呂國達(dá), 康煒鵬, 魏俏紅, 高海娜, 胡 菡,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 資源昆蟲高效養(yǎng)殖與利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蜜蜂研究所,北京 100193;2.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院,北京 100048)

腎臟是維持人體正常生命活動(dòng)的重要代謝器官之一[1]。隨著年齡的增加,腎臟的結(jié)構(gòu)和功能均會(huì)發(fā)生退行性變化,如體積變小、質(zhì)量減輕、腎小球硬化、腎小管萎縮等,成為引發(fā)急慢性腎臟疾病的重要影響因素[2-3]。近年來,功能性食品和多種營養(yǎng)元素在延緩和改善衰老引起的腎臟疾病方面的作用成為研究熱點(diǎn)[4]。

蜂王漿的主要成分為60%～70%的水、12%～15%的粗蛋白、10%～16%的碳水化合物、3%～6%的脂類和一些微量元素[5-7],具有增強(qiáng)免疫力[8]、延緩衰老[9]、抗氧化[10]等多種功能。蜂王漿在輔助治療腎臟疾病的過程中,能夠通過恢復(fù)腎小球?yàn)V過膜對(duì)體內(nèi)代謝的分辨自控能力,對(duì)受損腎臟起到修復(fù)的作用,改善腎臟功能障礙[11]。對(duì)于乙二醇誘導(dǎo)的氧化腎臟損傷,蜂王漿主要通過減弱脂質(zhì)過氧化作用,提高系統(tǒng)抗氧化能力發(fā)揮保護(hù)作用[12]。盡管蜂王漿對(duì)腎臟損傷具有顯著的保護(hù)作用,但蜂王漿對(duì)衰老腎臟是否有保護(hù)作用以及其調(diào)控信號(hào)通路仍不清楚。

D-半乳糖(D-gal)致衰老模型是經(jīng)典的衰老模型之一[13]。該模型可破壞腎臟結(jié)構(gòu),引起腎小球病變,產(chǎn)生大量自由基,導(dǎo)致腎臟損害。因此,D-gal致衰老模型被廣泛應(yīng)用于腎臟衰老保護(hù)作用的研究[14-15]。六味地黃丸是我國的一種傳統(tǒng)中藥,在臨床上對(duì)多種腎臟疾病具有一定的改善作用[16-17],主要體現(xiàn)在改善腎臟功能和減輕病理損傷方面。本研究以六味地黃丸為實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照組。

基于超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(UPLC-MS)的非靶向代謝譜分析已成為一種被廣泛肯定的有效方法,可為大范圍的小分子化合物提供敏感、準(zhǔn)確和可重復(fù)性的測(cè)量[18-19]。本研究擬通過D-gal注射致使小鼠衰老,同時(shí)灌胃蜂王漿,觀察衰老小鼠的腎臟組織病理形態(tài)和腎臟功能水平,利用非靶標(biāo)血清代謝組分析衰老小鼠和蜂王漿灌胃衰老小鼠的血液差異代謝物和代謝通路,探討蜂王漿對(duì)腎臟功能的作用及其機(jī)制,以期為應(yīng)用蜂王漿進(jìn)一步開發(fā)功能性食品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈,色譜純,美國Thermo Fisher公司;D-半乳糖(純度≥99%)、乙醇(色譜純)、多聚甲醛(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%)、二甲苯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)、鼠二抗IgG,美國Sigma公司。尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)試劑盒、肌酐(creatinine,Cre)試劑盒,北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司;總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司;蘇木精-伊紅染色試劑盒,北京索萊寶科技有限公司。單克隆抗體精氨酸琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase,ASS)、精氨酸琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ASL),武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;β-actin抗體、ECL Western blotting化學(xué)發(fā)光基質(zhì),美國Thermo Fisher公司。

灌胃用六味地黃丸,北京同仁堂;維生素E(VE,100 mg),浙江制藥有限公司;新鮮蜂王漿采集自全國6個(gè)主要蜂王漿產(chǎn)地,對(duì)采集的新鮮蜂王漿按比例混合后用于灌胃。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ08-Ⅲ型非接觸超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波Scientz公司;CV200型真空離心濃縮儀,北京市吉艾姆科技有限公司;Milli-Q Q-POD?Element型超純水儀,德國Merck Millipore公司;Microfuge 22R Centrifuge型臺(tái)式低溫離心機(jī),美國BeckMAN CoulTER公司;Dionex UltiMate 3000型高效液相色譜及四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS),美國Thermo Fisher Scientific公司;KD-BM型生物組織包埋機(jī)、KD-BL型冷凍臺(tái)、KD-P型攤片機(jī),浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司;DM500型LEICA光學(xué)顯微鏡、LEICA ICC50 W型鏡頭,德國Leica公司;E-Blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),杭州柏奧古科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

