邱曉雨，金浩鑫，吳東，黃文平，曾文輝，龔建平,

1.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006；3.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029

頸肩痛是指頸、肩、肩胛等處的疼痛，伴有一側(cè)或兩側(cè)上肢痛、頸脊髓損害癥狀等，主要源于頸椎病、肩周炎等疾?。?］。頸肩痛的治療方式包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療［2］。大多數(shù)患者選擇非手術(shù)治療，主要分為藥物治療、推拿手法治療、針灸治療、牽引治療等［3-6］。目前暫無針對頸肩痛的特效藥，臨床上主要應(yīng)用消炎鎮(zhèn)痛藥物如阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸等，此類藥物可有效鎮(zhèn)痛，但長期服用對胃腸道、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟等有不良反應(yīng)［7］，且隨著疼痛加重服藥劑量也隨之增加。

芳香療法是一種替代療法，主要使用精油通過推拿按摩的方式進行治療，可緩解疲勞、疼痛等癥狀［8］。中藥精油的止痛作用近年來頗受關(guān)注，并展現(xiàn)出多種治療疼痛效果，如痛經(jīng)、偏頭痛、頸椎痛等［9］，而精油多來源于具有活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效的中藥。精油治療頸肩痛多選用經(jīng)皮給藥的給藥方式［10］。研究發(fā)現(xiàn)兩種或者多種不同中藥精油組合得到的復合中藥精油遞釋系統(tǒng)相較于單一中藥精油的生物活性可顯著增強［11］。

本實驗研究選取包括艾葉、沒藥、乳香、肉桂、干姜及冬青六種精油組成復方精油，文獻［12-14］報道上述六種精油主要含有成分為1,8-桉葉素（桉油精）、α-姜黃烯、蒎烯、D-莰烯、芳樟醇、肉桂醛等。而研究［15］表明頸肩痛的發(fā)病機制與外周敏化和中樞敏化有關(guān)，鉀離子、鈉離子、5-羥色胺、ATP 等炎性介質(zhì)激活花生四烯酸通路引發(fā)痛敏反應(yīng)，此外頸肩痛和神經(jīng)源性炎癥也有關(guān)系［16］?！熬W(wǎng)絡(luò)藥理學”是一門運用網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系的藥理分析手段［17］。因此，本研究將以網(wǎng)絡(luò)藥理學探究對頸肩痛的作用成分及靶點，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)鑒定復方精油的化學成分，最后選取指標成分以Franz 擴散池法考察透皮吸收性能。以期探究復方精油治療頸肩痛的主要靶點和通路，為深入研究精油經(jīng)皮給藥提供參考。

1 材料

1.1 動物

KM 小鼠，18～22 g，雌雄各半，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2022-0004。

1.2 藥材與試劑

艾葉（批號20211106）、乳香（批號20210405）、沒藥（批號20210504）、肉桂（批號20211009）、干姜（批號20211211）、冬青（批號20210608）藥材均購于江西一方藥業(yè)有限公司。乙酸乙酯（中國醫(yī)藥集團有限公司）；無水硫酸鈉（上海羅恩試劑有限公司）；甲醇（中國醫(yī)藥集團有限公司）。

對照品：桉油精對照品（批號110788-201506,含量98.4%），樟腦對照品（批號110747-201409,含量98.7%）購買于中國食品藥品研究院。龍腦對照品（批號DST210312-194,含量98.0%）購買于成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 儀器

Agilent 7890B-7000D 三重四級桿氣相質(zhì)譜儀，KDM 型控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器），Agilent 6890N 氣相色譜儀，TG328A 十萬分之一天平（北京賽多利斯儀器），TP-6 型智能透皮擴散儀及垂直式 Franz 型擴散池（天津精拓儀器科技），HC-3016R 高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器）。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取

參照2020 年版《中國藥典》通則2204 揮發(fā)油測定法提取，以得油量為指標單因素考察料液比、浸泡時間、蒸餾時間對提取量的影響，得到最佳提取工藝參數(shù)，見表1。

表1 藥材最佳提取工藝參數(shù)

2.2 復方精油的GC-MS 分析

2.2.1 色譜條件 氣相條件：分流模式，分流比為2∶1；載氣流速，1.0 mL/min；色譜柱，Agilent VF-WAXms 30 m×250 μL×0.5 μm；程序升溫，初始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至180 ℃，再以5 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min；傳輸線溫度為260 ℃；進樣量為1 μL；載氣為氦氣。

質(zhì)譜條件：Scan 全掃描模式；溶劑延遲：3.5 min；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；掃描范圍：15～650 m/z。

