馮晴霞, 孫艷艷, 孫晶波, 苑廣信, 安麗萍,*

(1.吉林省經濟管理干部學院 食品藥品工程學院,吉林 長春 130012;2.北華大學 藥學院,吉林 吉林 132013)

人體的衰老是指細胞及組織結構和機能上所出現(xiàn)的退行性變化,如神經系統(tǒng)逐步發(fā)生衰退進而產生行為障礙、學習記憶能力減退等[1-2]。機體氧化應激程度加劇是衰老發(fā)生的重要原因,主要取決于氧化與抗氧化體系的平衡[3-6]。因此,提高機體的抗氧化能力,可以延緩衰老進程。天然產物含有大量的抗氧化活性物質,其所具有的預防衰老及相關疾病功能已成為食品營養(yǎng)研究領域的熱點。

姬松茸(AgaricusblazeiMurill)又名小松菇、巴西蘑菇,是一種大型真菌,具有濃郁杏仁香味,屬擔子菌亞門層菌綱傘菌目蘑菇(黑傘)科蘑菇(黑傘)屬[7-8]。姬松茸子實體富含蛋白質、糖類、甾醇、黃酮等多種生物活性物質,具有廣泛的生物活性,如抗腫瘤、降血糖、抗炎、增強免疫力等[9-10]。姬松茸蛋白具有突出的抗氧化活性,能夠提高乙酰膽堿酯酶的活性。蛋白質經蛋白酶部分水解后,可獲得具有多種生物活性的多肽。與大分子蛋白相比,小分子生物多肽具有安全穩(wěn)定、易溶于水、易吸收等優(yōu)點。并且多肽抗氧化的能力與分子質量有關,分子質量越小,其抗氧化能力越好[10]。蒲超等[11]研究表明,姬松茸多糖可以抑制軟骨細胞炎癥反應和凋亡。徐天雄[12]研究發(fā)現(xiàn),姬松茸水提物具有良好的腫瘤微環(huán)境免疫調節(jié)活性,并促進CD8+T細胞的腫瘤殺傷作用。而國內目前對于姬松茸多肽的研究鮮見報道,因此,本研究選擇姬松茸子實體中提取的蛋白質經過蛋白酶水解后的活性物質,即姬松茸多肽(Agaricusblazeipolypeptide,ABp)。本團隊前期實驗也證明,ABp具有體外抗氧化作用,對羥基自由基具有較好的清除作用,但其抗衰老效果和作用機制還需要進一步研究。

本研究擬通過D-半乳糖(D-gal)注射建立小鼠衰老模型,并評價ABp的抗衰老作用,利用轉錄組學和蛋白免疫印跡分析ABp干預后衰老小鼠的基因及蛋白表達差異,探討ABp抗衰老的潛在作用機制。研究旨在為姬松茸的抗衰老功能食品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姬松茸子實體,江蘇省蘇威微生物研究有限公司,經北華大學藥學院韓東教授鑒定;D-gal,西格瑪奧(上海)貿易公司;SPF級雄性ICR小鼠,4～5周齡,體質量(20.0±2.0)g,52只,實驗動物許可證編號為SCX(吉)-2016-0003,長春億斯實驗動物技術有限責任公司;活性氧簇(ROS)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒,南京建成生物工程研究院;大鼠單克隆BrdU抗體、單克隆抗體NeuN、山羊抗大鼠IgG-Alexa Fluor 594、山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 488,abcam公司;HOECHST 33258,ABclonal公司;反轉錄試劑盒,北京艾德來生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AKTA Purifer TM10型蛋白質層析儀,美國通用電氣公司;UV-2550型紫外可見分光光度計,島津國際貿易有限公司;MT-200型Morris水迷宮分析儀,成都泰盟科技有限公司;BA-200型小鼠避暗儀,成都泰盟科技有限公司;TOWER2.2型熒光定量PCR儀,德國ANALYTIKJENA;scandrop型超微量核酸蛋白測定儀,德國耶拿分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1ABp的制備

將姬松茸的粉狀子實體(約2 500 g)在5 000 mL冰水混合物中勻漿,5 000 r/min離心3 min取上清液,隨后采用硫酸銨,在4 ℃下,將上清液中的可溶性蛋白質沉淀過夜。合并得到的沉淀,在去離子水中溶解,并使用截留分子質量30 kDa的透析膜,在4 ℃下,用去離子水透析24 h。透析后,冷凍干燥得到姬松茸蛋白粉,按料液比1∶20(g/mL)加入蒸餾水,用 0.1 mol/L 的鹽酸調pH值至2.5,按照3 000 U/mg 的加酶量加入胃蛋白酶解液,混勻后置于37 ℃恒溫水浴中酶解4 h,100 ℃條件下加熱10 min使酶失活,凍干后初步提取出姬松茸粗多肽。

