鄭偉英 劉心雨 劉俊汝 李萌 包慧蘭 樓時(shí)先 金啟輝

糖尿病最大死因來源于高糖（HG）導(dǎo)致血管病變繼發(fā)的心腦腎等主要并發(fā)癥，多數(shù)糖尿病患者死于糖尿病血管并發(fā)癥，且隨病程延長和血糖控制的不理想，糖尿病患者重大血管病變的發(fā)生率逐年提高［1］。MicroRNA（miRNA）是一類小分子、非編碼RNA，通過誘導(dǎo)特異性RNA 表達(dá)或抑制調(diào)控細(xì)胞分化、增殖等細(xì)胞生物學(xué)變化，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展［2］。研究顯示miRNA-126 是一種血管內(nèi)皮特異性miRNA，被認(rèn)為與心血管疾病密切相關(guān)，參與調(diào)控血管病變的多種病理生理過程，是調(diào)控血管病變的重要因子，是維持血管正常結(jié)構(gòu)的重要因素［3-4］。這些研究結(jié)果提示，miRNA-126 在諸多血管病變中發(fā)揮保護(hù)作用，但其作用機(jī)制復(fù)雜，每種疾病狀態(tài)下的病理機(jī)制并不明確。本研究探討miRNA-126 的表達(dá)對(duì)HG 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究糖尿病血管病變發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和可能的治療方案。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 原代HUVECs 細(xì)胞株購自美國Clonetics 公司。胎牛血清（FBS）和低糖DMEM 培養(yǎng)基（杭州吉諾生物醫(yī)藥）；葡萄糖粉（Sigma）；Beclin 1 抗體（Abacm）；Bax、Bcl-2（CST），Cleaved-caspase 3；Western blot 相關(guān)試劑（Sigma）；ERK 通路抑制劑U-0126、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA），AKT、pAKT、ERK、pERK、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）II/I（CST）；CCK-8 試劑盒、RT-qPCR 試劑盒（碧云天）。

1.2 HUVECs 培養(yǎng)及處理 HUVECs 用含5%的胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37.0℃、飽和適度、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。以無菌PBS 洗滌細(xì)胞后，加入0.25%的胰酶（含EDTA）消化傳代，用ECM 培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，接種于培養(yǎng)板中，充分貼壁后，去血清預(yù)處理12 h 后，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組 （1）HG 模型組的建立：對(duì)數(shù)生長期的HUVECs，將終濃度為33.3 mmol/L 的葡萄糖（加入培養(yǎng)基后的濃度為33.3 mmol/L）加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。構(gòu)建miRNA-126 過表達(dá)腺病毒，然后轉(zhuǎn)染HUVECs使miRNA-126 在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步RT-qPCR證實(shí)miRNA-126腺病毒成功轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞并提高HUVECs 中miRNA-126 的水平。采用miRNA-126 inhibitor 轉(zhuǎn)染HUVECs 使內(nèi)源性miRNA-126 表達(dá)下調(diào)。（2）細(xì)胞分組：細(xì)胞分為4 組，即5.5 mmol/L 正常對(duì)照組（CR 組），33.3 mmol/L 高糖模型組（HG 組），miRNA-126-5p mimics 組（轉(zhuǎn)染miRNA-126 Mimics 組）（MM 組），miRNA-126-5p inhibitor 組（轉(zhuǎn)染miRNA-126 Inhibitor 組）（MI 組）。CR 組，培養(yǎng)24 h 后，再將濃度為5.5 mmol/L（終濃度）的葡萄糖加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；HG 組，培養(yǎng)24 h 后，再將濃度為33.3 mmol/L（終濃度）的HG 加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；MM 組是miRNA-126-5p mimics 轉(zhuǎn)染至HUVECs 細(xì)胞，成功后48 h 在培養(yǎng)基中加入33.3 mmol/L（終濃度）的葡萄糖，培養(yǎng)24 h；MI 組是miRNA-126-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染至HUVECs細(xì)胞，成功后48 h 在培養(yǎng)基中加入33.3 mmol/L（終濃度）的葡萄糖，培養(yǎng)24 h。采用miRNA-126-5p mimics組模型，分別予自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine，3-MA）5 mmol/L、ERK 通路抑制劑（U-0126）10 mmol/L 干預(yù)24 h。觀察凋亡和自噬情況。

1.4 RT-qPCR 對(duì)細(xì)胞中miRNA-126 水平的檢測(cè) 分別提取4 組細(xì)胞的總RNA，Trizol Reagent 裂解細(xì)胞后，將裂解后的細(xì)胞吸1.5 mL Ep 管中，先后加入三氯甲烷，異丙醇及75%乙醇提取RNA，棄上清液，室溫干燥5~10 min 后，采用無RNA 酶水溶解RNA；將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 反應(yīng)按照說明書采用兩步法進(jìn)行，最后對(duì)獲取的相應(yīng)數(shù)據(jù)實(shí)施定量分析。

