陳海欣 陳平 陳婷婷

肺癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其主要病理類(lèi)型包括非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）及小細(xì)胞肺癌（SCLC），其中NSCLC 約占85%［1］。肺腺癌（LUAD）是原發(fā)性肺癌中最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型，50%的LUAD患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期并存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性肺癌5 年生存率為4%~18%［2-3］。癌胚抗原（CEA）作為惡性腫瘤診斷的重要指標(biāo)，在結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤中表達(dá)均存在增高［4］。CEA 作為一種細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)蛋白，參與細(xì)胞黏附，異常升高可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［5］。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1（CEACAM1）是CEA 家族中唯一在T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞上表達(dá)的成員，抑制免疫細(xì)胞抗腫瘤功能［6］。本研究擬通過(guò)TCGA-LUAD 和HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析CEACAM1 在LUAD 腫瘤組織中表達(dá)情況，CEACAM1 與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相關(guān)性，探索CEACAM1 與多種免疫檢查點(diǎn)共表達(dá)關(guān)系，分析CEACAM1 在LUAD 免疫細(xì)胞中調(diào)節(jié)作用以及CEACAM1 在LUAD 參與的信號(hào)通路，為CEACAM1 是否可以作為治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料收集 從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載LUAD 項(xiàng)目中HTSeq-FPKM 格式的RNAseq 數(shù)據(jù)和患者臨床資料用于CEACAM1 差異表達(dá)、免疫浸潤(rùn)、免疫檢查點(diǎn)共表達(dá)及通路富集分析。

1.2 方法 （1）差異表達(dá)分析：對(duì)TCGA-LUAD 數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤組織和癌旁組織CEACAM1 表達(dá)進(jìn)行差異分析，R 軟件包“ggplot2”用于可視化分析。通過(guò)HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.proteinatlas.org）分析LUAD 腫瘤組織中免疫組化結(jié)果，分析腫瘤組織和癌旁組織中CEACAM1 表達(dá)差異。（2）KM 生存曲線(xiàn)分析：應(yīng)用KM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//kmplot.com/analysis/）分析不同病理分期CEACAM1 高低表達(dá)組總生存率（overall survival rate，OS）差異。（3）免疫浸潤(rùn)分析：應(yīng)用R 軟件包“GSVA”進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，免疫浸潤(rùn)算法為ssGSEA。分析CEACAM1 與腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的相關(guān)性，免疫細(xì)胞選擇活化的樹(shù)突狀細(xì)胞（aDC）、B 細(xì)胞、CD8T 細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞、DC細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、幼稚的樹(shù)突狀細(xì)胞（iDC）、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，CD56+NK 細(xì)胞，CD56-NK 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDC）、T細(xì)胞、T 輔助細(xì)胞、中央記憶型T 細(xì)胞（Tcm）、效應(yīng)記憶T 細(xì)胞（Tem）、濾泡輔助性T 細(xì)胞（TFH）、γδ T細(xì)胞、Th1 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）。（4）CEACAM1 與其他免疫檢查點(diǎn)共表達(dá)情況分析：應(yīng)用R 軟件包“ggplot2”用于可視化分析，分析CEACAM1 與其余8 個(gè)免疫檢查點(diǎn)（SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3 和PDCD1LG2）共表達(dá)情況。（5）通路富集分析：根據(jù)CEACAM1 表達(dá)情況分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，分析兩組中存在表達(dá)差異顯著的基因，并通過(guò)GSEA 基因富集分析。使用P值和歸一化富集分?jǐn)?shù)（normalized enrichment fraction，NES）對(duì)每個(gè)表型中富集的途徑進(jìn)行分類(lèi)。若錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.25 且校準(zhǔn)P<0.05 表明在高表達(dá)表型中顯著富集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料以M（Q1，Q3）表示，兩組比較用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料比較 TCGA-LUAD 數(shù)據(jù)庫(kù)中，排除缺少RNAseq 數(shù)據(jù)或臨床信息的患者，相同患者保留原位癌數(shù)據(jù)，最后共篩選出535 例LUAD 患者納入本次分析，以肺腫瘤組織中CEACAM1 表達(dá)量的中位值作為界限，將患者分成高表達(dá)組（268 例）和低表達(dá)組（267例）。見(jiàn)表1。

