樂(lè)金海 林湘東 向 茗 張 強(qiáng) 胡 哲
(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,長(zhǎng)沙,410007; 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所,長(zhǎng)沙,410208)
缺血性腦血管疾病是致殘、死亡的重要危險(xiǎn)因素[1-2]。缺血性腦血管疾病往往發(fā)病突然,若未得到及時(shí)救治極易造成腦組織的不可逆損害,存在諸如半側(cè)肢體功能障礙、語(yǔ)言障礙等后遺癥,是嚴(yán)重威脅居民健康與生命、降低患者生命質(zhì)量、增加患者不良事件風(fēng)險(xiǎn)的常見(jiàn)病、多發(fā)病[3]?,F(xiàn)階段缺血性腦血管疾病是醫(yī)學(xué)界頗為棘手的難題,是研究者亟須攻克的臨床重點(diǎn),當(dāng)前臨床治療本病的關(guān)鍵是重建腦組織血運(yùn),恢復(fù)缺血區(qū)域血液供應(yīng),改善腦組織損傷程度[4]。但是CAMPBELL等[5]研究顯示,腦卒中患者的腦組織在重建血運(yùn)之后,缺血再灌注的腦組織會(huì)發(fā)生異常凋亡事件,觸發(fā)局部腦組織一系列級(jí)聯(lián)效應(yīng),反而加劇缺血區(qū)域的損傷程度,形成缺血再灌注損傷。尋求治療缺血性腦血管疾病,保護(hù)腦組織缺血區(qū)域再灌注損傷的治療方法意義重大。
缺血性腦血管疾病屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”“卒中”等范疇[6],諸多醫(yī)家對(duì)本病的病因病機(jī)及發(fā)展預(yù)后多有論述,認(rèn)為“氣虛血瘀,腦絡(luò)受阻”是本病的基本病機(jī),“益氣活血,護(hù)腦安神”是治療本病的基本原則[7-8]。腦泰通組方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療缺血性腦血管疾病的效方,在多年的臨床運(yùn)用中取得了顯著、穩(wěn)定的療效,不良反應(yīng)較小,但其具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步明確。尼莫地平是目前臨床用于改善急性腦血管病血液循環(huán)的西藥,目前該藥聯(lián)合中醫(yī)藥治療腦卒中、改善腦缺血病變的研究較多,但其聯(lián)合中藥復(fù)方改善腦組織缺血再灌注的研究鮮有報(bào)道。本研究以前期預(yù)實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),采用大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模型構(gòu)建局灶性腦缺血再灌注大鼠模型,基于轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O3a(Forkhead Box O3a,FoxO3a)/低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)/核因子κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)信號(hào)通路探討腦泰通組方對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的影響及保護(hù)機(jī)制。
1.1 材料
1.1.1 動(dòng)物 100只無(wú)特定病原體動(dòng)物(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)健康雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠,6~7周齡,180~200 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004,合格證號(hào):43072663411303347,實(shí)驗(yàn)前給予1周適應(yīng)飼養(yǎng),環(huán)境溫度22~26 ℃,濕度55%~60%,自由攝食,實(shí)驗(yàn)全程按照動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行(倫理審批號(hào):LL201818B240)。
1.1.2 藥物 腦泰通組方中藥材購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房,經(jīng)制劑鑒定中心鑒定合格,具體藥物組成:黃芪20 g、當(dāng)歸10 g、赤芍10 g、川芎10 g、桃仁10 g、紅花10 g、三七10 g、人參10 g、地龍10 g。上述中藥材經(jīng)純凈水浸泡1 h后由制劑室根據(jù)人等效劑量進(jìn)行水煎濃縮為浸膏劑,使其終濃度為1.80 g/mL,置于常溫下陰涼處儲(chǔ)存;尼莫地平(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,德國(guó),批號(hào):20210307)。