1.5 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將HUVECs 細(xì)胞按照每孔1×104的密度接種于96 孔板，按照細(xì)胞分組進(jìn)行干預(yù)后，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長處各孔的吸光度（A）值，按公式換算為細(xì)胞相對(duì)活力。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長期的HUVECs 細(xì)胞，接種培養(yǎng)板，細(xì)胞生長至匯合度達(dá)到>95%時(shí)準(zhǔn)備劃痕。用10 μL 槍頭垂直沿著無菌直尺劃痕。按規(guī)范操作，用PBS 洗滌處理孔3 次，洗去劃下來的細(xì)胞，并拍照記錄（0 h）。各組置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后拍照。應(yīng)用ImageJ 軟件計(jì)算細(xì)胞愈合率=［1-（S24 h/S0 h）］×100%。（S 表示劃痕面積）。

1.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，分別加入120 μL 細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解10 min，收集細(xì)胞懸液于4 ℃、12,000 r/min 離心30 min，取上清液。BCA 工作法進(jìn)行蛋白定量，以40 μg 總蛋白上樣然后進(jìn)行SDS-PAGE，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST 封閉90 min。分別將各種不同抗體用I 抗稀釋液，按照說明書上的比例稀釋后與PVDF 膜置于4 ℃搖床孵育過夜，次日用TBST 洗膜3 遍后再與II抗（1 ∶4,000）室溫孵育60 min，TBST 洗膜3 遍，ECL發(fā)光成像，β-actin 作為內(nèi)參照，用Image Lab 圖像分析軟件對(duì)樣本每一個(gè)條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8 軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并行Bonferroni 事后檢驗(yàn)對(duì)檢驗(yàn)水平進(jìn)行調(diào)整，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同條件下HUVECs 表達(dá)對(duì)miRNA-126 的影響 RT-qPcR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與CR 組比較，HG 組miRNA-126 表達(dá)下降（P<0.05）；與HG 組比較，MM組miRNA-126 表達(dá)升高（P<0.01），MI 組miRNA-126表達(dá)下降（P<0.05），見圖1。

圖1 miRNA-126在不同組HUVECs表達(dá)水平

2.2 miRNA-126 促進(jìn)高糖誘導(dǎo)下HUVECs 細(xì)胞增殖作用 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，HG 組與CR 組比較，細(xì)胞存活率分別是0.51±0.07 和0.71±0.08，MM 組是0.81±0.09，MI 組是0.52±0.06，與CR 組比較，HG 組和MI 組細(xì)胞存活率明顯下降（P<0.05），與HG 組比較，MM 組細(xì)胞存活率明顯提高（P<0.01）。見圖2。

圖2 miRNA-126促進(jìn)高糖誘導(dǎo)下HUVECs細(xì)胞增殖的作用

2.3 miRNA-126 對(duì)高糖誘導(dǎo)下HUVECs 自噬、凋亡蛋白的影響 WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與CR 組比較，HG 組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1，LC3 Ⅱ/Ⅰ明顯下降（P<0.05），凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax/Bcl-2 明顯升高（P<0.05）；與HG 組比較，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3 Ⅱ/Ⅰ明顯升高（P<0.01），促凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax/Bcl-2明顯下降（P<0.01）。表明miRNA-126 有促進(jìn)自噬，抑制凋亡的作用，見圖3。在MM 組中加入自噬抑制劑3-MA（MM+3-MA 組），發(fā)現(xiàn)自噬被抑制后促凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax/Bcl-2 明顯升高（P<0.01）。見圖4。

圖3 miRNA-126對(duì)高糖誘導(dǎo)下HUVECs自噬、凋亡的影響

圖4 抑制自噬后miRNA-126對(duì)高糖誘導(dǎo)下HUVECs凋亡的影響

2.4 miRNA-126 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及VEGF、HGF 的影響 與CR 組比較，HG 組細(xì)胞愈合能力明顯下降（P<0.05），與HG 組比較，MM 組細(xì)胞愈合能力明顯提高（P<0.01）。表明miRNA-126 有促進(jìn)細(xì)胞遷移，愈合能力提高，見圖5。WB 實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞生長因子VEGF、HGF，與HG 組比較，MM 組VEGF 明顯提高（P<0.05），而HGF 無明顯改變，見圖6。