2.2.2 GC-MS 分析 GC-MS 測定復方精油中的化學成分，總離子流見圖1。結(jié)合文獻資料解析，鑒定出化學成分75 個，占比最高的是桉油精、反式肉桂醛、丁香酚、芳樟醇、α-姜黃烯、莪術(shù)烯、樟腦、蒈烯、莰烯等。

圖1 復方精油的GC-MS總離子流圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學探討

2.3.1 精油成分及頸肩痛靶點篩選 基于GC-MS定性成分和已發(fā)表的文獻報道，并通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫、HERB 數(shù)據(jù)庫補充收集復方精油成分。基于精油的經(jīng)皮給藥特點和里賓斯基五規(guī)則，ALogP是反映生物膜之間通透性的主要物理化學參數(shù)之一［18］，以1＜ALog P＜5 為指標，篩選精油的目標活性靶點。

以“Cervical Syndrome 頸椎綜合征”“Myalgia 肌痛”“Neck Pain 頸部疼痛”“Pain Syndrome Myofascial疼痛綜合征肌筋”“Shoulder Pain 肩部疼痛”為頸肩痛相關(guān)的疾病關(guān)鍵詞，通過挖掘GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、Drugbank 數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫獲取頸肩痛的疾病靶點。

結(jié)果顯示篩選后活性成分共77 種，導入Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫合并刪除重復值后共183 個化合物靶點和1 126 個疾病靶點。

2.3.2 中藥精油-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物疾病交集靶點及成分輸入Cytoscape3.9.1 軟件得到網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3.3 中藥精油成分-頸肩痛疾病靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將成分靶點與疾病靶點做Veen 圖匯集得到共同靶點46 個，見圖3。導入STRING 數(shù)據(jù)庫，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，得到核心靶點，見圖4。

圖3 活性成分和疾病靶點的Venn圖

圖4 核心靶點

2.3.4 中藥精油-頸肩痛疾病靶點功能與通路的富集分析 在Metascape 的基因面板中導入關(guān)鍵靶點，物種限定設(shè)置為“Homo sapiens”，進行GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析。分析時設(shè)置P＜0.01，重疊值（Overlap）≥3，富集值（Enrichment）≥1.5。

分析獲得974 個GO 功能條目，選取排名前10的條目繪制GO 功能分析圖，見圖5。在生物過程（biological process，BP）中，涉及對異種刺激的反應(yīng)，循環(huán)系統(tǒng)過程、血液循環(huán)、細胞對氮化合物的反應(yīng)，對細胞外刺激的反應(yīng)等；在細胞組分（cellular component，CC）中，涉及膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜筏、小窩突觸膜等；在分子功能（molecular function，MF）中，涉及G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素受體活性、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、α1-腎上腺素能受體活性等。KEGG 通路富集分析得到化學致癌-受體激活、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、5-羥色胺能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cGMPPKG 信號通路、IL-17 信號通路、TRP 通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、膽堿能突觸、花生四烯酸代謝、細胞色素P450 對異生素的代謝、cAMP 信號通路類風濕關(guān)節(jié)炎等相關(guān)信號通路，見圖6。

圖5 潛在靶點的GO富集分析

圖6 潛在靶點的KEGG通路富集分析

2.4 復方精油GC 含量測定

2.4.1 氣相色譜條件 采用HP-5（0.32 mm×30 m×0.25 μm）毛細管色譜柱，以氮氣為載氣，程序升溫，初始溫度為90 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 上升到110 ℃；再以10 ℃/min 上升到150 ℃，保持10 min。檢測器溫度為250 ℃，進樣口溫度200 ℃，進樣量1 μL，分流比為5∶1。

2.4.2 方法學考察 專屬性考察：取空白溶劑、供試品透皮接收液和含桉油精157.792 μg/mL、樟腦479.68 μg/mL、龍腦468.48 μg/mL 的混合對照品溶液，按“2.4.1”色譜條件進樣檢測。結(jié)果如圖7 所示，空白溶劑沒有干擾測定。

圖7 色譜圖：A.空白溶劑，B.混合對照品溶液，C.供試品透皮接收液

線性考察：精密量取混合對照品溶液，加乙酸乙酯稀釋為系列質(zhì)量濃度的溶液，分別按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析。以質(zhì)量濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸。結(jié)果表明，桉油精、樟腦、龍腦在表2 所示的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度考察：取含樟腦479.68 μg/mL、龍腦468.48 μg/mL、桉油精157.792 μg/mL 的混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件，平行進樣6 次，結(jié)果表明，桉油精、樟腦、龍腦峰面積的RSD 分別為1.20%、0.53%和0.87%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性考察：取同一接收液樣品，按“2.4.1”色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24 h 時進樣分析，結(jié)果顯示，桉油精、樟腦、龍腦的峰面積RSD分別為3.84%、1.78%、3.47%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 體外透皮吸收考察