利用蛋白質層析儀分離多肽。將Preswollen DEAE-32柱填料裝入5 mL柱體中。隨后用1.5 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡3個柱體積,流速為0.5 mL/min。將粗蛋白質溶于Tris-HCl緩沖液中,使用0.45 μm濾膜過濾后進行上樣,0～0.5 mol/L線性梯度NaCl溶液連續(xù)洗脫,并使用級分收集器收集220 nm吸收峰處的級分,凍干。使用同樣的方法安裝并平衡Cellulose CM-52柱,將級分進一步于CM-52柱進行分離,并用 0～0.5 mol/L的線性梯度NaCl溶液沖洗3個柱體積,流速為0.5 mL/min,收集220 nm吸收峰處的組分。將組分凍干成粉末溶于去離子水中,最終通過Hi TrapTM脫鹽柱凈化脫鹽,使用去離子水洗脫1.5個柱體積,流速為1.0 mL/min,檢測波長220 nm。

1.3.2實驗動物分組及處理

選取6周齡雄性ICR小鼠52只,適應性喂養(yǎng)7 d,隨機分為4組:空白對照(Con)組、模型(Mod)組、ABp組和吡拉西坦(Pir)組,每組13只。除Con組外,其他組小鼠按體質量每日皮下注射D-gal 300 mg/kg。Con組小鼠注射相同劑量的生理鹽水,Pir組每日按體質量灌胃800 mg/kg的吡拉西坦,ABp組每日按體質量灌胃400 mg/kg ABp。Con組、Mod組每日灌胃等量蒸餾水。

1.3.3小鼠行為學實驗

小鼠處理第42天進行行為學實驗。小鼠放入明室中使其適應環(huán)境后,給予5 min持續(xù)電流,以2 d為訓練周期,記錄5 min內的小鼠錯誤總數(shù)和小鼠第1次被電擊的錯誤潛伏期。

采用Morris水迷宮實驗,檢測小鼠的空間學習記憶能力。將各組小鼠定點放入水池,記錄每只小鼠在120 s內到達隱形平臺的潛伏期,共訓練6 d。第7天撤去平臺,以120 s內小鼠分別在中心環(huán)、中環(huán)、目標象限的游泳穿梭次數(shù)評估小鼠學習記憶的能力[12]。

1.3.4小鼠血清生化指標檢測

小鼠末次處理24 h后,眼球取血,4 ℃離心(10 000 r/min)分離血清,按照試劑盒說明書檢測血清總抗氧化能力及SOD、MDA、ROS水平。

1.3.5小鼠海馬區(qū)轉錄組學分析

選取小鼠海馬區(qū)進行差異基因篩選。利用Hisat軟件將測序數(shù)據(jù)比對參考基因組,利用比對的結果組裝轉錄本。采用edgeR進行差異表達分析,采用R語言對差異表達結果進行圖形化展示。

采用FPKM度量基因表達的豐度值以衡量基因的表達水平。同時通過t檢驗閾值以及對t檢驗P值進行FDR校正的Q閾值初步篩選出目的基因。按照同時滿足FPKM>10、Q閾值<0.05、差異倍數(shù)>1.5或差異倍數(shù)<0.6的標準篩選差異基因。

1.3.6小鼠海馬區(qū)基因的表達水平檢測

采用反轉錄試劑盒對小鼠海馬區(qū)的mRNA進行反轉錄操作,合成的cDNA在94 ℃進行預變性5 min,35個循環(huán)擴增(94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、30 s),72 ℃退火7 min,基因引物見表1。測定軟件為SDS v2.2,基于Ct方法計算靶基因表達水平。

表1 基因引物序列

1.3.7小鼠海馬區(qū)蛋白的表達水平檢測

取小鼠海馬區(qū)加入適量體積的RIPA裂解液進行裂解和蛋白抽提。利用Bradford法測定抽提液的蛋白濃度。采用聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白的分離,隨后進行轉膜處理。轉膜結束后,用質量分數(shù)為5%的脫脂奶粉封閉條帶1 h,孵育Nrf2、HO-1、Keap1、p53、Hsph1、Apoe、Trim32一抗(體積比 1∶500稀釋)過夜,于37 ℃恒溫靜置孵育二抗(體積比1∶200 0稀釋)1 h,清洗3次,顯色后用掃描儀掃描膠片。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理各組數(shù)據(jù),結果表示為平均數(shù)±標準偏差,采用t檢驗判斷結果的顯著性,P<0.05表示差異有顯著性。

