陳金友 高越

帕金森?。≒D）是一種臨床常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，由腦部黑質(zhì)致密部紋狀體多巴胺（DA）能神經(jīng)元發(fā)生進(jìn)行性變性引起，主要的癥狀表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)步態(tài)異常等，臨床上較常用左旋多巴以外源性方式補(bǔ)充腦內(nèi)DA 以緩解癥狀［1］。目前，自噬缺陷被認(rèn)為是引起PD 中α-Synuclein 等異常蛋白質(zhì)積累，加劇神經(jīng)元損傷的重要因素［2］。熱休克蛋白A8（HSPA8）組成性表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，具有介導(dǎo)細(xì)胞自噬作用［3］。人參皂苷Rg1 是人參的活性成分，可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和腦內(nèi)蛋白質(zhì)合成，具有神經(jīng)保護(hù)作用［4］。研究證實(shí)，人參皂苷Rg1 對(duì)PD 小鼠黑質(zhì)內(nèi)聚集的α-Synuclein 具有降解作用［5］。因此，本研究通過(guò)建立PD 小鼠模型，探討人參皂苷Rg1 介導(dǎo)HSPA8 自噬途徑對(duì)DA 小鼠的神經(jīng)元保護(hù)作用，以明確人參皂苷Rg1 治療PD 的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動(dòng)物：48 只健康雄性C57BL/6J 小鼠，8~10 周齡，體質(zhì)量（25±5）g，購(gòu)于北京維通利華公司［許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006）］。正常飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)于浙江鷹旸生物科技有限公司［許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0033）］。所用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法與處理措施均由浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并執(zhí)行。（2）主要實(shí)驗(yàn)試劑：人參皂苷Rg1、VER-155008F（HSPA8 抑制劑）購(gòu)于麥克林（貨號(hào)：G909436、C872629）；1-甲基-4 苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司（貨號(hào)：S31504）；HSPA8、α-Synuclein、絡(luò)氨酸氫化酶（TH）、p62 抗體購(gòu)于美國(guó)Proteintech 公司（貨號(hào)：10654-1-AP、10842-1-AP、25859-1-AP、18420-1-AP）；α-Synuclein、HSPA8、TH、LC3-I/II、p62、B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、半胱氨酸肽酶3（Caspase 3）、Bcl-2 關(guān)聯(lián)X（Bax）蛋白抗體購(gòu)于美國(guó)Affinity 公司（貨號(hào)：AF0402、AF5187、AF6113、AF5402、AF5384、AF6139、AF6311、AF0120）；Tunel 試劑盒購(gòu)于北京索萊寶公司（貨號(hào)：G1501）；Nissl 染色試劑盒購(gòu)于武漢谷歌生物公司（貨號(hào)：G1036）。（3）主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備：小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)儀購(gòu)于SANS 公司；小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)軌跡分析儀購(gòu)于上海欣軟公司；化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)于上海勤翔公司；熒光顯微鏡購(gòu)于日本尼康公司。