SPF級(jí)昆明小鼠,雌雄各25只,體質(zhì)量26.0～30.0 g,湖南省SJA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠飼喂、注射和灌胃實(shí)驗(yàn)在該公司完成,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002,倫理編號(hào):IACUC-2020028。

所有小鼠在溫度18～21 ℃、相對(duì)濕度50%±5%環(huán)境下(光、暗12 h循環(huán))適應(yīng)性喂養(yǎng)2周,在預(yù)實(shí)驗(yàn)期間,將所有小鼠分為5組,分別為對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組(維生素E組和六味地黃丸組)、蜂王漿組,每組雌雄小鼠各5只,所有組自由飲水和進(jìn)食。除對(duì)照組小鼠頸背部皮下注射等體積生理鹽水溶液外,其他處理組小鼠頸背部皮下注射D-gal生理鹽水溶液(300 mg/kg)進(jìn)行造模。注射1 h后,對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃:維生素E組灌胃VE溶液(100 mg/kg),六味地黃丸組灌胃六味地黃丸水溶液(1.36 g/kg),蜂王漿組灌胃新鮮蜂王漿(2 g/kg),對(duì)照組和模型組等體積灌胃生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期90 d,每天更換水、飼料并記錄小鼠生活狀況,每周稱量體質(zhì)量1次。

1.3.2樣品采集與預(yù)處理

末次灌胃處理后禁食12 h,眼球取血,放入肝素管中,室溫靜置1 h,于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,吸取上層血清,分裝后,儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。取血完畢后,脫頸處死小鼠,取出雙側(cè)腎臟組織,用4 ℃生理鹽水沖洗表面殘血,濾紙吸干表面水分,稱取腎臟總質(zhì)量;稱重后左腎用組織固定液固定,用于病理組織學(xué)檢查;右腎置于凍存管中,液氮速凍后轉(zhuǎn)存-80 ℃冰箱,用于Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)含量和抗氧化能力。

1.3.3臟器指數(shù)測(cè)定

根據(jù)小鼠體質(zhì)量(g)和雙側(cè)腎臟總質(zhì)量(mg),計(jì)算腎臟指數(shù),見式(1)。

腎臟指數(shù)=m(腎臟)/m(小鼠)。

(1)

1.3.4病理組織學(xué)檢查

左側(cè)腎臟經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定24 h,流水沖洗10 h,乙醇梯度脫水處理,二甲苯對(duì)腎臟進(jìn)行透明處理;經(jīng)石蠟包埋后,切片,厚度為4 μm,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,制成中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.5血清和腎臟生化指標(biāo)測(cè)定

參考相應(yīng)的試劑盒說明書測(cè)定血清中的BUN、Cre、T-AOC、SOD和腎臟SOD含量。

1.3.6血清代謝物提取

精密移取100 μL1.3.2節(jié)血清樣品,加入400 μL體積比為1∶1的乙腈-甲醇,渦旋混勻,低溫超聲破碎30 min(5 ℃,40 kHz),-20 ℃靜置30 min沉淀蛋白質(zhì),4 ℃、12 000 r/min離心15 min,移取上清液,將下層沉淀搗碎,用體積比為1∶1的乙腈-水復(fù)提1次。將2次上清液混合,冷凍干燥,-80 ℃保存待用。分析時(shí)加入體積比為1∶1的乙腈-水復(fù)溶,低溫超聲萃取5 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,移取上清液至進(jìn)樣小瓶,每個(gè)樣品取20 μL上清液混合作為質(zhì)控樣品(quality control,QC)。

