彭玲娜，孫輝，丁野，李文莉，趙桂鈴

湖南省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，湖南省藥品質(zhì)量評價(jià)工程技術(shù)中心，湖南 長沙 410001

黃連上清片是由大黃、黃芩、黃柏、梔子等17味中藥組成的復(fù)方制劑［1］。方中黃連、黃芩、黃柏、石膏清熱瀉火，燥濕解毒，梔子、大黃清熱涼血解毒，引熱毒從二便出，共為君藥。防風(fēng)、連翹、荊芥穗、菊花、白芷、川芎、蔓荊子、薄荷疏散風(fēng)熱，共為臣藥。佐以旋覆花下氣行水，桔梗清熱、利咽、排膿，載藥上行。甘草調(diào)和諸藥，為佐使藥。諸藥合用，瀉火止痛，散風(fēng)清熱。臨床用于因風(fēng)熱上攻、肺胃熱盛、引動肝火上蒸頭目所致眼內(nèi)刺癢交作、見光流淚、白睛紅赤、舌苔黃，還適用于急性結(jié)膜炎、急性化膿性中耳炎、口熱、口臭、口瘡、急性牙周炎、冠周炎、急性咽炎等。

該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020 年版一部，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)目僅設(shè)置了鹽酸小檗堿的含量測定，未對處方中的君藥梔子和黃芩的含量進(jìn)行控制，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不能完全反映出投料藥材的質(zhì)量［2］，不利于產(chǎn)品的質(zhì)量把控和批間差異性的評價(jià)，可能導(dǎo)致藥品的療效存在差異。因此本研究選擇梔子和黃芩中的指標(biāo)活性成分梔子苷、黃芩苷為研究對象，建立了同時(shí)測定兩者含量的HPLC 方法，為提高黃連上清片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2698 高效液相色譜儀系統(tǒng)（DAD 檢測器、四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱），分析天平（梅特勒 XS205），超聲波清洗機(jī)（昆山KQ-300 型）

1.2 試藥

梔子苷對照品（批號：110749-201919，純度：97.1%）；黃芩苷對照品（批號：110715-2017，純度：93.5%）；以上對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。黃連上清片，A 廠家，批號：210311、210305、210310；B廠家，批號：ZEA2107、ZEA2106、ZEA2105；C 廠家，批號：20210301、20210302、20200504、20200906。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilient zorbax-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以0.2%磷酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，按表1 進(jìn)行梯度洗脫；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；DAD 檢測器；采集波長為250 nm［3-4］。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取梔子苷對照品10.15 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得梔子苷對照品溶液①（0.985 6 mg/mL）；精密稱取梔子苷對照品3.84 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液②（0.372 9 mg/mL）。精密量取梔子苷對照品溶液①適量，用甲醇稀釋成梔子苷對照品溶液③～⑤（濃度分別為0.098 56、0.019 71、0.001 971 mg/mL）。

精密稱取黃芩苷對照品18.18 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得黃芩苷對照品溶液①（0.340 0mg/mL）。精密量取黃芩苷對照品溶液①適量，用甲醇稀釋成黃芩苷對照品溶液②～⑤（濃度分別為0.170 0、0.085 0、0.034 0、0.008 5 mg/mL）。

2.3 供試品溶液的制備

取供試品研細(xì)，取粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方稱取除黃芩、梔子外的其他藥材，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的制備工藝制成缺黃芩、梔子的陰性樣品，同“2.3”項(xiàng)下的方法制備缺黃芩、梔子的陰性對照溶液。

2.5 測定法

精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

3 結(jié)果

3.1 專屬性檢測結(jié)果

分別精密吸取梔子苷對照品溶液③、黃芩苷對照品溶液③、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對照溶液色譜圖中，在梔子苷和黃芩苷色譜峰相同的保留時(shí)間處未出現(xiàn)相同的色譜峰，表明處方中其他藥味不會干擾兩者的測定。結(jié)果見圖1～4。