2 結果與分析

2.1 ABp的制備及純化結果

姬松茸蛋白水解物經不同柱層析純化結果,見圖1。由圖1可知,DEAE-32離子交換色譜柱純化蛋白水解物得到4個主峰。將響應值最大的DE2峰組分用于CM-52離子交換色譜純化,得到2個主峰。采用脫鹽柱純化響應值最大的CM1組分得到ABp。ABp在蛋白電泳實驗結果中呈現(xiàn)單一條帶,分子質量為3.3 kDa。

圖1 ABp的純化及鑒定

2.2 ABp對D-gal誘導的衰老小鼠記憶能力的影響

小鼠避暗實驗結果見圖2。由圖2可知,與Con組比較,Mod組小鼠避暗錯誤次數(shù)增高100%(P<0.05)。與Mod組比較,ABp組錯誤次數(shù)減少37.5%(P<0.05),且潛伏期時間顯著增加。Morris水迷宮測試,見圖3。研究結果表明,與Con組比較,Mod組小鼠在第4～5 d期間到達平臺的潛伏期顯著增加(P<0.05)。與Mod組相比,ABp組小鼠的潛伏時間顯著降低,為Mod組的56.3%(P<0.05)。第7 d的空間探索實驗結果顯示,相較Con組,Mod組小鼠找到平臺所用的時間顯著增加,穿越中心環(huán)和中環(huán)的次數(shù)顯著減少(P<0.05)。而與Mod組的相比,ABp組小鼠的潛伏期更短,在中心環(huán)和中環(huán)逗留的時間及穿越次數(shù)顯著增加(P<0.05)。

與Con組比較,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。與Mod組比較,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

2.3 ABp對D-gal誘導的衰老小鼠血清氧化水平的影響

小鼠血清中MDA濃度、ROS水平、CAT活力及總抗氧化能力變化見圖4。與Con組比較,Mod組小鼠血清中MDA濃度及ROS含量顯著升高,而血清抗氧化能力及CAT活性明顯降低(P<0.05)。而與Con組比較,ABp組小鼠血清中MDA濃度降低65.0%(P<0.05),CAT活性升高98.6%,總抗氧化能力升高30.2%(P<0.05)。

與Con組比較,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。與Mod組比較,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

2.4 ABp對D-gal誘導的衰老小鼠海馬區(qū)基因表達的影響

Mod組和ABp組小鼠海馬區(qū)基因表達差異見圖5。由圖5可知,ABp組與Mod組相比存在大量具有顯著性差異的基因。

基因聚類分析結果表明,Mod組和ABp組小鼠中共存在295個差異基因。與Mod組比較,ABp上調小鼠海馬區(qū)基因79個,下調基因216個。

GO和 KEGG富集性分析結果顯示,Mod組與ABp組小鼠的差異基因主要涉及細胞膜組成、蛋白質結合,如神經活性配體-受體相互作用,突觸功能等。表達差異顯著的基因分別是Apoe、Hsph1、Trim32、Atp1a3、Stxbp1、Mapk8ip1、Hnrnpa1、Hk1、Grik5。小鼠海馬區(qū)腦組織mRNA的驗證結果見圖6。與Mod組相比,ABp組小鼠海馬區(qū)的Hsph1、Trim32、HK1、Hnrnpa1、Grik5 mRNA表達水平增加(P<0.05),Atp1a3、Stxbp1、Apoe、Mapk8ip1 mRNA表達水平降低(P<0.05)。

*表示同一基因組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.5 ABp對D-gal誘導的衰老小鼠海馬區(qū)蛋白表達影響

小鼠海馬區(qū)蛋白表達水平差異見圖7。與Con組比較,Mod組小鼠海馬區(qū)中Keap1、P53、Apoe蛋白水平顯著升高(P<0.05),Nrf2、HO-1、Hsph1、Trim32蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與Mod組相比,ABp組小鼠海馬區(qū)中Keap1、P53、Apoe蛋白水平分別降低32.6%、71.4%、25.7%(P<0.05),Nrf2、HO-1、Hsph1、Trim32蛋白水平分別顯著上升20.5%、52.8%、125.4%、52.4%(P<0.05)。

與Con組比較,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。與Mod組比較,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

