā)表型

為進一步分析TaJAZ1在種子萌發(fā)方面的作用,將擬南芥WT、jaz3突變體以及隨機選取的兩株過表達株系OE-1和OE-2的種子分別置于添加不同濃度ABA的1/2MS培養(yǎng)基上做發(fā)芽實驗。結(jié)果表明,在1/2MS 培養(yǎng)基上,野生型和突變體的萌發(fā)率無明顯差異,而兩個過表達株系的萌發(fā)率始終高于野生型和突變體的萌發(fā)率,但差異不顯著(圖7A)。同1/2MS處理下的萌發(fā)率相比,在不同濃度ABA處理下(圖7),野生型、jaz3突變體和過表達擬南芥的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均受到了不同程度的抑制,且隨著ABA濃度的升高,抑制程度逐漸加深(圖7D),但發(fā)芽勢始終是TaJAZ1過表達>野生型 >jaz3突變體。這些結(jié)果再次證明,TaJAZ1是種子萌發(fā)的正向調(diào)節(jié)因子,對ABA不敏感,可能在ABA信號轉(zhuǎn)導途徑中起負調(diào)控作用。

A:擬南芥種子在1/2MS上的萌發(fā)率;B、C、D分別代表不同濃度ABA 處理下擬南芥種子萌發(fā)率;E:不同濃度ABA處理7 d后擬南芥種子的發(fā)芽率;WT:野生型擬南芥;jaz3:jaz3突變體;OE-1、OE-2分別代表兩個TaJAZ1過表達擬南芥植株;數(shù)據(jù)為3 次獨立生物學重復的平均值±標準差。A: seed germination rate of Arabidopsis on 1/2MS; B, C, D: seed germination rates of Arabidopsis treated with different concentrations of ABA; E: Germination rate of Arabidopsis seeds treated with different concentrations of ABA for 7 days; WT: Wild type Arabidopsis; jaz3: jaz3 mutant Arabidopsis; OE-1 and OE-2 respectively represent two Arabidopsis plants overexpressing TaJAZ1. Data are mean±standard deviation of three biological replicates.圖7 擬南芥種子萌發(fā)率Fig.7 Seed germination rates of Arabidopsis

2.5.4 qRT-PCR檢測擬南芥 ABA信號通路基因ABI5的表達量變化

ABI5(ABA-INSENSITIVE 5)基因編碼一種bZIP類轉(zhuǎn)錄因子,在ABA信號通路中起核心作用,當種子經(jīng)ABA等滲透脅迫處理后,能在短時間內(nèi)被誘導上調(diào)表達[27-29]。鑒于在擬南芥種子萌發(fā)試驗中TaJAZ1對ABA不敏感,可能是ABA信號通路的負調(diào)控因子,研究分析了ABA信號通路基因ABI5在擬南芥種子受到ABA處理后的誘導情況。結(jié)果表明(圖8),在ABA處理后,ABI5基因在各植株中均上調(diào)表達,但上調(diào)程度各不相同。在過表達TaJAZ1的擬南芥種子中,ABI5受誘導程度明顯低于在jaz3突變體中的誘導程度,野生型擬南芥中ABI5誘導程度居中。以上結(jié)果進一步驗證了TaJAZ1對ABA不敏感,是ABA信號通路的負調(diào)控因子。

WT:野生型擬南芥;jaz3:突變體擬南芥;OE:兩個TaJAZ1過表達擬南芥植株OE-1和OE-2的混合樣。WT: Wild type Arabidopsis; jaz3:Mutant Arabidopsis; OE: A mixed sample of two Arabidopsis plants OE-1 and OE-2 overexpressing TaJAZ1.圖8 qRT-PCR分析擬南芥 ABA 響應基因ABI5的表達情況Fig.8 Expression of ABA response gene ABI5 in Arabidopsis analyzed by qRT-PCR

2.6 TaJAZ1過表達水稻表型分析

2.6.1TaJAZ1過表達水稻陽性苗鑒定和表達分析

為進一步驗證TaJAZ1的功能,將小麥TaJAZ1通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法過表達于同為禾本科單子葉作物水稻中進行研究分析。用Hyg基因引物檢測TaJAZ1過表達水稻植株,共獲得10株陽性苗。隨機選取三個過表達陽性植株(OE-2、OE-5、OE-8),通過qRT-PCR分析TaJAZ1在過表達株系中的表達量變化,研究表明,TaJAZ1在過表達株系中均高表達(圖9)。