1.3.7血清代謝物測(cè)定

采用UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,使用ACQUITY BEH Amide HILIC色譜柱(150 mm× 2.1 mm,1.7 μm; 美國Waters公司)進(jìn)行分離。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)30%的乙腈水溶液(含有體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸和10 mmol/L的甲酸銨),B相為體積分?jǐn)?shù)95%的乙腈水溶液(含有體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸和10 mmol/L的甲酸銨),梯度洗脫程序?yàn)?～2.0 min,100% B; 2.0～8.0 min,0～80% A; 8.0～9.0 min,80% A; 9.0～9.5 min,80%～0 A;9.5～13.5 min,100% B。進(jìn)樣量為2 μL,流速為0.3 mL/min。每10個(gè)樣品進(jìn)1針QC樣品,用于檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

采用High Energy Spark-Induced電噴霧離子化方式,噴霧電壓大小為正極3.5 kV,負(fù)極3.0 kV。毛細(xì)管溫度為320 ℃,加熱器溫度為350 ℃,鞘內(nèi)氣體流速為40 arb,在正離子和負(fù)離子切換模式下采集數(shù)據(jù)。采集范圍m/z為70～1 000,掃描速率1 s-1。AGC target自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)為1×106;最大離子注入時(shí)間為50 ms。掃描分辨率為17 500;離子碰撞能量為10、35、60 eV。一級(jí)全掃描(full scan),用于定量分析,二級(jí)數(shù)據(jù)依賴性掃描(full MS/dd-MS2),用于化合物的定性分析。MS數(shù)據(jù)由Xcablibur軟件(Thermo Fisher Scientific)收集并保存為Raw格式文件。

1.3.8代謝組數(shù)據(jù)處理及分析

將采集所得的Raw數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Compound Discoverer 3.2軟件(Thermo Fisher Scientific),以獲取匹配和峰值數(shù)據(jù),設(shè)置參數(shù)為最大保留時(shí)間偏差0.2 min,質(zhì)量偏差5×10-6,最小峰響應(yīng)值1×105,信噪比3。將歸一化的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0(https:∥www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行分析:經(jīng)帕累托歸一化(Pareto-scaling)和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換(底數(shù)為10)后,進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA),同時(shí)對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)(permutation test)來確保模型的穩(wěn)定性和可靠性。根據(jù)OPLS-DA模型中VIP>1和單變量統(tǒng)計(jì)分析(Student’st-test,P<0.05)篩選差異代謝物,差異代謝物數(shù)據(jù)通過MetaboAnalyst 5.0 (http:∥www.metaboanalyst.ca)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析。富集的代謝通路P<0.05和路徑影響值>0.1的路徑被認(rèn)為是重要的代謝路徑。

1.3.9小鼠腎臟ASS、ASL蛋白質(zhì)表達(dá)水平測(cè)定

稱取腎臟約80 mg置于離心管中,加入裂解液300 μL,磨碎、勻漿并充分裂解后,4 ℃、13 000 r/min 離心10 min,收集上清液,測(cè)蛋白質(zhì)含量。根據(jù)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h,用含有體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫水的Tris-HCl緩沖液(TBST)洗滌3次,加入按體積比稀釋的β-actin(1∶5 000)、ASL(1∶15 000)、ASS(1∶5 000),一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次,加入按體積比稀釋的二抗孵育1 h,洗滌3次,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影后采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光成像,Image J圖像分析軟件進(jìn)行目的條帶的灰度光密度分析。每組小鼠任意選擇3只作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)生物學(xué)樣本進(jìn)行2次技術(shù)重復(fù);每個(gè)生物學(xué)樣本目的條帶灰度值采用參比蛋白β-actin條帶灰度值歸一化后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,通過單因素方差分析比較組間差異,P<0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01為有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂王漿對(duì)小鼠外觀表征和腎臟指數(shù)的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間無小鼠死亡情況,每周對(duì)小鼠的日常外觀和行為活動(dòng)進(jìn)行觀察和記錄。未觀察到拒絕進(jìn)食或嘔吐的情況。對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好,飲水正常,毛發(fā)光澤;模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的衰老癥狀,如運(yùn)動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、毛色暗淡和發(fā)黃。對(duì)照組、維生素E組、六味地黃丸組、蜂王漿組小鼠的精神和行動(dòng)狀態(tài)較好。

