章佩，羅忠，鄧馮沂，胡建新，沈成英

1.江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院），江西 南昌 330006；2.南昌大學，江西 南昌 330006

皮膚癬菌病是由皮膚癬菌引起的皮膚、毛發(fā)、甲板等的淺表真菌感染，其流行地域廣，復(fù)發(fā)率較高，已經(jīng)成為一個重要的健康問題。據(jù)報道［1-2］，全球約有20%～25%的人患此病，皮膚癬菌病雖然不危及患者的生命，但是較難治愈而且容易復(fù)發(fā)和再感染，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。

中藥多成分、多靶點、毒副作用小的優(yōu)點使其在臨床抗真菌治療中具有獨特優(yōu)勢［3-5］。課題組前期觀察了黃芩湯對60 余種臨床常見真菌的抑制作用，結(jié)果顯示黃芩湯對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等常見臨床皮膚癬菌有良好的抑菌活性［6］。黃芩湯始載于漢代張仲景《傷寒論》，由君藥黃芩、臣藥芍藥、佐藥炙甘草和使藥大棗組成。課題組同時進行了單味藥和去該味藥的陰性對照抗皮膚癬菌作用研究，結(jié)果顯示在黃芩湯中，黃芩的抗菌作用最強，缺黃芩的陰性對照湯液抗菌作用很弱。通過研究黃芩湯中不同藥物與黃芩配伍對君藥黃芩有效成分溶出和抗皮膚癬菌活性的影響，以期為闡明黃芩湯配伍抗皮膚癬菌作用的科學內(nèi)涵奠定基礎(chǔ)。

本研究采用L8（27）正交設(shè)計法組方，以高效液相色譜法（HPLC）測定各配伍樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A 苷6 種黃芩有效成分的含量；以臨床常見皮膚癬菌——須癬毛癬菌為例，采用微量稀釋法測定黃芩不同配伍組的最小抑菌濃度（MIC 值），比較配伍前后的抗真菌作用，并同時探討抑菌強度與成分的相關(guān)性。

1 材料與儀器

1.1 主要儀器

LC-2010A 高效液相色譜儀（日本島津公司），XS105DU 梅特勒天平（瑞士Mettler 公司），Multiskan FC 酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司），LMQ.C 立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司），SPX-25085H-Ⅱ生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），96 孔板（美國康寧公司），移液槍（德國eppendorf 公司），SCIENTZ-10N 冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司），KQ2200 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與耗材

黃芩飲片（批號：21111105，產(chǎn)地：山西）；白芍飲片（批號：21082604，產(chǎn)地：安徽）；炙甘草飲片（批號：21090302，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）；大棗飲片（批號：21082405，產(chǎn)地：山東）；以上飲片均購自江西彭氏國藥堂飲片有限公司并經(jīng)江西省人民醫(yī)院藥學部主任藥師鑒定，分別為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi.的干燥根，毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖和鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實。黃芩苷對照品（批號HS81115B2，純度≥98%），黃芩素對照品（批號HR5717S1，純度≥98%），漢黃芩苷對照品（批號HR5125S1，純度≥98%），漢黃芩素對照品（批號HR20925W3，純度≥98%），千層紙素A（批號HS17116S1，純度≥98%），千層紙素A 苷（批號HS14413B1，純度≥98%）均購自寶雞辰光生物科技有限公司。磷酸（批號20210701，分析純）購自西隴科學股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩主要成分HPLC 含量測定的方法學研究

2.1.1 色譜條件 以InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（見表1），檢測波長為276 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

表1 流動相梯度條件

2.1.2 供試品溶液的配制 按照文獻方法制備黃芩湯［7］，取黃芩、白芍、炙甘草和大棗（去核）按照3∶2∶2∶2 的比例稱取適量，加飲片總重量10 倍量水，煎煮1 h，趁熱過濾；藥渣加8 倍量水煎煮1 h，趁熱過濾，合并兩次藥液，濃縮成每1 mL 含1 g 生藥的藥液，冷凍干燥后保存。稱取黃芩湯凍干粉約10 mg 置10 mL 容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解后，定容，過0.45 μm 的濾膜，取續(xù)濾液，即得黃芩湯供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的配制 取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A 苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成上述各成分質(zhì)量濃度分別為226.2 μg/mL、15.0 μg/mL、34.6 μg/mL、3.4 μg/mL、6.9 μg/mL、42.8 μg/mL 的混合對照品母液。將混合對照品母液稀釋一倍，作為對照品混合溶液。從混合對照品母液中精密吸取對照品溶液適量，配制一系列濃度梯度的線性關(guān)系考察用混合對照品溶液。

2.1.4 缺黃芩陰性樣品溶液的配制 取缺黃芩的其余三味藥材，按“2.1.2”項下方法制備缺黃芩陰性樣品溶液。

2.1.5 專屬性試驗 精密吸取供試品溶液、對照品混合溶液、缺黃芩的陰性樣品溶液各10 μL 進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明樣品中各成分的分離度均較好，對測定成分無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 專屬性HPLC圖：A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性溶液