1.1.3 試劑與儀器 FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)、B細(xì)胞淋巴瘤2(B Cell Lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl2-Associated X,Bax)抗體(Proteintech公司,美國(guó),貨號(hào):66428-1-Ig、20960-1-AP、10745-1-AP、28205-1-AP、12789-1-AP、50599-2-Ig);HRP goat anti-mouse IgG二抗(Proteintech公司,美國(guó),貨號(hào):SA00001-1);磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution,PBS)(Hyclone公司,美國(guó),貨號(hào):80334412);電鏡(徠卡公司,德國(guó),型號(hào):8344-Ⅱ);熒光PCR板(Thermo,美國(guó),型號(hào):66347-A);電動(dòng)搖床(江蘇其林貝爾儀器制造公司,型號(hào):TS-92);水平瓊脂糖電泳槽(北京六一儀器廠,型號(hào):JK3056);熒光定量PCR儀(Thermo,美國(guó),型號(hào):PIKOREAL96);電泳儀(北京六一儀器廠,型號(hào):DYY-2C);轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠,型號(hào):DYCZ-40D),其余實(shí)驗(yàn)試劑及儀器均由實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 方法
1.2.1 分組與模型制備 參考MIAO等[9]的局灶性腦缺血再灌注大鼠模型構(gòu)建方法(MCAO法),具體為:隨機(jī)選取90只SPF級(jí)SD大鼠,術(shù)前禁食12 h,制備尼龍繩栓結(jié),配制10%水合氯醛(300 mg/kg)。麻醉大鼠后取仰臥位頸中部術(shù)口,分離各層組織及右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈,于頸總動(dòng)脈分叉近心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈并以小動(dòng)物動(dòng)脈夾阻斷血流,于頸外動(dòng)脈分叉行V形切口,將制備好的無(wú)菌尼龍繩栓結(jié)緩慢放入并收緊線結(jié),放開(kāi)小動(dòng)物動(dòng)脈夾,緩慢將尼龍繩栓結(jié)沿著冠狀動(dòng)脈經(jīng)過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈放入大鼠腦內(nèi),放入約20 mm,感覺(jué)到存在阻力時(shí)立即停止放入線結(jié),使線結(jié)尾端平齊冠狀動(dòng)脈起始處,阻斷冠狀動(dòng)脈血流,拉緊尼龍繩,行止血操作,縫合術(shù)口,單籠飼養(yǎng)。待大鼠蘇醒后,根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)評(píng)分法對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠模型進(jìn)行評(píng)價(jià),即NIHSS評(píng)分2~3分的大鼠視為成模,納入后續(xù)研究。在本研究,共死亡24只,成功造模53只。隨機(jī)選取40只已成模的局灶性腦缺血再灌注大鼠,分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組(尼莫地平組)、中藥組(腦泰通組方組)、聯(lián)合用藥組(尼莫地平+腦泰通組方組),每組10只。另選取10只健康的SPF級(jí)SD大鼠作為假手術(shù)組,僅給予同部位分離頸內(nèi)、外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈,不用尼龍繩栓結(jié)。
1.2.2 給藥方法 假手術(shù)組與模型對(duì)照組均予以2 mL的0.9%生理鹽水灌胃;中藥組大鼠給予腦泰通組方浸膏灌胃,給藥劑量0.9 g/kg,1次/d;陽(yáng)性藥物組給予尼莫地平片粉末溶于2 mL的0.9%生理鹽水灌胃,給藥劑量16.2 mg/kg,1次/d;聯(lián)合用藥組給予尼莫地平片+腦泰通組方浸膏灌胃,劑量同前,1次/d。各組均連續(xù)干預(yù)7 d。
1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法
1.2.3.1 NIHSS評(píng)分測(cè)定 根據(jù)KWAH等[10]制定的NIHSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),在干預(yù)后1 d、3 d、7 d分別進(jìn)行NIHSS評(píng)分測(cè)定:緩慢抓起大鼠尾部,距離實(shí)驗(yàn)臺(tái)約10 cm,前爪趴于臺(tái)面,輕柔推動(dòng)其前肢大關(guān)節(jié)直至向前滑動(dòng)2 cm,選擇方向測(cè)試數(shù)次,腦組織未損傷大鼠在反方向可感受到抵抗,腦組織損傷大鼠則呈偏癱狀前爪屈曲。正常記為0分;前爪屈曲,抓尾試驗(yàn)陽(yáng)性記1分;前推抵抗程度明顯下降,前爪屈曲記2分;自發(fā)單側(cè)轉(zhuǎn)圈,爬行時(shí)出現(xiàn)偏癱記3分。
1.2.3.2 腦組織含水量測(cè)定 各組大鼠在最后1次干預(yù)2 h后處死,完整取出腦組織,于精準(zhǔn)天平稱取腦組織濕重,后置于烘箱烘干后稱取腦組織干重,腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。
1.2.3.3 腦組織缺血體積百分比測(cè)定 取出完整的腦組織后以大腦冠狀溝線進(jìn)行切片,放入1%的氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride,TTC)染色液中孵育20 min,健康腦組織表現(xiàn)為鮮紅色,缺血腦組織表現(xiàn)為白色,借助Image Pro Plus軟件分析腦組織缺血體積百分率,腦組織缺血體積百分率(%)=腦組織切片缺血區(qū)域面積/腦組織切片總面積×100%。
