侯 睿，向麗萍，張冰雪，任 偉，張 琴，駱書娜

（遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州遵義 563099）

醬香型白酒酒糟中的風(fēng)味物質(zhì)含量很高，尤其有機(jī)酸類，總酸含量可達(dá)4 %左右，而且其酸的組成豐富，口感協(xié)調(diào)，主要以乳酸為主[1-2]。醬香型白酒有機(jī)酸大部分是在釀酒發(fā)酵中產(chǎn)生的，調(diào)節(jié)白酒的香氣結(jié)構(gòu)，使得白酒具有酒體豐滿度和酸爽感。所以，醬香型白酒的釀造過程也是一個(gè)對(duì)有機(jī)酸的利用和控制過程，對(duì)酒糟中有機(jī)酸的檢測(cè)必不可少[3-4]。乳酸是白酒中重要的呈香呈味物質(zhì)，也是最重要的非揮發(fā)性有機(jī)酸之一，在醬香型白酒釀造過程中，大量生酸微生物代謝產(chǎn)生的酸參與調(diào)控微生物的分布趨勢(shì)，導(dǎo)致醬香型白酒中的酸含量比較高，最常見的有乳酸、丁酸等[5]。

目前，白酒酒糟有機(jī)酸的檢測(cè)方法通常有氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[6]、氣相色譜法(GC)[7]、離子色譜法(ICP-MS)[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9]、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[10]等。氣相色譜法適用于揮發(fā)性高的脂肪酸檢測(cè)，不適合熱不穩(wěn)定酸(如乳酸)的檢測(cè)；液相(質(zhì))衍生技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)乳酸等熱不穩(wěn)定酸的檢測(cè)，但操作繁瑣[11-13]；陰離子交換色譜法可實(shí)現(xiàn)白酒短、中鏈揮發(fā)酸和包括乳酸在內(nèi)的難揮發(fā)酸的同時(shí)檢測(cè)，但儀器專用、購置成本高[14-15]；高分辨液相質(zhì)譜可實(shí)現(xiàn)酒中多種微量有機(jī)酸的檢測(cè)，但儀器和檢測(cè)成本昂貴[16]。液相色譜法成本相對(duì)較低，流動(dòng)相常見易得，在白酒有機(jī)酸的檢測(cè)中應(yīng)用較多，已實(shí)現(xiàn)了對(duì)乙酸、乳酸及其他熱不穩(wěn)定酸的檢測(cè)[17-20]。本試驗(yàn)通過HPLC建立醬香型白酒酒糟中有機(jī)酸一步分離方法，采用有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間定性，峰面積定量，為全面了解醬香型白酒酒糟中有機(jī)酸構(gòu)成與含量變化如何影響醬香型白酒酒質(zhì)，開展白酒釀造工藝的改進(jìn)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：醬香型白酒酒糟樣品(3 個(gè)車間七輪次酒糟，取于遵義市茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠)。

試劑及耗材：苯丙二酸、檸檬酸、維生素C、戊二酸、琥珀酸、草酸、異戊酸、丙酸、丁酸、L-乳酸、蘋果酸、奎寧酸、富馬酸(標(biāo)準(zhǔn)品)，均購買自上海安譜世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；甲醇(色譜純)，德國默克公司；磷酸二氫鉀(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：AgiLent-1260 高效液相色譜儀(配備DAD 檢測(cè)器)；Waters T3 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μ m)；AΒ265-S 電子天平(梅特勒-托利多有限公司)；KQ-600E 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；pH 計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；D-24UV 超純水系統(tǒng)(默克密理博)；旋轉(zhuǎn)混勻儀(上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)；離心機(jī)(德國SIGMA)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）有機(jī)酸儲(chǔ)備液配制。分別精確稱取0.1 g蘋果酸、0.2 g 維生素C、0.2 g 戊二酸、0.2 g 富馬酸、0.2 g 琥珀酸、0.2 g 苯丙二酸、0.1 g 檸檬酸、0.05 g乳酸、0.08 g 丁酸、0.5 g 丙酸、0.5 g 異戊酸、0.2 g 草酸、0.2 g奎寧酸于10 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋溶解并定容，配制成10 mg/mL 蘋果酸、20 mg/mL維生素C、20 mg/mL 戊二酸、20 mg/mL 富馬酸、20 mg/mL 琥珀酸、20 mg/mL 苯丙二酸、10 mg/mL檸 檬 酸、5.0 mg/mL 乳 酸、8.0 mg/mL 丁 酸、50 mg/mL 丙酸、50 mg/mL 異戊酸、20 mg/mL 草酸、20 mg/mL奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4 ℃冰箱儲(chǔ)存。

（2）有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確移取適量13 種單標(biāo)儲(chǔ)備液混合于10 mL 容量瓶中，將有機(jī)酸儲(chǔ)備液按一定比例混合，流動(dòng)相定容配制成1.0 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸使用溶液，用流動(dòng)相配制成不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。準(zhǔn)確移取適量13種單標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，分別配成1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)使用單標(biāo)溶液，單標(biāo)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中同種類的有機(jī)酸濃度相同。0～4 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 色譜條件的選擇

色譜柱：Waters T3 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μ m)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：0.40 mL/min；進(jìn)樣量：10 μ L；流動(dòng)相：KH2PO4緩沖溶液(20 mmol/L，pH2.6)和甲醇；柱溫：25 ℃；梯度洗脫程序見表1，流動(dòng)相A 為KH2PO4緩沖溶液(20 mmol/L，pH2.6)，流動(dòng)相Β為甲醇。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件對(duì)有機(jī)酸組分分離效果的影響