表1 LUAD患者臨床資料

2.2 CEACAM1 在腫瘤組織和癌旁組織表達(dá)差異 通過(guò)非配對(duì)樣本檢驗(yàn)，LUAD 患者腫瘤組織中CEACAM1的含量高于癌旁組織的平均水平，兩組差值為1.502（1.38~1.625），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.151，P<0.001）；通過(guò)配對(duì)樣本檢驗(yàn)，腫瘤組織中CEACAM1 的含量也高于癌旁組織的平均水平，兩組差值為1.423（1.134~1.712），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.857，P<0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 CEACAM1在腫瘤組織和癌旁組織表達(dá)

2.3 CEACAM1 免疫組化結(jié)果分析 CEACAM1 在腫瘤組織中高表達(dá)，在正常肺組織中幾乎不表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 CEACAM1在腫瘤組織和癌旁組織免疫組化結(jié)果（HPA數(shù)據(jù)庫(kù)）

2.4 KM 生存曲線(xiàn)分析 在LUAD 中，CEACAM1 高表達(dá)患者OS 偏低（P<0.05）。由于IV 期患者數(shù)不足，因此只單獨(dú)列出I、II、III 期和總LUAD 患者KM 生存曲線(xiàn)，結(jié)果顯示I 和II 期高表達(dá)CEACAM1 的LUAD 患者OS 偏低（P<0.05）。而在III 期LUAD 患者中OS 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 LUAD中CEACAM1高低表達(dá)組KM生存曲線(xiàn)分析

2.5 免疫浸潤(rùn)相關(guān)性分析 CEACAM1 與aDC、B 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、iDC、T 細(xì)胞、TFH、Th1 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞存在正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.192、0.109、0.124、0.087、0.146、0.288、0.089 和0.156，見(jiàn)圖4。

圖4 CEACAM1與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

2.6 CEACAM1 與免疫檢查點(diǎn)共表達(dá)分析 CEACAM1與SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4和LAG3 共表達(dá)情況存在正相關(guān)（P<0.05），Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.141、0.166、0.092、0.108、0.149、0.163 和0.147，見(jiàn)圖5。

圖5 CEACAM1與免疫檢查點(diǎn)分子共表達(dá)情況

2.7 通路富集分析 通過(guò)GSEA 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)CEACAM1 與Rho GTP 酶信號(hào)傳導(dǎo)、M 期有絲分裂、NABA 分泌因子、DNA 修復(fù)以及氨基酸及其衍生物的代謝通路相關(guān)。見(jiàn)圖6。

圖6 GSEA通路富集分析

3 討論

LUAD 作為肺癌的主要病理類(lèi)型，雖然惡性程度不高，發(fā)展進(jìn)程比較緩慢，但存在微轉(zhuǎn)移灶，即使肺部病灶較小時(shí)也會(huì)發(fā)生血道轉(zhuǎn)移以及淋巴轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者被診斷時(shí)，病情已經(jīng)發(fā)展至中晚期，并且可能已經(jīng)擴(kuò)散到全身各處［7］。隨著CEACAM 家族研究的深入，CEACAM1 在各種癌癥中的研究也日益增多，比如結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、甲狀腺癌以及黑色素瘤等［8-9］。在NSCLC 中，與健康者比較，CEACAM1 基因表達(dá)上調(diào)［10］。CEACAM1 可以通過(guò)改變細(xì)胞間的黏附能力，細(xì)胞間空隙增大使得腫瘤細(xì)胞侵襲進(jìn)入組織器官，導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移；通過(guò)促進(jìn)VEGF的表達(dá)，使機(jī)體生成新生血管及淋巴管從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［11］。有研究表明，在NSCLC 患者血清中，存在CEACAM1 水平升高，且表達(dá)水平和TGF-β、VEGF-A、IL-8 密切相關(guān)，提示CEACAM1 可以預(yù)測(cè)肺癌發(fā)生、進(jìn)展以及預(yù)后，并有可能為肺癌治療提供靶點(diǎn)［12］。另外，CEACAM1 免疫抑制劑（MG1124）在NSCLC PDX人源化小鼠模型中，MG1124 作為單一療法可以抑制肺癌的生長(zhǎng)，在NSCLC huPDX 模型中顯示出與派姆單抗的協(xié)同抗癌活性。CEACAM1 作為近年新發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點(diǎn)，可以與TIM-3 相互作用抑制T 細(xì)胞抗腫瘤作用，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視［13］。