1.2.3.4 免疫組織化學(xué)法染色 根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作:脫蠟后進(jìn)行封閉,添加一抗、二抗,二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色,進(jìn)一步脫水、封片,隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行分析,用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度值(Average Optical Density,AOD)。
1.2.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表達(dá)水平 提取各組大鼠腦組織總蛋白,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulphate-polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)后將蛋白置于聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,5%脫脂奶粉完全封閉孵育60 min,添加一抗抗體FoxO3a(1∶1 000),HIF-1α(1∶1 000),NF-κB(1∶1 000),BDNF(1∶1 000),4 ℃環(huán)境下靜置12 h,棄去一抗,洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗膜3次,每次5 min。室溫孵育二抗2 h,洗滌后棄去二抗,TBST洗膜3次,每次5 min。顯色后以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參,計(jì)算各蛋白的灰度比值。
1.2.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB和BDNF的mRNA表達(dá)水平 提取大鼠腦組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,特異性擴(kuò)增FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF。反應(yīng)條件為95 ℃,10 min變性;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;40次循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算各蛋白的表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。
表1 引物序列
2.1 各組大鼠NIHSS評(píng)分比較 假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損。對(duì)各組大鼠于干預(yù)后1 d、3 d、7 d分別進(jìn)行NIHSS評(píng)分,模型對(duì)照組大鼠的NIHSS評(píng)分均隨著時(shí)間推移而升高,存在明顯的時(shí)間推移效應(yīng),而陽(yáng)性藥物組、中藥組、聯(lián)合用藥組大鼠的NIHSS評(píng)分均隨著時(shí)間推移而降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的NIHSS評(píng)分均低于陽(yáng)性藥物組與中藥組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。
表2 各組局灶性腦缺血再灌注大鼠模型NIHSS評(píng)分比較分,n=10)
2.2 各組大鼠腦組織含水量及缺血體積百分率比較 假手術(shù)組的腦組織含水量顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,陽(yáng)性藥物組、中藥組、聯(lián)合用藥組大鼠的腦組織含水量及缺血體積百分率均顯著降低(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組大鼠的腦組織含水量及缺血體積百分率均顯著低于陽(yáng)性藥物組與中藥組(均P<0.05)。見(jiàn)表3。
表3 各組大鼠腦組織含水量及缺血體積百分率比較
2.3 各組大鼠腦組織凋亡因子水平比較 假手術(shù)組Bax、Bcl-2均處于較低水平,在造模各組中,模型對(duì)照組Bax表達(dá)水平最高,中藥組、陽(yáng)性藥物組、聯(lián)合用藥組Bax表達(dá)水平依次降低;模型對(duì)照組Bcl-2表達(dá)水平最低,中藥組、陽(yáng)性藥物組、聯(lián)合用藥組Bax表達(dá)水平依次升高。假手術(shù)組大鼠腦組織Bax、Bcl-2平均光密度值、Bax/Bcl-2值顯著低于模型對(duì)照組(均P<0.05);與模型對(duì)照組比較,陽(yáng)性藥物組、中藥組、聯(lián)合用藥組的腦組織Bax平均光密度值、Bax/Bcl-2值顯著降低(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組的降低程度最大(P<0.05);Bcl-2平均光密度值顯著升高(P<0.05),其中聯(lián)合用藥組的升高程度最大(P<0.05),提示腦泰通組方可有效抑制腦組織凋亡,對(duì)腦組織具有保護(hù)作用。見(jiàn)圖1,表4。
圖1 大鼠腦組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況(DAB染色,×200)
表4 各組大鼠腦組織凋亡因子水平比較