2.1.6 檢測限與定量限 取各成分的對照品溶液，依次稀釋進樣，記錄信噪比，結(jié)果見表2。

表2 各成分的檢測限與定量限 μg/mL

2.1.7 線性關(guān)系考察 精密吸取一系列濃度梯度的混合對照品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、相應(yīng)色譜峰面積為縱坐標（y）進行回歸分析，結(jié)果見表3，結(jié)果表明各成分在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 黃芩6種成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.1.8 精密度試驗 精密吸取含黃芩苷113.1 μg/mL、千層紙素A 苷21.4 μg/mL、漢黃芩苷17.3 μg/mL、黃芩素7.5 μg/mL、漢黃芩素 1.7 μg/mL、千層紙素A 3.45 μg/mL 的混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄各色譜峰峰面積，計算RSD 值。結(jié)果顯示各成分的RSD 分別為1.25%、1.07%、1.29%、1.16%、1.23%、1.33%，表明儀器精密度良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取同一批黃芩湯按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、24、48 h 精密吸取10 μL 進樣測定，記錄色譜峰峰面積，結(jié)果各成分峰面積RSD 分別為1.77%、1.48%、1.45%、1.30%、1.48%、1.17%，表明樣品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 重復(fù)性試驗 取同一批黃芩湯，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6 份，按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，以黃芩生藥量計，測得黃芩苷、千層紙素A 苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 的平均含量為97.40 mg/g、8.30 mg/g、21.25 mg/g、2.72 mg/g、0.55 mg/g、0.36 mg/g；質(zhì)量濃度的RSD 值分別為1.31%、1.60%、1.93%、1.70%、2.30%、2.99%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.11 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的黃芩湯6 份，分別加入適量的對照品，按照“2.1.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按照“2.1.1”項下方法進樣測定，計算6 個成分的平均加樣回收率。結(jié)果顯示黃芩苷、千層紙素A 苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 的平均加樣回收率分別為100.02%、100.71%、100.66%、99.88%、99.03%、99.53%，RSD 值分別為0.96%、1.91%、2.38%、3.52%、3.54%、3.62%，表明該方法的準確度良好。

2.2 黃芩湯配伍前后提取物的制備

以白芍（A）、甘草（B）和大棗（C）為考察因素，以用藥（1）和不用藥（2）為考察水平，并考慮兩兩交互作用，以L8（27）正交設(shè)計組方，因素水平見表4，正交設(shè)計見表5。提取方法參照“2.1.2”項下黃芩湯的提取過程，各組樣品均濃縮成每1 mL含1 g 生藥的藥液，冷凍干燥后保存。

表4 因素水平設(shè)計

表5 L8（27）正交設(shè)計表

2.3 黃芩湯配伍前后黃芩有效成分的含量比較

精密稱取“2.2”項下樣品各10 mg，置10 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解后，定容，過0.45 μm 的濾膜，取續(xù)濾液，按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積，計算黃芩苷、千層紙素A 苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 的含量。結(jié)果見表6。

表6 正交設(shè)計結(jié)果（）

表6 正交設(shè)計結(jié)果（）

注：MIC為最小抑菌濃度以生藥量計，以生藥量計。

以表6 測定結(jié)果進行直觀分析，以空白列作為誤差項進行方差分析，結(jié)果各因素的影響差異無統(tǒng)計學意義。對黃芩苷含量影響中，由于C 和A×C的偏差平方和較小，將這兩列和空白列合并為一項做誤差的估計值，再經(jīng)方差分析，見表7。結(jié)果顯示各組樣品中以四味藥合煎時黃芩苷含量最高，白芍、甘草和大棗在用藥水平時，黃芩苷的含量均大于不用藥水平，其對黃芩苷含量的影響程度為：白芍＞甘草＞大棗，但是只有白芍的作用對黃芩苷含量的影響差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余藥材及相互作用對黃芩苷的影響均差異無統(tǒng)計學意義。

表7 黃芩苷的方差分析表

對其他成分含量的影響分析中，都將較小偏差平方和的兩項因素和空白列合并為一項做誤差的估計值，再經(jīng)方差分析，結(jié)果分別見表8～12。結(jié)果均顯示四味藥合煎時各成分含量最高，各藥味的影響程度為：白芍＞甘草＞大棗，對于千層紙素A苷、黃芩素而言，只有白芍的影響差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余藥材及相互作用的影響均差異無統(tǒng)計學意義；對于漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A 而言，白芍和甘草的影響差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余藥材及相互作用的影響均差異無統(tǒng)計學意義。