圖1為雌雄小鼠各組腎臟指數(shù)的變化。與對(duì)照組相比,模型組小鼠腎臟指數(shù)顯著降低(P<0.05),雄性衰老小鼠的腎臟指數(shù)極顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,雌鼠維生素E組、蜂王漿組小鼠腎臟指數(shù)顯著升高(P<0.05),六味地黃丸組對(duì)小鼠腎臟指數(shù)具有一定的改善作用,但效果不顯著;雄鼠六味地黃丸組、蜂王漿組小鼠腎臟指數(shù)顯著升高(P<0.05),維生素E組具有一定的小鼠腎臟指數(shù)改善作用,但效果不顯著,表明飼喂蜂王漿對(duì)小鼠腎臟的保護(hù)效果更好。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.2 蜂王漿對(duì)小鼠腎臟組織形態(tài)的影響

各組小鼠腎臟形態(tài)變化見圖2。對(duì)照組雌雄小鼠腎臟具有正常的組織形態(tài),腎小球密集分布,結(jié)構(gòu)完整清晰,多呈圓形或橢圓形,腎小囊囊腔和腎小管規(guī)則且無明顯擴(kuò)張。模型組組織發(fā)生明顯變化,腎小囊囊腔明顯擴(kuò)張,腎小球球體萎縮。與模型組相比,維生素E組小鼠腎臟的組織形態(tài)沒有明顯改善,腎小管管腔擴(kuò)張仍然存在;而六味地黃丸組和蜂王漿組小鼠腎臟中腎小球數(shù)量明顯增多,且腎小球未見球體萎縮,腎小管規(guī)則且無明顯擴(kuò)張。腎臟病理切片結(jié)果表明,注射D-gal會(huì)導(dǎo)致模型小鼠發(fā)生腎臟器質(zhì)性損傷,六味地黃丸和蜂王漿對(duì)D-gal導(dǎo)致的衰老小鼠腎臟損傷起到一定的保護(hù)作用。

放大倍數(shù)為400。

2.3 蜂王漿對(duì)小鼠血清BUN、Cre含量的影響

血清BUN和Cre水平是臨床上常用的評(píng)價(jià)腎功能的指標(biāo),結(jié)果見圖3。與對(duì)照組相比,模型組雌雄小鼠的血清BUN、Cre含量均顯著升高(P<0.05),說明D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠發(fā)生了腎功能異常或腎功能減退。與模型組相比,除了雌性小鼠維生素E組血清中BUN含量變化不顯著,其他各組在飼喂后,雌雄小鼠的血清BUN和Cre含量均顯著降低(P<0.05)。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.4 蜂王漿對(duì)小鼠血清及腎臟氧化應(yīng)激水平的影響

氧化應(yīng)激是衰老引發(fā)腎臟損傷的重要因素之一,而腎臟SOD水平是反映腎臟氧化應(yīng)激損傷修復(fù)能力的重要指標(biāo)。圖4、圖5分別顯示了不同處理后小鼠血清及腎臟氧化應(yīng)激水平的變化。由圖4可知,與對(duì)照組相比,模型組雌雄小鼠血清T-AOC和SOD水平顯著下降(P<0.05),D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠的抗氧化應(yīng)激能力顯著降低。與模型組相比,維生素E組T-AOC和SOD水平改善效果不顯著;六味地黃丸組和蜂王漿組顯著提高血清T-AOC和SOD的水平(P<0.05),而蜂王漿組表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化能力。由圖5可知,腎臟中SOD的變化與血清結(jié)果完全一致。與對(duì)照組相比,模型組腎臟SOD水平顯著下降(P<0.05),飼喂六味地黃丸和蜂王漿后,SOD水平顯著升高(P<0.05)。血清和腎臟結(jié)果表明,飼喂六味地黃丸和蜂王漿均能夠顯著改善D-gal引起的衰老小鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.5 蜂王漿對(duì)小鼠血清代謝物的影響

2.5.1多元統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表1 OPLS-DA模型評(píng)價(jià)參數(shù)

圖6 D-gal致衰老小鼠血清代謝的OPLS-DA得分

2.5.2差異代謝物篩選及相關(guān)代謝通路分析

根據(jù)OPLS-DA模型中VIP>1和單變量統(tǒng)計(jì)分析篩選差異代謝物。在模型組與對(duì)照組、六味地黃丸組、蜂王漿組中,雌性小鼠分別有99、155和308個(gè)顯著差異代謝物;雄性小鼠分別有182、167和343個(gè)顯著差異代謝物。將各組雌雄衰老小鼠血清中差異較顯著的代謝物分別導(dǎo)入到MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果見圖7。代謝通路影響值由拓?fù)浞治鲇?jì)算所得,代謝通路影響值和P值分別代表通路的被干擾程度和代謝通路富集分析的顯著性水平。將代謝通路影響值大于0.1且P<0.05的代謝通路作為本研究重點(diǎn)關(guān)注的代謝通路。