2.5.1 小鼠離體皮膚的制備 用脫毛膏除掉小鼠腹部體毛，小鼠處死后立即剪下腹部皮膚，將皮膚附帶的脂肪和皮下組織清理干凈，用生理鹽水小心清洗并擦干多余水分，再用錫箔紙包裹后放置-20 ℃冷凍保存，備用。

2.5.2 Franz 擴散池試驗 將轉(zhuǎn)子置于接收池中，量取15 mL 空白接收液（無水乙醇和生理鹽水以3∶7的比例混合，超聲10 min 即得）加入。將冷凍保存的小鼠離體皮膚放入生理鹽水中浸泡30 min，取出后用濾紙吸干水分，剪成適當大小，真皮層朝向接受池平鋪，夾緊固定且排盡氣泡。精密吸取1 mL復方精油樣品，置于鼠皮上并用封口膜將釋放池封閉，平行六組。

智能透皮試驗儀循環(huán)水浴溫度37.5 ℃，攪拌速度為300 r/min，預平衡30 min。在計時開始后的第1、2、4、6、8、10、12、24 h 精密吸取接收液1 mL，并補充1 mL 空白接收液。將所取的接收液4 ℃低溫離心20 min 后加入1 mL 乙酸乙酯萃取，靜置取上清液用0.22 μm 有機濾膜濾過，置于進樣小瓶中，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，并計算指標成分桉油精、樟腦和龍腦的累積透過量Qn（μg/cm2）。計算公式為：

其中：Qn 為第n 個時間點單位面積的累積透過量（μg/cm2），Cn、Ci 分別為第n、i 個時間點測得的藥物質(zhì)量濃度（μg/mL），V 為接收液加入體積（15 mL），Vi 為每次取樣體積（1 mL），A 為有效透皮面積（1.13 cm2）。

以累積透過量Qn為縱坐標，時間t為橫坐標作圖，結(jié)果見圖8。將數(shù)據(jù)分別用零級方程、一級方程、Higuchi 方程擬合［19］。結(jié)果顯示三種指標成分均符合零級方程和Higuchi 方程，表明復方精油具有緩控釋效果。

圖8 桉油精、樟腦、龍腦的累積透過量

對三種指標成分的Qn-t 曲線中的直線部分進行線性回歸，求出的直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率（Js）［20］。由表3 結(jié)果可知，桉油精、樟腦、龍腦在復方精油中的透皮速率分別為34.442、88.515、35.213 μg·cm-2·h-1。

表3 指標成分的滲透動力學參數(shù)

3 討論

精油具有高滲透性、代謝快、不滯留，毒性小，又易于透過血腦屏障的優(yōu)點［21］，可廣泛適用于頸肩痛患者。中藥精油的止痛作用機制是通過多種途徑實現(xiàn)的，有研究表明芳樟醇可促進神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑的增加起到調(diào)節(jié)中樞來達到緩解慢性疼痛的作用［22］，α-蒎烯能阻止NF-κB 炎癥通路的傳導和白細胞介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-α（TNF-α），一氧化氮NO 的釋放達到抗炎鎮(zhèn)痛的作用［23］；桉油精通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）生成，從而減輕疼痛［24］；樟腦的鎮(zhèn)痛作用則其可能與作用于TRPV1 通道有關(guān)［25］。

通過GC-MS 分析與網(wǎng)絡(luò)藥理學預測結(jié)果所得的治療頸肩痛的關(guān)鍵活性成分基本重合?；钚猿煞滞ㄟ^抑制5-羥色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）的釋放調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)以此鎮(zhèn)痛；抑制炎癥因子NO、IL-6、TNF-α 的合成釋放從而抗炎鎮(zhèn)痛；抑制環(huán)氧合酶-2（COX-2）的表達緩解疼痛。選取桉油精、樟腦和龍腦作為指標性成分，透皮試驗結(jié)果顯示釋放數(shù)據(jù)均符合零級動力學方程和Higuchi 方程，表明復方精油的體外透皮行為均具有緩釋作用。

綜上所述，復方精油通過多種成分和靶點相互調(diào)節(jié)治療頸肩痛的發(fā)作機制，且透皮吸收具有控緩釋效果。為進一步研究精油的止痛作用和劑型研究提供參考。