楊立斌,楊 旭,謝林澤,王霽陽,周曉娟,楊 鵬

(云南大學(xué)附屬醫(yī)院心血管外科,云南 昆明 650021)

急性Stanford A型主動脈夾層(Type A aortic dissections,TAAD)發(fā)病急、病死率高。未經(jīng)手術(shù),發(fā)病24小時內(nèi)病死率每小時增加1%～2%[1,2]。有發(fā)病率上升及年輕化趨勢[3],探索其發(fā)生及病理改變機制,具有重要意義。

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)功能失調(diào)為TAAD可能發(fā)病機制之一[4]。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳修飾影響下,VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?獲得再增殖能力,合成與分泌大量細胞因子[5,6],促進膠原蛋白沉積和彈性蛋白降解,導(dǎo)致主動脈壁細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)變性,降低血管壁強度及彈性,促進主動脈夾層(aortic dissections,AD)發(fā)展[5]。

研究表明環(huán)狀RNA(circRNA)/微小RNA-548f-5p(microRNA-548f-5p,miR-548f-5p)/α-平滑肌肌動蛋白(smooth muscle α-actin,α-SMA)軸調(diào)節(jié)參與VSMCs表型轉(zhuǎn)化[7],本研究探索miR548f-5p在TAAD患者中的表達及臨床意義?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月-2020年12月云南大學(xué)附屬醫(yī)院TAAD患者10例為觀察組,男8例,女2例;年齡41～62(54.6±6.0)歲。冠心病行冠狀動脈旁路移植術(shù)患者10例為對照組,男7例,女3例;年齡44～62(52.9±5.2)歲。

TAAD組納入標(biāo)準(zhǔn):主動脈全程CT血管成像(computer tomography angiography,CTA)、血管造影、核磁血管成像(Magnetic Resonance Angiography,MRA)或心臟彩超確診為A型主動脈夾層的術(shù)前患者,患者和/或家屬自愿參與本研究;排除標(biāo)準(zhǔn):臨床資料不完整、標(biāo)本采集不達標(biāo),認知功能障礙。對照組納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心病,行冠狀動脈旁路移植術(shù)治療的患者,患者自愿參與本研究;排除標(biāo)準(zhǔn):合并主動脈夾層,合并馬方綜合征(Marfan’s syndrome,MS)、埃勒斯-當(dāng)洛綜合征(Ehlers-Danlos syndrome,EDS)、特納綜合癥(Tuner syndrome,TS)、主動脈二葉瓣畸形、家族性主動脈瘤等基因遺傳性疾病,合并大動脈炎。本研究經(jīng)云南大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),嚴格按實驗方案進行,并獲得所有受試者簽署的知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑:TRIZOL試劑;RNA酶抑制劑;SuperScriptTM III Reverse Transcriptase、2.5 mM dNTP混合液;2X PCR master mix;α-SMA抗體;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG;蘇木精、山羊血清等。

主要設(shè)備:潔凈工作臺、電熱恒溫水槽、Gene Amp PCR System 9700、Primer 5.0、QuantStudio5 Real-time PCR System、石蠟切片機、顯微鏡拍照系統(tǒng)等。

1.3 方法

1.3.1 主動脈壁組織的采集及處理

術(shù)中取2組患者主動脈組織,進行RNA提取液浸泡及10%福爾馬林固定制備蠟塊。

1.3.2 circRNA與miRNA實時定量PCR

取組織標(biāo)本,Trizol RNA抽提及質(zhì)檢,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)條件:95℃,10min;40個PCR循環(huán)[95℃,10秒;60℃,60秒(收集熒光)],行2%瓊脂糖凝膠電泳,mi-RNA選用 U6為內(nèi)參照,circRNA選用β-actin為內(nèi)參,相對表達水平用2-△△CT表示,見表1。

表1 基因名、引物序列、退火溫度、產(chǎn)物長度

1.3.3 免疫組化檢測主動脈壁組織樣本中α-SMA表達,見表1。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料,見表2。

表2 研究對象一般臨床資料

2.2 納入樣本情況

circRNA與miRNA實時定量PCR每組10個樣本,TAAD組1樣本因RNA質(zhì)量檢測未通過,未納入研究;血清中α-SMA表達測定隨機選擇TAAD組5個樣本,對照組5個樣本;血管壁組織α-SMA表達測定隨機選擇TAAD組2個樣本,對照組2個樣本。

2.3 生物信息預(yù)測miR-548f-5p可能結(jié)合的circRNA

使用Arraystar Human CircRNA 芯片數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-548f-5p可能結(jié)合的circRNA,見表3。

表3 miR-548f-5p可能結(jié)合的circRNA

在miR-548f-5p上游預(yù)測circRNA中,隨機選擇了hsa_circRNA_042488進行驗證。

2.3 引物特異性的驗證及miR-548f-5p、hsa_circRNA_042488表達水平的比較

圖1、圖2熔融曲線圖均為單峰,表明引物靶特異性。主動脈壁組織 miR-548f-5p對照組相對表達量為0.7750±0.23492-△△CT,TAAD組相對表達量為0.4056±0.1791-△△CT,TAAD組miR-548f-5p表達水平較對照組顯著下調(diào)(P<0.01,見圖3)。主動脈壁組織hsa_circRNA_042488對照組相對表達量為1.335±0.7533-△△CT,TAAD組相對表達量為1.242±1.348-△△CT,TAAD組hsa_circRNA_042488表達水平較對照組無顯著差異(P=0.85457,見圖4)。