圖7 D-gal致衰老小鼠血清差異代謝物相關(guān)代謝通路分析

由圖7可知,在雌鼠中,與模型組相比,蜂王漿和六味地黃丸對(duì)衰老小鼠的精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,半胱氨酸和蛋氨酸代謝,丙酮酸代謝,糖異生,硫代謝和組氨酸代謝具有顯著調(diào)控作用,而蜂王漿對(duì)衰老小鼠整體的核苷酸代謝、輔助因子和維生素代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝以及氨基酸代謝都具有更加顯著的調(diào)控作用。在雄鼠中,與模型組相比,蜂王漿和六味地黃丸對(duì)衰老小鼠的精氨酸和脯氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,檸檬酸循環(huán)具有顯著調(diào)控作用,除共有的調(diào)控代謝通路以外,蜂王漿對(duì)衰老雄鼠的亞油酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝具有顯著調(diào)控作用。

2.6 蜂王漿對(duì)小鼠腎臟精氨酸合成通路的影響

精氨酸合成和代謝與腎臟的炎癥、組織修復(fù)、近曲小管功能和纖維化形成過程密切相關(guān)[20]。精氨酸合成和代謝通路在各實(shí)驗(yàn)組雌雄小鼠血清代謝中都發(fā)生了顯著變化,見圖8。其中,雌雄小鼠血清中分別有9和11種代謝物發(fā)生了顯著變化。與對(duì)照組相比,雌性衰老小鼠血清中天冬氨酸、高肌肽、琥珀酸、鳥氨酸、精氨酸、脯氨酸、精氨基琥珀酸、瓜氨酸含量顯著降低,乙酰氨基丁酸顯著升高;在雄性衰老小鼠中,這8種物質(zhì)(天冬氨酸鹽、高肌肽、琥珀酸鹽、鳥氨酸、精氨酸、脯氨酸、精氨基琥珀酸、瓜氨酸)含量的變化與雌性小鼠完全一致,且血清中谷氨酰胺、乙醛酸鹽和2-氧化戊二酸鹽的含量也顯著降低。與模型組相比,雌雄小鼠精氨酸合成和代謝通路中的代謝物在維生素E組中的含量與模型組基本一致;六味地黃丸具有一定的調(diào)控作用,且在雄鼠中作用較為明顯;而蜂王漿對(duì)雌雄小鼠血清中這些代謝物均具有顯著的回調(diào)作用。

圖8 蜂王漿對(duì)D-gal致衰老小鼠血清精氨酸合成的影響

同時(shí),實(shí)驗(yàn)對(duì)腎臟中精氨酸合成和代謝通路涉及的關(guān)鍵酶ASS和ASL的蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定,見圖9。與對(duì)照組相比,模型組ASS和ASL蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),衰老小鼠腎臟合成精氨酸水平下降;與模型組相比,蜂王漿組ASL和ASS的表達(dá)顯著提高(P<0.05),而與對(duì)照組無顯著差異,表明蜂王漿能夠顯著改善D-gal致衰老小鼠腎臟精氨酸合成能力的下降。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

腎臟是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要器官,隨著年齡的增長(zhǎng),腎臟的老化、萎縮導(dǎo)致其質(zhì)量的減少和結(jié)構(gòu)的改變,這是其功能發(fā)生變化的主要原因[21]。D-gal在體內(nèi)醛糖還原酶作用下,生成醛糖醇、H2O2以及超氧陰離子,在體內(nèi)產(chǎn)生非酶糖基化、氧化應(yīng)激自由基損傷及誘導(dǎo)醛糖還原酶活性增強(qiáng)等一系列病理和生理性的改變,對(duì)腎臟等器官產(chǎn)生損害作用,造成系統(tǒng)功能減退[13]。D-gal對(duì)腎臟的損害作用,主要表現(xiàn)為氧化應(yīng)激損傷、組織病理變化和功能減退,如腎小球體積增大,基底膜增厚,腎臟質(zhì)量減輕等[14]。研究表明,蜂王漿和六味地黃丸均對(duì)腎小管和腎小球損傷、腎功能下降和氧化應(yīng)激水平上升的相關(guān)腎臟損傷模型起到了很好的保護(hù)作用,能夠有效提高體內(nèi)抗氧化酶活力和腎臟濾過功能[22-23]。本研究中,根據(jù)腎臟指數(shù)、血清指標(biāo)、組織形態(tài)、抗氧化能力等分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)模型組衰老小鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、腎臟發(fā)生病理性變化,腎臟功能受到損害,而六味地黃丸和蜂王漿對(duì)小鼠腎臟這些方面均有不同程度的改善作用,蜂王漿對(duì)小鼠腎臟的改善效果更加顯著。