本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，LUAD 患者腫瘤組織中CEACAM1 mRNA 高表達(dá)。在一項(xiàng)CEACAM1和NSCLC 研究中，腫瘤組織中CEACAM1 高表達(dá)，表明CEACAM1 與NSCLC 存在關(guān)聯(lián)［14］。通過(guò)KM 生存曲線(xiàn)分析，發(fā)現(xiàn)CEACAM1 高表達(dá)的早期LUAD 患者中OS偏低，推測(cè)CEACAM1 有可能是早期LUAD 不良預(yù)后指標(biāo)。CEACAM1 作為免疫檢查點(diǎn)，能夠在免疫細(xì)胞上表達(dá)，從而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞激活程度，而免疫細(xì)胞的狀態(tài)和患者的預(yù)后也密切相關(guān)，分析LUAD 患者CEACAM1與腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞相關(guān)性，結(jié)果顯示CEACAM1 與多種免疫細(xì)胞呈正相關(guān)（P<0.05），其中與TFH 細(xì)胞相關(guān)性最顯著。有研究表明，NSCLC 患者TFH 細(xì)胞上不僅存在PD1 高表達(dá)，也存在TFH 功能異常，功能異?？梢赃M(jìn)一步抑制免疫功能，搶救TFH 的功能可以作為NSCLC 患者潛在的治療策略［15］。研究證實(shí)LUAD 中CEACAM1 與TFH 浸潤(rùn)呈正相關(guān)，高表達(dá)的CEACAM1也同樣會(huì)抑制TFH 細(xì)胞功能，通過(guò)靶向抑制CEACAM1也有可能幫助恢復(fù)TFH 功能，從而也能對(duì)LUAD 患者起到治療作用。CEACAM1 作為免疫檢查點(diǎn)，可以與其他免疫檢查點(diǎn)互相作用，如與TIM-3 結(jié)合對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控［15］。分析CEACAM1 與其他八種免疫檢查點(diǎn)分子共表達(dá)情況，結(jié)果顯示CEACAM1 與SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4 和LAG3 共表達(dá)情況存在正相關(guān)（P<0.05），提示可以聯(lián)合多個(gè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑作為L(zhǎng)UAD 治療的新策略。根據(jù)腫瘤組織中CEACAM1 表達(dá)水平分為高低表達(dá)組，兩組中存在顯著差異的基因，通過(guò)GSEA 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)CEACAM1 與Rho GTP 酶信號(hào)傳導(dǎo)、M 期有絲分裂、NABA 分泌因子、DNA 修復(fù)以及氨基酸及其衍生物的代謝通路相關(guān)。Rho GTP 酶屬于Ras 超家族，參與細(xì)胞遷移、吞噬、收縮和黏附，Rho/ROCK 信號(hào)通路可以誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重建、導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［16］。細(xì)胞分裂周期M 期通路，也有研究表明CDC 25C 可以預(yù)測(cè)LUAD 的不良預(yù)后，并可能在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和FAS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，其中CDC25C 參與G2/M 期轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)［17］。DNA 修復(fù)也與腫瘤密切相關(guān)，當(dāng)修復(fù)系統(tǒng)存在延長(zhǎng)，可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。尚斌通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Ku80 基因可以增加LUAD 細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、遷移以及侵襲能力，其中Ku80基因是DNA 修復(fù)基因［18］。在多種腫瘤，如乳腺癌患者血清中存在氨基酸代謝圖譜的改變［19］。根據(jù)基因富集分析，發(fā)現(xiàn)CEACAM1 參與的信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此靶向CEACAM1 有可能阻止腫瘤的發(fā)生。綜上所述，LUAD 的腫瘤組織中CEACAM1 高表達(dá)，且與腫瘤組織浸潤(rùn)的多種免疫細(xì)胞呈正相關(guān)。CEACAM1作為免疫檢查點(diǎn)，在免疫細(xì)胞上高表達(dá)，可以抑制免疫細(xì)胞抗腫瘤功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。另外，在LUAD 中，CEACAM1 可以和多種免疫檢查點(diǎn)共表達(dá)，可能對(duì)免疫抑制起到協(xié)同作用。