2.1.1 流動(dòng)相中KH2PO4溶液濃度的選擇

有機(jī)酸在酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定，容易被分離，參考色譜柱對(duì)pH 值和鹽濃度的耐受能力，選擇pH2.6的條件下，KH2PO4溶液濃度分別為2 mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L，其結(jié)果表明，在KH2PO4溶液濃度為20 mmol/L 時(shí)維生素C 和L-乳酸達(dá)到分離，在其他濃度時(shí)峰有重疊現(xiàn)象。

2.1.2 流動(dòng)相中甲醇含量的選擇

在流動(dòng)相KH2PO4溶液濃度為20 mmol/L 時(shí)，改變流動(dòng)相Β 甲醇的比例，進(jìn)行梯度洗脫，隨著甲醇的比例上升，會(huì)導(dǎo)致磷酸鹽的析出而造成色譜柱堵塞，故梯度洗脫的終點(diǎn)設(shè)置為42 %。設(shè)置梯度洗脫方式3 種，對(duì)有機(jī)酸分離度較為明顯，梯度洗脫見表2。其中梯度洗脫1 效果最佳，其他兩種洗脫方式會(huì)造成色譜峰大部分重疊，在45～55 min時(shí)會(huì)出現(xiàn)基線突然飄高的情況。

2.1.3 流速的選擇

在流動(dòng)相KH2PO4溶液濃度為20 mmol/L，梯度洗脫方式為1 時(shí)，設(shè)置流速分別為0.38 mL/min、0.40 mL/min、0.42 mL/min，由實(shí)驗(yàn)可知，0.40 mL/min流速最佳，0.38 mL/min 流速過慢，導(dǎo)致維生素C 峰有拖尾的現(xiàn)象，影響L-乳酸的出峰情況，0.42 mL/min流速過快，導(dǎo)致丁酸與苯丙二酸峰完全重疊，鑒于二者情況，選擇0.40 mL/min的流速。

2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

使用0.02～5.0 mg/mL 不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2 方法進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。有機(jī)酸單標(biāo)確定各有機(jī)酸的分離時(shí)間，13 種有機(jī)酸HPLC圖見圖1。進(jìn)行線性回歸方程計(jì)算，13 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.99，取信噪比S/N=3 和S/N=10 時(shí)對(duì)應(yīng)分析物的濃度作為檢出限和定量限，結(jié)果如表3所示。

圖1 13種有機(jī)酸HPLC圖

表3 13種有機(jī)酸類的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性、檢出限、定量限

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取酒糟樣品作為空白基質(zhì)，加入適量有機(jī)酸標(biāo)液，同樣品進(jìn)行前處理，1.2 色譜條件HPLC 檢測(cè)，加標(biāo)回收結(jié)果見表4，回收率在84.0 %～111.0%。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性與精密度試驗(yàn)

取13 種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0 μ L，按照1.2色譜條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，連續(xù)上樣6次，通過分析有機(jī)酸的峰面積，計(jì)算峰面積的相對(duì)平均偏差(RSD)來評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性與精密度，峰面積重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＜5 %，重復(fù)性和精密度較好，有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的重復(fù)性與精密度見表5。

表5 13種有機(jī)酸的峰面積重復(fù)性與精密度

2.5 不同車間第七輪次醬香型白酒酒糟有機(jī)酸檢測(cè)

稱取酒糟樣品5.0 g，加入60%乙醇溶液10 mL，渦旋混勻20 min，在25 ℃下超聲波振蕩提取60 min，將浸出液以9000 r/min 離心10 min，取上清液，用0.45 μ m 尼龍膜過濾后按照1.2 色譜條件HPLC檢測(cè)，結(jié)果見表6。

表6 不同車間第七輪次醬香型白酒酒糟有機(jī)酸含量(mg/mL)

對(duì)三個(gè)車間酒糟進(jìn)行準(zhǔn)確定量和比較分析，由表6 數(shù)據(jù)可知，在醬香型白酒生產(chǎn)工藝一樣的情況下，三個(gè)車間七輪次酒糟的有機(jī)酸含量和種類都具有差異性，而且?guī)讉€(gè)車間有機(jī)酸的含量各不相同，車間3 乳酸含量明顯比車間1 和車間2 高，總的有機(jī)酸含量也比較高。在醬香型白酒中，酸度大了，會(huì)影響發(fā)酵，發(fā)酵不好，也會(huì)使總酸含量增加，造成出酒率降低。醬香型白酒中乳酸含量是比較高的，但是乳酸含量也不能過高，高了可能會(huì)影響產(chǎn)量，乳酸含量過低會(huì)影響酒質(zhì)，車間3 的酒質(zhì)和產(chǎn)酒量都是這幾個(gè)車間中最差的。因此，在醬香型白酒發(fā)酵過程中，可以通過檢測(cè)酒糟中有機(jī)酸的含量，進(jìn)一步加強(qiáng)和優(yōu)化白酒中有機(jī)酸的品質(zhì)控制，生產(chǎn)出更加優(yōu)質(zhì)的醬香型白酒。

3 結(jié)論

利用高效液相色譜法（HPLC）建立醬香型白酒酒糟有機(jī)酸定性定量的方法，實(shí)現(xiàn)了13 種有機(jī)酸的有效分離，該方法處理簡(jiǎn)單，流動(dòng)相為常見的甲醇和水，方法快速高效，且樣品檢測(cè)方法精密度、重復(fù)性、回收率實(shí)驗(yàn)基本符合要求。本方法可以用于檢測(cè)酒糟有機(jī)酸的含量，進(jìn)一步加強(qiáng)和優(yōu)化白酒中有機(jī)酸的品質(zhì)控制，生產(chǎn)出更加優(yōu)質(zhì)的醬香型白酒，為開展白酒釀造工藝的改進(jìn)提供一定的技術(shù)支撐。