不同的組織和器官通過血液運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)和廢物,且根據(jù)生理或病理變化進(jìn)行相關(guān)調(diào)整,而這些變化可通過代謝物水平反映在血清代謝組分析結(jié)果中[24]。因此,通過血清代謝組分析,能夠建立代謝與衰老和器官病變之間的聯(lián)系。本研究中,通過血清代謝組分析能夠更加清楚蜂王漿對(duì)D-gal致衰老小鼠腎臟保護(hù)作用的途徑。六味地黃丸主要通過影響氨基酸代謝和能量代謝途徑來調(diào)整衰老引起的代謝紊亂和腎臟功能障礙[25];相較于六味地黃丸的調(diào)控途徑,飼喂蜂王漿在小鼠氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝和輔助因子和維生素代謝多個(gè)途徑上起到顯著的調(diào)控作用,特別是氨基酸代謝。

精氨酸代謝通路在保護(hù)腎臟過程中發(fā)揮重要作用。研究表明,六味地黃丸通過調(diào)控精氨酸和脯氨酸代謝,對(duì)自然衰老小鼠發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[25-26]。精氨酸能夠通過代謝生成NO,提高SOD活性進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用[27]。同時(shí),精氨酸參與尿素的形成,通過代謝生成天冬氨酸和琥珀酸等代謝產(chǎn)物參與糖異生與能量反應(yīng)[28];而精氨基琥珀酸通過ASL生成琥珀酸進(jìn)而促進(jìn)檸檬酸循環(huán)[27]。血清中氨基酸水平與腎臟功能密切相關(guān)[29],慢性腎臟疾病患者的血清中瓜氨酸、鳥氨酸和精氨酸的水平逐漸降低[30]。本研究結(jié)果顯示,模型組衰老小鼠血清中與精氨酸代謝相關(guān)的瓜氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、鳥氨酸、精氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺等的含量顯著降低。而蜂王漿中含有豐富的氨基酸[31],蜂王漿的補(bǔ)給顯著提高了小鼠血液中這些氨基酸的含量;通過血液運(yùn)輸,這些氨基酸和多肽等小分子物質(zhì)在小鼠腎臟中不斷被過濾和重吸收。因此,推測(cè)蜂王漿通過提高血液中氨基酸含量,促進(jìn)腎臟精氨酸代謝通路中關(guān)鍵酶的表達(dá),從而對(duì)小鼠腎臟起到抗氧化、促進(jìn)能量代謝等作用,有效改善了小鼠衰老伴隨的腎臟功能衰退[32]。

4 結(jié) 論

本研究通過建立D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠模型,系統(tǒng)地考察了蜂王漿對(duì)D-gal致衰老小鼠腎臟的作用。研究結(jié)果表明,補(bǔ)給蜂王漿能夠顯著抑制衰老導(dǎo)致的小鼠腎臟指數(shù)降低,下調(diào)衰老小鼠血清BUN、Cre水平,提高小鼠機(jī)體的抗氧化能力,能夠顯著改善衰老導(dǎo)致的小鼠腎臟病變。與六味地黃丸組相比,蜂王漿顯著調(diào)控衰老小鼠的精氨酸和脯氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,亞油酸代謝等代謝途徑,這些代謝途徑與提高小鼠腎臟組織抗氧化能力、能量供應(yīng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明,蜂王漿對(duì)D-gal致衰老小鼠的腎臟具有較好的保護(hù)作用,結(jié)果旨在為進(jìn)一步開發(fā)蜂王漿作為緩解衰老導(dǎo)致腎臟損害的功能性食品或輔助性藥物提供理論基礎(chǔ)。