圖5 miRNA-126對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響

圖6 miRNA-126對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、HGF的影響

2.5 miRNA-126 對(duì)高糖誘導(dǎo)下HUVECs 的ERK、AKT信號(hào)通路蛋白影響 與CR 組比較，HG 組p-ERK/ERK活性明顯下降（P<0.05），而p-AKT/AKT 活性無明顯改變（P>0.05），與HG 組比較，MM 組p-ERK/ERK活性明顯提高（P<0.05），而p-AKT/AKT 無明顯改變（P>0.05）。表明miRNA-126 具有促進(jìn)ERK 磷酸化作用。見圖7。在MM 組中加入ERK 抑制劑U-0126，自噬蛋白Beclin-1、LC3 Ⅱ/Ⅰ表達(dá)明顯下降（P<0.05），見圖8。

圖7 miRNA-126對(duì)高糖誘導(dǎo)下HUVECs的ERK、AKT信號(hào)通路蛋白的影響

圖8 抑制ERK后miRNA-126對(duì)高糖誘導(dǎo)下HUVECs自噬的影響

3 討論

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［5］。多種miRNA 穩(wěn)定存在血液中，其對(duì)細(xì)胞病變和組織器官疾病的發(fā)生和發(fā)展有重要作用。血管病變最重要的病理機(jī)制是血管內(nèi)皮損傷，在糖尿病患者中，高糖、氧化應(yīng)激、高脂血癥等多種因素可直接或間接引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。miR-126 是內(nèi)皮細(xì)胞中miRNA 之一，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、黏附、管腔形成等功能方面起著至關(guān)重要的作用［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下，HUVECs 活力下降，增殖能力減弱，促凋亡蛋白Bax/Bcl-2 水平明顯升高，并最終導(dǎo)致Caspase-3 升高，表明高糖誘導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。自噬作為細(xì)胞的保護(hù)性機(jī)制，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡，在動(dòng)脈硬化病變中具有重要作用［7］。本研究發(fā)現(xiàn)HG 組血糖高，HUVECs 自噬蛋白Beclin-1 和LC3 Ⅱ/Ⅰ下降明顯，表明高糖抑制內(nèi)皮細(xì)胞自噬。與以往研究結(jié)果相似［8］。

miRNA-126 作為一種內(nèi)皮特異性miRNA，具有調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的重要作用，是維持血管穩(wěn)態(tài)的重要組成部分［9］。相關(guān)研究表明，miRNA-126 能通過調(diào)節(jié)各種血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)，保護(hù)局部微環(huán)境的穩(wěn)定，促進(jìn)血管的生成，在保持血管的完整性中發(fā)揮重要作用［10］。miRNA-126 還可通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS），和抑制D1k1 的表達(dá)，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［11-12］。表明miRNA-126在血管病變的發(fā)展進(jìn)程中起重要的調(diào)控作用。本研究顯示，MM 組與HG 組比較，有明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，可以降低Bax/Bcl-2/，抑制caspase-3 表達(dá)，減少凋亡。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA-126 具有促進(jìn)LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達(dá)的作用。予3-MA抑制劑后，miRNA-126 促進(jìn)自噬蛋白表達(dá)作用明顯被削弱，凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2/、caspase-3 表達(dá)升高，表明miRNA-126 具有促進(jìn)自噬抑制凋亡的作用機(jī)制。

AKT 和ERK 信號(hào)通路參與內(nèi)皮細(xì)胞的多種生物功能，被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞受損相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路之一［13］。本研究顯示，HG 組p-ERK/ERK 抑制明顯，而p-AKT/AKT 活性改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明高糖抑制ERK 的磷酸化，功能活性明顯下降。miRNA-126 過表達(dá)的MM 組，其p-ERK/ERK 活性與HG 組比較，升高明顯（P>0.05）。在MI 組，miRNA-126 被抑制后p-ERK/ERK 活性明顯下降，其與HG 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明高糖組miRNA-126 抑制明顯，也證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制miRNA-126 表達(dá)成功。比較AKT 的活性，發(fā)現(xiàn)其在四組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miRNA-126與AKT 的活性無關(guān)，與其具有促ERK 磷酸化的作用相關(guān)。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miRNA-126 過表達(dá)是否是通過激活ERK 通路促進(jìn)自噬，予ERK 抑制劑U-0126 后，ERK活性被抑制后自噬蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 表達(dá)明顯下降，表明miRNA-126 促進(jìn)自噬是通過激活與ERK 相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)生起作用。

綜上所述，高糖可以抑制miRNA-126 的表達(dá)。miRNA-126 可以保護(hù)高糖條件下的內(nèi)皮細(xì)胞存活，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，其機(jī)制可能與ERK 信號(hào)通路活性提高，促進(jìn)自噬的發(fā)生，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)。今后能否通過調(diào)控miRNA-126 表達(dá)，為預(yù)防糖尿病血管病變的發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。