1.2 方法 （1）PD 小鼠模型建立：按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法對(duì)小鼠進(jìn)行造模［6］。30 mg MPTP 溶于10 mL 0.9%氯化鈉溶液中，腹腔注射30 mg/kg MPTP 對(duì)小鼠進(jìn)行PD造模，連續(xù)注射7 d，NC 組小鼠腹腔注射10 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液代替。（2）分組及給藥：小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（NC 組）、PD 組、Rg1-1 組（1 mg/kg Rg1）、Rg1-5組（5 mg/kg Rg1）、Rg1-10 組（10 mg/kg Rg1）、Rg1-20組（20 mg/kg Rg1）、Rg1-40 組（40 mg/kg Rg1）、Rg1-40+VER-155008 組（40 mg/kg Rg1+89.9 μmol/kg VER-155008），每組各6 只。NC 和PD 組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液，各藥物組小鼠每天灌胃相應(yīng)劑量Rg1，Rg1-40+VER-155008 組另需腹腔注射VER-155008，1 次/d，連續(xù)10 d。（3）小鼠行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)儀、爬桿和實(shí)驗(yàn)箱子。測(cè)定小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間和完成爬桿的所需時(shí)間，小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)軌跡分析儀安裝于實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)記錄小鼠在箱子的行動(dòng)軌跡，記錄小鼠實(shí)驗(yàn)內(nèi)穿越中間區(qū)域次數(shù)和運(yùn)動(dòng)路程數(shù)，評(píng)價(jià)小鼠整體運(yùn)動(dòng)行為能力。實(shí)驗(yàn)前3 d 讓小鼠熟悉實(shí)驗(yàn)流程和箱子環(huán)境，不同小鼠測(cè)試前需用75%乙醇消除氣味以免造成實(shí)驗(yàn)干擾。（4）小鼠腦黑質(zhì)Nissl 染色：制備石蠟切片。常規(guī)脫蠟至水。Nissl 染色液均勻覆蓋切片，放入預(yù)熱后烤箱內(nèi)染色孵育20 min，清洗，烤箱烘干，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。（5）小鼠腦黑質(zhì)免疫組化染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，修復(fù)。封閉后加入HSPA8、α-Synuclein 抗體孵育過(guò)夜。標(biāo)記的二抗孵育50 min。清洗，顯色5 min，復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水封片，鏡檢。陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色。（6）小鼠腦黑質(zhì)免疫熒光檢測(cè)：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，修復(fù)。P62、TH、LC3 抗體孵育，封閉30 min，吸棄多余液體，加入標(biāo)記的二抗，避光孵育50 min。搖床脫色清洗3 次，DAPI染液避光染10 min，PBS 清洗3 遍。封片，熒光顯微鏡下觀察。（7）小鼠腦黑質(zhì)Tunel 染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，修復(fù)。Tunel 染液均勻覆蓋切片，37℃水浴孵育。清洗，DAPI 室溫下復(fù)染10 min，搖床清洗，封片，鏡檢拍照發(fā)熒光的Tnnel 陽(yáng)性細(xì)胞。（8）Western blot 檢測(cè)小鼠腦黑質(zhì)相應(yīng)蛋白表達(dá)：小鼠黑質(zhì)組織制備為勻漿，離心提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1.5 h，清洗，孵育α-Synuclein、HSPA8、TH、caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3-II、LC3-I、P62 稀釋的一抗抗體，4℃搖床振蕩過(guò)夜。清洗，封閉后二抗孵育。ECL 化學(xué)發(fā)光儀顯影，測(cè)定蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)。偏態(tài)分布則采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為表現(xiàn) 與NC 組比較，PD 組小鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間顯著縮短、完成爬桿所需時(shí)間顯著延長(zhǎng)、穿越箱子中間區(qū)域次數(shù)及總路程顯著減少，整體運(yùn)動(dòng)行為能力降低（P<0.01）。與PD 組比較，不同劑量Rg1 組的小鼠的整體運(yùn)動(dòng)行為能力增強(qiáng)，以Rg1-40 組小鼠的整體運(yùn)動(dòng)能力改善最為顯著（P<0.05）。而與Rg1-40 組比較，Rg1-40+VER155008 組小鼠的整體行為運(yùn)動(dòng)能力顯著下降（P<0.01）。見(jiàn)表1。

表1 小鼠行為學(xué)變化情況［（±s），n=6］

表1 小鼠行為學(xué)變化情況［（±s），n=6］

注：與NC 組比較，▲▲P<0.01；與PD 組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與Rg1-40 組比較，##P<0.01

組別 轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間（s）爬桿時(shí)間（s）中間區(qū)域穿越次數(shù)（次）總路程（mm）NC 組 293.72±29.92 4.97±0.45 29.27±2.94 27,308.05±2,636.36 PD 組 176.82±14.93▲▲11.52±1.12▲▲ 11.52±1.2▲▲ 12,774.5±1,223.08▲▲Rg1-1 組 185.53±16.71 10.65±1.18 14.55±1.53★★ 15,533.83±1,764.67★Rg1-5 組 192.65±20.09 8.52±0.86★★ 14.97±1.48★★ 16,000.35±1,516.04★★Rg1-10 組 216.07±23.04★ 8.87±0.87★★ 20.87±2.12★★ 17,704.58±1,689.53★★Rg1-20 組 252.15±25.76★★ 6.53±0.42★★ 23.57±2.01★★ 19,075.82±1,529.88★★Rg1-40 組 278.22±28.4★★ 5.38±0.47★★ 26.7±2.45★★ 21,992.85±2,316.21★★Rg1-40+VER155008 組 223.55±21.62## 7.78±0.77## 16.92±1.59## 15,905.72±1,296.41##

2.2 各組小鼠腦組織Nissl 染色結(jié)果 NC 組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核仁明顯，可見(jiàn)淡藍(lán)色的尼氏小體出現(xiàn)于胞漿。與NC 組比較，PD 組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞皺縮，尼氏小體數(shù)量減少，核仁小時(shí)。與PD 組比較，不同劑量Rg1 組的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)改善，尼氏小體數(shù)量增加；與Rg1-40 組相比，Rg1-40+VER155008 組小鼠經(jīng)元細(xì)胞胞漿加深，尼氏小體減少，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞病理改變（Nissl染色×400）

2.3 各組小鼠腦組織α-Synuclein、HSPA8 含量 與NC 組比較，PD 組小鼠腦組織中α-Synuclein 含量增加，HSPA8 含量降低（P<0.01）。與PD 組比較，Rg1-10、Rg1-20、Rg1-40 組小鼠黑質(zhì)內(nèi)α-Synuclein 含量降低，HSPA8 含量增加（P<0.01）。與Rg1-40 組相比，Rg1-40+VER155008 組小鼠黑質(zhì)組織α-Synuclein 含量增加，HSPA8 含量降低（P<0.05），見(jiàn)圖2、表2。