圖2 hsa_circRNA_042488及β-actin的熔解曲線及擴增曲線圖

圖3 對照組與TAAD組主動脈壁組織miR-548f-5p表達水平比較

圖4 TAAD組與對照組主動脈壁組織hsa_circRNA_042488表達水平比較

2.4 主動脈壁組織樣本中α-SMA的表達

免疫組化提示,TAAD的α-SMA在主動脈壁組織中表達水平降低,見圖5。

圖5 免疫組化法檢測α-SMA在主動脈壁組織中的表達

3 討論

急性主動脈夾層已能快速診斷,但發(fā)生機制、生物分子模型、早期診斷標(biāo)記物尚不明確[1]。circRNA→miRNA→mRNA調(diào)節(jié)疾病模式構(gòu)建,可以分析疾病調(diào)節(jié)的RNA和目標(biāo)基因,確定診斷和治療疾病的關(guān)鍵遺傳生物標(biāo)志物,促進疾病的研究進展[8]。

miRNA通過靶向mRNA 的3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)降低 mRNA 的穩(wěn)定性或者抑制 mRNA 的翻譯,進而負調(diào)控靶基因的表達[9]。而circRNA 包含大量 miRNA的結(jié)合位點,可作為競爭性內(nèi)源性RNA,通過堿基互補海綿吸附miRNA,調(diào)控其靶基因。circRNA呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),不具有 5′末端帽子和3′末端多聚 A 尾結(jié),核酸外切酶不易將其降解[5],更能穩(wěn)定存在于細胞內(nèi)及細胞外液中[10,11],并表現(xiàn)出空間特異性和時間特異性[11];且多數(shù)屬于內(nèi)源性非編碼 RNA[13,14],其中一些通過 miRNA 反應(yīng)元件與 miRNA 相互作用,調(diào)節(jié)靶基因表達。多項研究表明miRNA調(diào)節(jié)VSMCs表型轉(zhuǎn)化,并因此導(dǎo)致AD的發(fā)展。如Yang K等[15]人研究表明,miR-31-5p 顯著抑制心肌素(VSMCs 收縮表型的決定因素)水平并加重病理性 VSMCs 表型轉(zhuǎn)換和主動脈瘤/夾層形成,這種作用因醛脫氫酶 2(ALDH2)抑制,ALDH2缺乏與患者和小鼠的主動脈夾層風(fēng)險較低有關(guān),支持 ALDH2和miR-31-5p 作為 AAD 治療的新靶點。Huang等[16]人證實AD患者miR-145表達下調(diào),其通過靶向SMAD3(miR-145的靶基因,參與TGF-β通路),誘導(dǎo)VSMC的增殖,遷移和凋亡。Yu Y等[17]發(fā)現(xiàn)miR-30a的過度表達可能通過靶向下調(diào)賴氨酰氧化酶、彈性蛋白促進了主動脈夾層的發(fā)展。Meisheng Zou等[18]人的研究揭示了人類主動脈夾層中數(shù)百種不同表達的circRNA,結(jié)果表明hsa_circRNA_101238可能抑制TAD中hsa-miR-320a的表達和增加MMP9的表達。

Sun等[7]人的研究表明,circACTA2海綿吸附miR-548f-5p,減輕其對α-SMA表達的抑制,從而上調(diào)α-SMA表達,促進人主動脈平滑肌細胞中的應(yīng)力纖維形成和細胞收縮,但在夾層中尚未報道。本研究應(yīng)用qRT-PCR檢測TAAD患者與對照組動脈壁組織中miR-548f-5p表達水平,發(fā)現(xiàn)miR-548f-5p表達在主動脈夾層中顯著下調(diào),與主動脈夾層的病變密切相關(guān),miR-548f-5p有可能成為新的TAAD診斷分子標(biāo)志物。對通過生信分析miR-548f-5p可能結(jié)合的hsa_circRNA_042488進行TAAD 組與對照組表達水平比較,發(fā)現(xiàn)無顯著差異,需增加樣本量排除偏倚。后續(xù),可擴大樣本對可能成環(huán)的其他circRNA進行分別驗證。

綜上所述,TAAD是一種與多種因素有關(guān)的疾病,miR-548f-5p表達在主動脈夾層中顯著下調(diào),與主動脈夾層的病變密切相關(guān),有可能成為新的TAAD診斷分子標(biāo)志物,可能參與主動脈夾層VSMCs表型轉(zhuǎn)化?？尚猩镄畔W(xué)分析進一步預(yù)測下游的靶基因,亦可對上游可能成環(huán)的其他circRNA進一步驗證,建立 circRNA/microRNA/mRNA 相互關(guān)系圖,于動物模型或人類AD 組織中鑒定和驗證。