圖1 梔子苷對照品色譜圖

圖2 黃芩苷對照品色譜圖

圖3 陰性對照溶液色譜圖

圖4 供試品溶液色譜圖

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取梔子苷、黃芩苷對照品溶液①～⑤各10 μL，注入高效液相色譜儀，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行分析，結(jié)果見表2，表明梔子苷、黃芩苷在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 梔子苷和黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份樣品溶液，分別于配制后的0、6、12、18、24 h，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果梔子苷和黃芩苷的峰面積RSD 分別為0.24%、0.71%。表明供試品溶液在配制后24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號：20200504）6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定并計(jì)算含量，結(jié)果梔子苷和黃芩苷的含量分別為1.80 mg/g，4.60 mg/g，RSD 分別為0.88%、0.70%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.2.4 回收率試驗(yàn) 精密稱取6 份已知含量的樣品（批號：20200504）各0.25 g，精密加入相應(yīng)濃度黃芩苷和梔子苷對照品溶液，同“2.3”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表3，4。梔子苷和黃芩苷的平均回收率分別為96.67%、100.30%，RSD 分別為0.89%、0.97%，該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 梔子苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.2.5 檢測限與定量限 將梔子苷和黃芩苷對照品溶液進(jìn)行稀釋，按上述色譜條件，進(jìn)行測定。結(jié)果當(dāng)S/N=3 時(shí)，梔子苷和黃芩苷的檢測限分別為1.02 ng和4.14 ng；當(dāng)S/N=10 時(shí)，梔子苷和黃芩苷的定量限分別為3.06 ng 和12.42 ng。

3.3 供試品含量測定

為考察市面上不同生產(chǎn)企業(yè)的黃連上清片的質(zhì)量差異，按照上述的方法測定10 批次樣品中黃芩苷和梔子苷的含量。結(jié)果表明，本研究所建立的含量測定方法可用于不同生產(chǎn)廠家產(chǎn)品中梔子苷和黃芩苷的含量測定；不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量差異較大，在10 批樣品中，梔子苷的含量范圍為0.45～1.08 mg/片，黃芩苷的含量范圍為0.26～1.62 mg/片，見表5。該結(jié)果表明，不同生產(chǎn)廠家的制劑工藝、質(zhì)控水平參差不齊，可能導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的差異。因此，完善黃連上清片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)極為必要。

表5 樣品含量測定結(jié)果 mg/片

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

本研究采用DAD 檢測器，在200～400 nm 范圍內(nèi)對梔子苷和黃芩苷兩種成分進(jìn)行掃描，結(jié)果在250 nm 處均有較強(qiáng)的紫外吸收，因此選用250 nm為檢測波長。

4.2 流動相的選擇

分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液等四種洗脫系統(tǒng)，結(jié)果乙腈的洗脫能力優(yōu)于甲醇，水溶液中加入適量的磷酸后可改善峰形和分離度、減少拖尾現(xiàn)象。故最終選擇流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液［5］。

4.3 提取溶劑和提取方式的選擇

采用甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇四種不同的溶劑對供試品進(jìn)行超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶劑為70%甲醇時(shí)，提取效率優(yōu)于其他溶劑，故最終選擇70%甲醇作為提取溶劑。比較超聲和回流兩種提取方式，結(jié)果兩種方式的含量測定結(jié)果相似，考慮到檢驗(yàn)經(jīng)濟(jì)學(xué)和檢測效率，最終選擇超聲作為提取方式。又分別考察了超聲處理時(shí)間10 min、30 min、60 min 對含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果超聲處理30 min 和60 min 含量結(jié)果無明顯差別，且均比超聲處理10 min 時(shí)含量高。故最終選擇超聲處理時(shí)間為30 min［6］。

5 結(jié)論

本研究建立了黃連上清片中同時(shí)測定梔子苷和黃芩苷的HPLC 含量測定方法，供試品前處理簡單，合理；方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，為該藥品的質(zhì)量控制提供了研究依據(jù)，對評價(jià)黃連上清片的質(zhì)量穩(wěn)定性以及有效性均具有十分重要的意義。