王志翊 周培森 李科瑩 楊靜雯 翁杰 徐慧

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的慢性間質(zhì)性肺病［1］，預(yù)后極差，生存期為3~5 年，由于發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前仍無特效治療藥物［2］。肺纖維化病理基礎(chǔ)是成纖維細(xì)胞過度增殖、肌成纖維細(xì)胞活化及細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積等［3-4］。泛素化屬于蛋白翻譯后修飾過程，具有選擇性調(diào)節(jié)蛋白降解功能，廣泛參與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，可直接或間接參與肺纖維化進(jìn)程［5-6］。盡管肺纖維化部分關(guān)鍵泛素化基因已被發(fā)現(xiàn)，但這些孤立的基因尚不能解釋肺纖維化復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制。近年來，微陣列分析作為在基因組水平上獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)的一種工具，已廣泛應(yīng)用于疾病的發(fā)生和發(fā)展研究中［7］。本研究擬通過GEO 數(shù)據(jù)微陣列分析，篩查肺纖維化相關(guān)的泛素化關(guān)鍵基因，并通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB）驗(yàn)證，從泛素化角度探索肺纖維化可能發(fā)病機(jī)制，為臨床尋找理想的生物分子診療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取基因表達(dá)綜合（geneExpression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）GSE47460 和GSE70866 兩個(gè)數(shù)據(jù)集［8-9］。GSE47460 基于GPL14550 平臺(tái)，包含91 例健康者與122 例肺纖維化患者的全肺基因表達(dá)數(shù)據(jù)。GSE70866 基于GPL14550和GPL17077 平臺(tái)，包含20 例健康者與122 例肺纖維化患者的肺泡灌洗液基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)基因（DEGs）分析 數(shù)據(jù)庫(kù)人群分為肺纖維化組與正常對(duì)照組，采用R 語言進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析，通過線性模型進(jìn)行微陣列分析（limma 包）篩選出DEGs，以|log2 fold change（FC）|>0.5，且P<0.01 為DEGs 閾值。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件［10］，構(gòu)建差異基因蛋白的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，用Cytoscape 的cytoHubba 進(jìn)行評(píng)分。

1.4 DEGs 的功能富集分析 采用R 包“clusterProfiler”對(duì)DEGs 進(jìn)行基因本體論（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，采用R 語言（enrichment plot 包和ggplot2 包）對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.5 基于關(guān)鍵（Hub）基因表達(dá)高低進(jìn)行預(yù)后特征的驗(yàn)證 通過PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選Hub基因，并按基因表達(dá)量中位數(shù)分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，采用survival 包和survminer 包進(jìn)行預(yù)后生存分析，比較高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的生存差異，采用Kaplan-Meier 分析繪制生存曲線，用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)顯著性。

1.6 肺纖維化模型構(gòu)建及泛素化Hub基因鑒定 SD 雄性大鼠18 只，體質(zhì)量150~200 g，采用數(shù)字隨機(jī)表分為正常對(duì)照組、肺纖維化組與UCHL1抑制劑組，各6 只。用烏拉坦麻醉各組大鼠，肺纖維化組按博萊霉素（BLM）5 mg/kg 氣管內(nèi)灌注，UCHL1抑制劑組采用LDN-57444（LDN）（0.25 mg/kg）腹腔注射，2 周后取各組大鼠肺組織。所有SD 大鼠購(gòu)自Vital River（中國(guó)上海）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)中心，本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.7 HE 染色和羥脯氨酸含量測(cè)定 分離大鼠肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片后進(jìn)行HE 染色。提取肺組織后，于試管中制成勻漿液，加入1 mL 水解液，充分混勻后加蓋沸水水浴20 min，調(diào)節(jié)水解液pH 值為6.5，加入適量活性炭混勻離心，取1 mL上清液作檢測(cè)，計(jì)算羥脯氨酸含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用R 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及圖像生成，計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 泛素化相關(guān)的差異表達(dá)基因的篩選 數(shù)據(jù)集GSE47460均為胸外手術(shù)患者，提取肺組織勻漿總RNA，并進(jìn)行微陣列分析，肺纖維化組與正常對(duì)照組臨床信息比較見表1。篩選泛素化相關(guān)基因約600 多個(gè)，包括泛素活化酶（E1 酶）、泛素結(jié)合酶（E2 酶）、泛素連接酶（E3 酶）、去泛素化酶（DUB）、蛋白水解酶（PRO 酶）等。通過Limma 包進(jìn)行肺纖維化組與正常對(duì)照組間泛素化相關(guān)差異表達(dá)基因分析，以|logFC|>0.5 且P<0.01的閾值共鑒定出38 個(gè)泛素化相關(guān)差異基因（17 個(gè)上調(diào)基因和21 個(gè)下調(diào)基因），泛素化相關(guān)的差異基因熱圖和火山圖，見圖1。

圖1 泛素化相關(guān)的差異基因熱圖與火山圖

表1 兩組人群臨床資料比較

2.2 泛素化相關(guān)差異基因GO 和KEGG 富集分析 上調(diào)的差異表達(dá)泛素化相關(guān)基因分析結(jié)果顯示，GO 和KEGG 的主要存在于泛素化相關(guān)通路的調(diào)控，包括泛素蛋白酶體、泛素轉(zhuǎn)移酶及泛素連接酶等，見圖2。下調(diào)的差異表達(dá)泛素化相關(guān)基因分析結(jié)果顯示，主要存在于蛋白質(zhì)分解調(diào)控、蛋白質(zhì)分解代謝調(diào)控及泛素轉(zhuǎn)移酶等，見圖3。