表8 千層紙素A苷的方差分析表

表9 漢黃芩苷的方差分析表

表10 黃芩素的方差分析表

表11 漢黃芩素的方差分析表

表12 千層紙素A的方差分析表

2.4 黃芩湯配伍前后抗皮膚癬菌作用研究

2.4.1 供試藥液的配制 取“2.2”項下8 種凍干樣品，以黃芩生藥量計，用RPMI 1640 配制成200 mg/mL，儲存在-20 ℃以備用。

2.4.2 菌種的活化及接種菌懸液的制備 毛癬菌培養(yǎng)基1 號：取葡萄糖40 g/L，酪蛋白水解物2.5 g/L，磷酸二氫鉀1.8 g/L，無水硫酸鎂0.1 g/L，瓊脂粉18 g/L，用1M 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 5.8，于121℃蒸汽高壓滅菌15 min。須癬毛癬菌在Tr1 培養(yǎng)基上培養(yǎng)傳代接種兩次，以純化菌落并增強活力，然后將須癬毛癬菌接種在Tr1 培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)7～10 d。參照CLSI的《絲狀真菌肉湯稀釋抗真菌藥敏試驗的參考方法》（M61）［8］并適當修改配制須癬毛癬菌菌懸液，采用含1%吐溫20 的無菌0.85%生理鹽水處理以制成終濃度為（1～5）×104CFU/mL 的菌懸液，備用。

2.4.3 MIC 值的測定 取96 孔板，每個孔中都加入100 μL RPMI 1640 培養(yǎng)基，然后第一孔中加入100 μL 濃度為 200 mg/mL 各樣品，用移液槍混勻后吸取100 μL 至第2 孔，依次進行2 倍稀釋至第10 孔，以黃芩生藥量計，配制的供試藥液的終濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.196 mg/mL。1～10 孔和12 孔中加入配制好的菌懸液100 μL，第11 孔作為陰性對照，第12 孔作為陽性對照。將配制好的藥敏平板置于生化培養(yǎng)箱，于28 ℃培養(yǎng)3～5 d，肉眼觀察各試驗孔真菌的生長情況，以無真菌生長的最低藥物質(zhì)量濃度即為MIC 終點，每株菌種同時做3 排，結(jié)果以幾何平均數(shù)表示，見表6。

以C、A×C 和空白列合并作為誤差項進行方差分析，結(jié)果見表13，顯示各組樣品中以四味藥合煎時MIC 值最?。话咨?、甘草在用藥水平時，MIC 值小于不用藥水平；大棗在用藥水平時，其MIC 值大于不用藥水平。其對MIC 值的影響程度為：白芍＞甘草＞大棗，白芍的配伍作用對MIC 值的影響差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余藥材及相互作用對MIC 值的影響均差異無統(tǒng)計學意義。

表13 MIC值的方差分析表

2.5 相關(guān)性分析

采用SPSS 21.0 軟件將各組的抑菌作用與黃芩有效成分含量進行雙變量相關(guān)分析，結(jié)果見表14，顯示6 個成分與MIC 值均呈顯著負相關(guān)（r＜-0.7 且P＜0.05），說明黃芩湯的抗皮膚癬菌作用強度與君藥黃芩的主要成分含量具有顯著相關(guān)，成分含量越高，抗真菌活性越強。

表14 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

中藥復(fù)方配伍是中醫(yī)用藥的特色與優(yōu)勢所在，課題組從經(jīng)典名方中篩選抗真菌藥物時發(fā)現(xiàn)黃芩湯具有較好的抗皮膚癬菌活性，為研發(fā)抗皮膚癬菌病中藥新藥奠定了基礎(chǔ)。同時，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，作為黃芩湯的君藥，黃芩及其有效成分黃芩苷、黃芩素等均具有良好的抗真菌活性［9-11］。黃芩湯配伍使用是否擁有比單味藥黃芩更強的抗菌活性，其潛在機制值得進一步地研究。

中藥發(fā)揮功效的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥化學成分，因此，本研究以黃芩有效成分黃芩苷、千層紙素A 苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 為考察指標之一，同時結(jié)合抗真菌活性MIC 值為指標，以用不用藥物配伍為考察因素和水平，采用正交設(shè)計法組方。結(jié)果顯示黃芩與白芍、甘草和大棗配伍時，黃芩主要成分煎出量有所增加，MIC 值降低；當四味藥合煎時，成分的煎出量和MIC 都達到最優(yōu)值；這說明了黃芩湯配伍能夠促進君藥黃芩活性成分在合煎液中的溶出，并且發(fā)揮了協(xié)同增效的作用，一定程度上說明了組方的科學性。

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示黃芩湯的抗皮膚癬菌活性與君藥黃芩的主要成分含量顯著相關(guān)，成分含量越高，抗真菌活性越強。黃芩苷、黃芩素等化學成分可能是黃芩湯配伍協(xié)同增效的物質(zhì)基礎(chǔ)。由于黃芩苷、千層紙素A 苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 這些黃酮類成分都是水難溶性成分，配伍后水煎液中成分含量均有所增加，可能是白芍、甘草、大棗中含有的兩親性成分對其產(chǎn)生了“增溶、助溶、潛溶”作用以及形成超分子體有關(guān)［12-16］。