圖2 小鼠腦組織α-Synuclein、HSPA8表達(dá)（免疫組化×200）

表2 各組小鼠腦組織α-Synuclein、HSPA8表達(dá)比較［（±s），n=6］

表2 各組小鼠腦組織α-Synuclein、HSPA8表達(dá)比較［（±s），n=6］

注：與NC 組比較，▲▲P<0.01；與PD 組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與Rg1-40 組比較，#P<0.05，##P<0.01

指標(biāo) NC 組 PD 組 Rg1-1 組 Rg1-5 組 Rg1-10 組 Rg1-20 組 Rg1-40 組 Rg1-40+VER155008 組α-Synuclein 0.13±0.01 0.25±0.02▲▲ 0.23±0.02 0.22±0.02 0.19±0.02★★ 0.18±0.02★★ 0.16±0.02★★ 0.19±0.02#HSPA8 0.25±0.03 0.13±0.01▲▲ 0.14±0.01 0.14±0.02 0.17±0.02★★ 0.19±0.02★★ 0.21±0.03★★ 0.18±0.02#

2.4 各組小鼠腦組織p62、TH、LC3 含量 與NC 組比較，PD 組小鼠黑質(zhì)內(nèi)p62 含量增加，TH、LC3 含量降低（P<0.01）。與PD 組比較，不同劑量Rg1 組小鼠黑質(zhì)內(nèi)p62 含量降低、LC3、TH 含量增加（P<0.05）。與Rg1-40 組比較，Rg1-40+VER155008 組小鼠黑質(zhì)內(nèi)p62 含量增加，TH、LC3 含量降低（P<0.05），見(jiàn)表3、圖3。

圖3 各組小鼠腦組織p62、TH、LC3熒光表達(dá)（免疫熒光×400）

表3 各組小鼠腦組織p62、TH、LC3表達(dá)比較［（±s），n=6］

表3 各組小鼠腦組織p62、TH、LC3表達(dá)比較［（±s），n=6］

注：與NC 組比較，▲▲P<0.01；與PD 組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與Rg1-40 組比較，#P<0.05，##P<0.01

指標(biāo) NC 組 PD 組 Rg1-1 組 Rg1-5 組 Rg1-10 組 Rg1-20 組 Rg1-40 組 Rg1-40+VER155008 組p62 20.34±2.16 35.6±2.91▲▲ 32.42±3.42 29.46±1.34 5.27 37.86±3.91▲▲ 39.57±2.22 41.77±3.6★★ 25.09±1.85★★ 24.1±1.79★★ 21.75±1.83★★ 24.49±1.73#TH 56.99±1 43.92±4.29★ 48.53±5.08★★ 53.56±3.23★★ 46.93±4.26#LC3 43.61±3.25 20.91±2.32▲▲ 22.26±2.00 27.28±1.58★★ 30.54±2.39★★ 31.44±4.00★★ 32.65±2.06★★ 27.62±1.86##

2.5 各組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況 與NC組比較，PD組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡顯著增加（P<0.01）。與PD組比較，Rg1-5、Rg1-10、Rg1-20、Rg1-40 組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少（P<0.01）。與Rg1-40 組比較，Rg1-40+VER155008 組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加（P<0.01），見(jiàn)表4、圖4。

圖4 各組小鼠腦組織凋亡小體染色結(jié)果（Tunel染色×400）

表4 各組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較［（±s），n=6］

表4 各組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較［（±s），n=6］

注：與NC 組比較，▲▲P<0.01；與PD 組比較，★★P<0.01；與Rg1-40 組比較，##P<0.01

組別 Tunel 陽(yáng)性（%）NC 組 2.58±0.23 PD 組 26.83±2.40▲▲24.13±2.41 17.58±2.49★★組 15.74±1.32★★Rg1-1 組Rg1-5 組Rg1-10 Rg1-20 組 13.86±3.43★★Rg1-40 組 12.25±1.18★★Rg1-40+VER155008 組 15.83±2.01##

2.6 各組小鼠腦組織測(cè)定蛋白表達(dá)情況 與NC 組比較，PD 組小鼠黑質(zhì)內(nèi)α-Synuclein、Caspase-3、Bax、p62 蛋白表達(dá)顯著增加，HSPA8、TH、Bcl-2、LC3-II/LC3-I 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。與PD 組比較，不同劑量Rg1 組小鼠黑質(zhì)內(nèi)α-Synuclein、Bax、p62、caspase-3 蛋白表達(dá)降低，HSPA8、TH、Bcl-2、LC3-II/LC3-I 蛋白表達(dá)增加（P<0.05）。與Rg1-40 組比較，Rg1-40+VER155008 組小鼠黑質(zhì)內(nèi)α-Synuclein、Caspase-3、Bax、p62 蛋白表達(dá)顯著增加，HSPA8、TH、Bcl-2、LC3-II/LC3-I 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠黑質(zhì)組織內(nèi)檢測(cè)蛋白表達(dá)比較