WT:受體水稻日本晴;OE-2、OE-5、OE-8分別代表隨機選取的三個TaJAZ1過表達水稻株系。WT: Nipponbare ; OE-2, OE-5, and OE-8 respectively represente three randomly selected rice lines overexpressing TaJAZ1.圖9 TaJAZ1過表達水稻qRT-PCR分析 Fig.9 qRT-PCR analysis of TaJAZ1 in the overexpression lines of rice

2.6.2TaJAZ1過表達水稻萌發(fā)表型

將日本晴、TaJAZ1過表達水稻分別放入培養(yǎng)皿中做發(fā)芽試驗,結(jié)果顯示(圖10),在萌發(fā)的前3 d 二者差異明顯。萌發(fā)第一天,日本晴種子萌發(fā)率為60%,而TaJAZ1過表達水稻種子萌發(fā)率已達到75.2%。以上結(jié)果表明,TaJAZ1在同為禾本科單子葉作物的水稻中仍具有促進種子萌發(fā)的作用。

WT:受體水稻日本晴;OE:三個TaJAZ1過表達水稻植株OE-2、OE-5和OE-8的混合種子;數(shù)據(jù)為3 次獨立生物學重復的平均值±標準差。WT: Nipponbare; OE: Mixed sample of rice plants OE-2, OE-5, and OE-8 overexpressing TaJAZ1; Data are mean±standard deviation of three biological replicates.圖10 TaJAZ1過表達水稻萌發(fā)表型Fig.10 Germination phenotype of the rice overexpressing TaJAZ1

2.6.3 qRT-PCR檢測水稻 ABA信號通路基因ABI5的表達量變化

在過表達擬南芥中TaJAZ1表現(xiàn)出對ABA敏感降低的表型,為了進一步驗證TaJAZ1在禾本科單子葉植物中是否具有相同的作用,本研究在TaJAZ1過表達水稻中同樣檢測ABA信號通路基因ABI5的表達量變化。結(jié)果表明(圖11),水稻日本晴受體轉(zhuǎn)化材料在受到ABA處理后ABI5顯著上調(diào)表達,而TaJAZ1過表達水稻中ABI5誘導程度明顯低于在受體日本晴中的誘導。研究結(jié)果進一步證明了TaJAZ1負調(diào)控ABA信號通路,在種子萌發(fā)中起促進作用。

WT:受體水稻日本晴;OE-2、OE-5、OE-8分別代表隨機選取的三個TaJAZ1過表達水稻株系。WT: Nipponbare; OE-2, OE-5, and OE-8 respectively represente three randomly selected rice lines overexpressing TaJAZ1.圖11 qRT-PCR分析水稻 ABA 響應基因 ABI5的表達情況Fig.11 Expression of ABA response gene ABI5 in rice analyzed by qRT-PCR

3 討論

休眠時間較長的作物種子可以避免穗發(fā)芽現(xiàn)象發(fā)生及其帶來的產(chǎn)量損失,但又會造成播種后發(fā)芽不均勻和出苗不整齊,延遲農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[5,14]。因此控制好種子萌發(fā)對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義,其中分析研究調(diào)節(jié)種子萌發(fā)相關基因的分子機制至關重要。Ju等[23]將TaJAZ1過表達于小麥品種KN199中,通過一系列試驗分析說明TaJAZ1是小麥穗發(fā)芽和種子萌發(fā)的正向調(diào)節(jié)因子,負調(diào)節(jié)ABA信號轉(zhuǎn)導途徑。本研究在前人研究基礎上,對TaJAZ1基因進行研究,并進一步分析了TaJAZ1在雙子葉模式植物擬南芥和單子葉禾本科模式植物水稻中促進萌發(fā)的作用。