圖3 下調(diào)泛素化差異基因的GO和KEGG分析

2.3 蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)）與Hub基因篩選 采用Cytoscape 軟件構(gòu)建基于STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)的PPI 網(wǎng)絡(luò)。DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖4A。通過CytoHubba的11 種評(píng)分對(duì)38 個(gè)差異基因做進(jìn)一步篩選，選出9 個(gè)Hub基因，見圖4B。

圖4 蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)和CytoHubba評(píng)分

2.4 差異表達(dá)基因與肺纖維化患者生存率關(guān)系 數(shù)據(jù)集GSE70866 包含122 例預(yù)后生存信息的肺纖維化患者微陣列數(shù)據(jù)，為分析泛素化Hub基因表達(dá)水平改變對(duì)肺纖維化患者生存率影響，分別選擇5 個(gè)Hub基因UBE2C、RHOBTB2、CUL3、USP30及UCHL1。 采 用Kaplan-Meier 分析各Hub基因與患者總體生存率間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)UCHL1高表達(dá)組患者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組，其他4 個(gè)基因高和低表達(dá)組間無明顯差異，見表2、圖5。

圖5 Hub基因Kaplan-Meier曲線

表2 Hub基因Kaplan-Meier曲線高表達(dá)和低表達(dá)間的比較

2.5 肺纖維化大鼠模型鑒定與Hub泛素化相關(guān)差異基因驗(yàn)證 HE 染色結(jié)果顯示，肺纖維化組肺泡間隙較正常對(duì)照組明顯增厚。UCHL1抑制劑組與正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰。UCHL1抑制劑組大鼠肺泡壁略有增寬，較肺纖維化組肺泡壁明顯改善。肺纖維化組羥脯氨酸含量高于正常對(duì)照組，而UCHL1抑制劑組羥脯氨酸含量低于肺纖維化組，見圖6。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于正常對(duì)照組，肺纖維化組中UCHL1蛋白表達(dá)上調(diào)，見圖7。

圖6 三組HE染色和羥脯氨酸含量比較

圖7 肺纖維化大鼠肺組織UCHL1表達(dá)情況

3 討論

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析從數(shù)據(jù)集GSE47460中鑒定肺纖維化組和正常對(duì)照組差異表達(dá)基因，并進(jìn)一步分析其中的泛素化相關(guān)基因，篩選出17 個(gè)上調(diào)和21個(gè)下調(diào)的泛素化相關(guān)差異基因，為了更好理解這些差異基因的相互作用，分別進(jìn)行了GO 和KEGG 分析。研究表明，38 個(gè)泛素化相關(guān)差異基因的GO 和KEGG 分析結(jié)果主要存在于泛素化相關(guān)的信號(hào)通路，包括泛素蛋白酶體、泛素轉(zhuǎn)移酶及泛素連接酶等。通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)并應(yīng)用Cytoscape 軟件篩選出與肺纖維化發(fā)病機(jī)制及預(yù)后相關(guān)的重要Hub基因，分別分析了包括泛素結(jié)合酶E2C（UBE2C）、RHOBTB2、CUL3、USP30、UCHL1在內(nèi)的Hub基因，為肺纖維化機(jī)制研究提供了新的思路。

泛素是一種存在于所有真核生物中的小蛋白，可在翻譯后調(diào)節(jié)底物蛋白的穩(wěn)定性，從而廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。越來越多的證據(jù)表明泛素化有助于肺纖維化的病理組織重塑［11］。泛素E3 連接酶FIEL1 在肺成纖維細(xì)胞中通過Smad3/4 信號(hào)通路，表現(xiàn)出促纖維化［6］。去泛素化酶USP13 的缺失導(dǎo)致成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力［12］。泛素E3 連接酶UHRF1 通過GPX4和FSP1 介導(dǎo)肺泡上皮2 型細(xì)胞的鐵死亡，促進(jìn)肺纖維化［13］。本研究雖通過生物信息學(xué)分析，從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出UBE2C、RHOBTB2、CUL3、USP30、UCHL1等肺纖維化差異表達(dá)基因，但有關(guān)其在肺纖維化發(fā)病進(jìn)程中的作用及機(jī)制，目前尚不清楚。

UBE2C 是特異性E2 泛素耦聯(lián)酶，在較多腫瘤組織中過表達(dá)，與ECM 調(diào)控相關(guān)［14］。CUL3 是一種泛素E3 連接酶，在腫瘤中也高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［15］。也有研究表明，CUL3 表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致纖維化腎病。RHOBTB2 是一種小的Rho GTP 酶，可與泛素E3連接酶cullin-3 蛋白相互作用，可抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。去泛素化酶USP30 可抑制線粒體自噬，通過抑制USP30 可阻斷帕金森蛋白驅(qū)動(dòng)線粒體自噬從而緩解帕金森的進(jìn)展［16］。UCHL1則是一種參與調(diào)節(jié)帕金森病、心肌損傷、肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等多種疾病的去泛素酶［17］。上述泛素化相關(guān)基因在肺纖維化患者中表達(dá)升高，提示其在肺纖維化發(fā)病過程中可能具有重要作用。同時(shí)，本研究通過Kaplan-Meier 曲線分析也發(fā)現(xiàn)上述泛素化相關(guān)基因具有良好的預(yù)測(cè)肺纖維化患者生存能力，其中UCHL1預(yù)測(cè)能力最強(qiáng)。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)大鼠纖維化肺組織中UCHL1蛋白表達(dá)也明顯升高，抑制UCHL1則可明顯緩解BLM 誘導(dǎo)的肺纖維化嚴(yán)重程度。由此可見，UCHL1在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中可能扮演重要角色，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究提出幾個(gè)與肺纖維化相關(guān)的泛素化Hub基因，尤其是UCHL1與肺纖維化的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后關(guān)系密切。后續(xù)有待進(jìn)一步通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入研究，為從泛素化角度尋找新的肺纖維化臨床治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。