衰老是機體各組織、器官功能隨年齡增長而發(fā)生退行性變化的過程。衰老可降低機體面對環(huán)境脅迫維持動態(tài)平衡的能力,從而增加機體患病和死亡的可能性,其發(fā)生與氧化應激的積累密切相關[10-14]。D-gal誘導的衰老模型能夠阻斷大腦皮層、隔區(qū)、海馬中受體的結合位點,并引發(fā)腦內氧化應激狀態(tài)改變[15-16]。D-gal致衰老的機制在于可使生物體中產生大量的ROS,導致細胞線粒體系統(tǒng)損傷,產生大量過氧化脂質,同時過氧化產物使MDA水平升高,CAT等抗氧化酶活力下降,最終導致抗氧化水平降低及機體損傷;同時,海馬區(qū)神經元細胞出現(xiàn)彌散、細胞核變小、排列松散等現(xiàn)象[17-18]。研究結果顯示,Mod組小鼠出現(xiàn)學習記憶力衰退、行為學能力降低、反應遲緩,具有明顯的衰老癥狀。而ABp干預后,小鼠運動和記憶力能力有所提高。小鼠避暗實驗結果表明,ABp組與Mod組比較,錯誤次數(shù)減少37.5%。水迷宮實驗中,相比Mod組,ABp組小鼠的潛伏期更短,在中心環(huán)和中環(huán)逗留的時間增加,穿越次數(shù)增加。與Mod組比較,ABp組小鼠血清MDA濃度降低65.0%、CAT活性升高98.6%、總抗氧化能力升高30.2%。研究結果表明,ABp能夠顯著增強抗氧化酶的活力,清除過剩的ROS,降低脂質過氧化物的產生。

轉錄組測序結果表明,ABp在參與轉錄調節(jié)、細胞膜的組成、蛋白質結合的過程中影響基因分布最廣,包括神經活性配體-受體相互作用、GABA突觸功能等。在中樞神經系統(tǒng)中,Apoe可以調控多種氧化損傷相關基因,包括Atp1a3、Mapk8ip1、Hnrnpa1等,在神經元的發(fā)育、修復和重塑中發(fā)揮重要作用。Stxbp1復合物調節(jié)發(fā)育中的神經元突觸前囊泡融合,參與腦部發(fā)育與神經傳遞[19]。HK1為線粒體外膜蛋白(己糖激酶),是糖酵解過程中的第一個限速酶,參與細胞的糖脂代謝。Grik5為谷氨酸受體離子型,在中樞神經系統(tǒng)的許多突觸中充當興奮性神經遞質[20]。經ABp干預的衰老小鼠海馬區(qū)中Hsph1、Trime32、HK1 mRNA表達量顯著增高,Atp1a3、Stxbp1 mRNA表達量顯著降低。ABp的抗衰老作用可能通過調節(jié)脂蛋白代謝功能、神經傳遞障礙、氧化損傷、新神經元生長發(fā)育,并對Apoe、Hsph1、Trim32、Atp1a3、Stxbp1、Mapk8ip1、Hnrnpa1、Hk1、Grik5基因表達進行調控,從而發(fā)揮抗衰老作用。

Nrf2是細胞氧化應激的關鍵調節(jié)因子,對腦組織中氧化應激敏感;通過增強體內Nrf2的活性,可以有效地對抗氧化應激損傷,進而減輕衰老癥狀[21]。Apoe和Keap1是Nrf2負調控因子,其自身的泛素化、磷酸化以及核穿梭水平影響Nrf2的活力,在神經元的發(fā)育、修復和重塑中發(fā)揮重要作用。P53作為一種控制多種分子信號通路的關鍵性蛋白,參與細胞周期調節(jié)并受Nrf2調控,能夠誘導細胞因氧化損傷而出現(xiàn)的生長停滯或凋亡[21-22]。研究結果顯示,與Mod組相比,ABp組小鼠腦組織中Keap1蛋白水平降低32.6%、P53蛋白水平降低71.4%、Nrf2顯著上升20.5%。因此,ABp可能通過調節(jié)Keap1/Nrf2/P53信號通路減輕氧化應激,發(fā)揮抗衰老作用。

4 結 論

通過胃蛋白酶水解姬松茸子實體蛋白,獲得分子質量為3.3 kDa的ABp。研究結果表明,ABp可顯著改善由D-gal引起的小鼠記憶功能紊亂。相比Mod組小鼠,ABp顯著降低了衰老模型小鼠血清中ROS含量和MDA濃度,顯著提升總抗氧化能力及CAT酶活力。轉錄組學分析結果表明:ABp組與Mod組小鼠基因表達水平對比,出現(xiàn)295個差異基因;與Mod組小鼠海馬區(qū)腦組織基因表達水平相比,ABp顯著上調了79個基因表達水平,顯著下調216個基因表達水平。蛋白印跡結果表明,ABp抗衰老活性的潛在作用機制可能與Keap1/Nrf2/P53信號通路有關。