進化樹分析結(jié)果顯示,JAZ蛋白分為兩大類,即單子葉類和雙子葉類,TaJAZ1在單子葉植物中與麥類作物聚為一支,說明其在麥類作物中高度保守。TaJAZ1啟動子區(qū)含有多種激素響應元件如MeJA響應元件、ABA響應元件等,這些元件表明TaJAZ1基因參與茉莉酸信號轉(zhuǎn)導和ABA信號轉(zhuǎn)導途徑[23]。除此之外還含有光響應、干旱誘導響應、晝夜節(jié)律調(diào)控、低溫響應等多種順式作用原件,表明TaJAZ1基因參與植物生長發(fā)育,可以響應多種逆境應答。如:TaJAZ1過表達通過促進活性氧積累提高面包小麥對白粉病的抗性[30]。OsJAZ1通過調(diào)節(jié)水稻中的JA和ABA信號傳導來減弱抗旱性[31]。TaJAZ1定位在細胞核和細胞膜中,這為與其他蛋白的互作提供了條件。研究TaJAZ1在種子發(fā)育不同時期的表達發(fā)現(xiàn),隨著種子的發(fā)育,TaJAZ1的表達呈現(xiàn)升高后下降的趨勢,在花后30 d時表達量最高,此時小麥種子可溶性蛋白質(zhì)含量、千粒重達到最大,種子形態(tài)和生理發(fā)育較完善, 種子活力最高[25],可能是穗發(fā)芽高發(fā)時期,而之后隨著種子逐漸成熟,可能由于體內(nèi)儲藏物質(zhì)積累逐漸平穩(wěn)[25],種子進入休眠狀態(tài),TaJAZ1的表達量又顯著下降。在對作物穗發(fā)芽以及種子萌發(fā)的機理研究中,發(fā)現(xiàn)ABA是影響穗發(fā)芽以及種子萌發(fā)的重要植物激素之一[26]。對完熟銘賢169種子用ABA處理后檢測TaJAZ1的表達,發(fā)現(xiàn)ABA能誘導TaJAZ1的表達。

為進一步研究TaJAZ1的功能,本研究將TaJAZ1過表達于雙子葉模式植物擬南芥中,因TaJAZ1與AtJAZ3同源性最高[23],并利用jaz3擬南芥T-DNA插入突變體來共同分析研究。無ABA時,TaJAZ1過表達株系的萌發(fā)率稍高于野生型和jaz3突變體,但差異不明顯。在ABA處理下,擬南芥各株系的萌發(fā)率都有所下降,但TaJAZ1過表達擬南芥種子萌發(fā)率遠高于野生型和jaz3突變體,而后二者差距不大,表明TaJAZ1對ABA不敏感,這與前人研究一致[23,31]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子ABI5在ABA介導的種子發(fā)芽和萌發(fā)后生長抑制中起關鍵作用,ABA能誘導ABI5的高表達和蛋白質(zhì)積累[27]。TaJAZ1能與TaABI5互作,負調(diào)節(jié)ABA信號轉(zhuǎn)導途徑[23]。本研究在此基礎上分析TaJAZ1過表達于擬南芥中是否影響AtABI5的表達,發(fā)現(xiàn)經(jīng)ABA處理后,過表達擬南芥中ABI5基因的誘導程度顯著低于野生型擬南芥和jaz3突變體,在jaz3突變體中ABI5的表達量顯著增高,進一步證明TaJAZ1對ABA不敏感,負調(diào)節(jié)ABA信號轉(zhuǎn)導途徑。

水稻是單子葉模式植物,并且與小麥同為禾本科作物,將小麥基因轉(zhuǎn)化水稻進行研究具有一定的參考價值。因此本研究將TaJAZ1過表達于水稻日本晴中,進一步分析驗證TaJAZ1在單子葉禾本科作物中是否具有相同功能。結(jié)果顯示,過表達TaJAZ1明顯增加了水稻種子萌發(fā)率,受體日本晴在ABA處理后ABI5顯著上調(diào),而在過表達株系中ABI5誘導程度明顯低于日本晴。

綜上所述,小麥TaJAZ1能促進種子萌發(fā),對ABA不敏感,并且在雙子葉和單子葉中功能保守,這為改良銘賢169等休眠性強而延遲農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的作物提供了參考。