3 討論

PD 的主要病理改變?yōu)棣?Synuclein 錯(cuò)誤折疊形成聚集體，并在神經(jīng)元細(xì)胞間不斷傳播加重神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致PD 的發(fā)生與進(jìn)展［7］。自噬為細(xì)胞清除過(guò)多異常蛋白以維持細(xì)胞正常功能所必需，自噬阻滯與激活能夠相應(yīng)增加和減少致病性α-Synuclein 的聚集［2］。研究表明，攜帶自噬基因變異的PD 患者的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的自噬活性降低，對(duì)α-Synuclein 蛋白的清除應(yīng)答也相應(yīng)降低［8］。LC3-I 通過(guò)脂化為L(zhǎng)C3-II 作為選擇性自噬受體為細(xì)胞啟動(dòng)自噬程序的關(guān)鍵，LC3-II/LC3-I、p62 蛋白可作為細(xì)胞自噬活性的生物標(biāo)志［8-9］。周鴻雁等［10］消除線(xiàn)粒體復(fù)合物I 抑制劑魚(yú)藤酮對(duì)線(xiàn)粒體的抑制作用后，DA 模型細(xì)胞LC3-II 表達(dá)增加、p62 表達(dá)降低，同時(shí)促凋亡Bax 蛋白表達(dá)下降、抑凋亡Bcl-2 蛋白表達(dá)增加，提示自噬活性增強(qiáng)對(duì)DA 細(xì)胞模型具有保護(hù)作用。李和梅等［11］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1 干預(yù)Aβ 損傷的神經(jīng)細(xì)胞后，細(xì)胞的LC3-II/LC3-I 蛋白表達(dá)上調(diào)，線(xiàn)粒體膜電位水平上升，細(xì)胞活力增加，提示人參皂苷Rg1 可介導(dǎo)自噬途徑減少神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷。

自噬的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，而HSPA8 是介導(dǎo)細(xì)胞線(xiàn)粒體自噬途徑的主要載體［3］。研究顯示，魚(yú)藤酮暴露可下調(diào)PD 細(xì)胞模型中HSPA8 表達(dá)，導(dǎo)致α-Synuclein 蛋白異常聚集，增加神經(jīng)元細(xì)胞毒性［12］。LH 為DA 的合成限速酶，腦組織內(nèi)其低表達(dá)與PD 發(fā)生和發(fā)展相關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示，PD 小鼠整體行為運(yùn)動(dòng)能力下降，腦組織內(nèi)HSPA8、TH 蛋白含量表達(dá)下調(diào)，自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I 蛋白表達(dá)降低、p62 蛋白表達(dá)增加，而α-Synuclein 蛋白含量表達(dá)增加，神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體數(shù)量下降、凋亡增加，相應(yīng)促凋亡Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)、抑凋亡Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，表明PD小鼠DA 神經(jīng)元自噬活性降低、神經(jīng)元細(xì)胞損傷嚴(yán)重。而不同劑量人參皂苷Rg1 單獨(dú)干預(yù)后，PD 小鼠整體行為運(yùn)動(dòng)能力明顯改善，神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量增加、凋亡減少，黑質(zhì)組織內(nèi)HSPA8、TH、Bcl-2、LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)上調(diào)，α-Synuclein、Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)下降，表明人參皂苷Rg1 對(duì)可上調(diào)PD 小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元自噬活性，具有神經(jīng)保護(hù)作用。而當(dāng)HSPA8 被抑制后，40 mg/kg 人參皂苷Rg1 對(duì)PD 小鼠的行為運(yùn)動(dòng)能力的改善作用下降，腦組織內(nèi)α-Synuclein 蛋白表達(dá)增加，神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體數(shù)量減少、凋亡增加，LC3-II/LC3-I、TH、Bcl-2 蛋白表達(dá)下降，p62、Caspase-3、和Bax 蛋白表達(dá)增加，推測(cè)人參皂苷Rg1 可能介導(dǎo)HSPA8 自噬途徑增強(qiáng)DA 神經(jīng)元細(xì)胞自噬活性，發(fā)揮對(duì)PD 小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本研究表明HSPA8 在PD 小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)與神經(jīng)損傷有關(guān)，而人參皂苷Rg1 可介導(dǎo)HSPA8 的自噬途徑減少神經(jīng)元細(xì)胞損傷，從而起到PD 小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。