2.4 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05);與模型對(duì)照組比較,陽(yáng)性藥物組、中藥組、聯(lián)合用藥組的腦組織NF-κB蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組的降低程度最大(P<0.05),FoxO3a、HIF-1α、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組的升高程度最大(P<0.05)。見(jiàn)圖2,表5~6。
圖2 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表達(dá)水平
表5 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表達(dá)水平比較
表6 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF mRNA表達(dá)情況
缺血性腦血管疾病的臨床發(fā)病率較高并呈現(xiàn)出逐年增加趨勢(shì),臨床預(yù)后較差,致殘率較高,是目前亟須解決的重大衛(wèi)生問(wèn)題[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,缺血性腦血管疾病屬于“本虛標(biāo)實(shí)”之證,其中病機(jī)關(guān)鍵在于“氣虛血瘀,腦絡(luò)受阻”。氣虛使血行不利,血行滯緩,日久成瘀,阻塞腦絡(luò),最終發(fā)為本病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,缺血性腦血管疾病的主要發(fā)病機(jī)制為腦組織內(nèi)血管被血栓堵塞、血液循環(huán)受限造成局部腦組織氧分及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足,誘發(fā)腦組織神經(jīng)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)與細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致神經(jīng)生物信號(hào)紊亂及功能障礙,并由此產(chǎn)生的致殘、致死等不良事件,嚴(yán)重威脅著患者的健康與生命,此外導(dǎo)致的后遺癥造成患者的生命質(zhì)量顯著下降,預(yù)后不佳[11-14]。XUE等[15]針對(duì)缺血性腦血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合研究進(jìn)展顯示,氣虛血瘀主要體現(xiàn)在腦組織內(nèi)血栓形成,或動(dòng)脈內(nèi)管腔狹窄,導(dǎo)致血液循環(huán)速度減慢,同時(shí)各種缺氧級(jí)聯(lián)反應(yīng)持續(xù)發(fā)生,炎癥介質(zhì)釋放,極大地?fù)p傷腦組織及神經(jīng)的形態(tài)與功能。因此,中醫(yī)治療缺血性腦血管疾病的總體原則為益氣活血、護(hù)腦安神。由于缺血性腦血管疾病的特殊性及復(fù)雜性,針對(duì)本病發(fā)現(xiàn)新的治療手段已成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。腦泰通組方化裁于中醫(yī)經(jīng)典方劑補(bǔ)陽(yáng)還五湯,具有益氣活血、護(hù)腦安神的功效?,F(xiàn)階段,中醫(yī)藥因其多作用靶點(diǎn)、多信號(hào)通路、多層次、綜合性的整體調(diào)控作用備受矚目[16]。
本研究采取MCAO法構(gòu)建局灶性腦缺血再灌注大鼠模型,本造模方法屬于比較成熟、穩(wěn)定的造模方法,為本研究的實(shí)施提供了動(dòng)物模型基礎(chǔ)。研究顯示,缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展存在多種復(fù)雜的機(jī)制,涉及到細(xì)胞信號(hào)紊亂、細(xì)胞凋亡、組織重構(gòu)、缺氧級(jí)聯(lián)反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過(guò)程[17]。本研究結(jié)果顯示,腦泰通組方能有效保護(hù)局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的腦組織損傷,改善局部腦缺血,抑制腦組織細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng),同時(shí)能夠有效促進(jìn)FoxO3a、HIF-1α、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)水平,抑制NF-κB蛋白及mRNA的表達(dá)水平。FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的缺血性腦血管疾病的重要信號(hào)通路,其密切參與到腦組織內(nèi)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、缺氧反應(yīng)及炎癥反應(yīng)過(guò)程中,對(duì)調(diào)控腦組織及神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程具有重要作用[18]。
FoxO3a被稱為“人類長(zhǎng)壽的密碼”,廣泛存在于人體組織中,與人類衰老表型密切相關(guān)[19],TAN等[20]研究顯示,FoxO3a屬于人體內(nèi)非常重要的能量代謝調(diào)控蛋白,其在人體腦組織、心肌組織等高能量代謝的組織內(nèi)的表達(dá)量顯著高于其他部位;LI等[21]研究表明,FoxO3a能夠?qū)?yīng)激性代謝過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié),其表達(dá)水平上升能夠有效保護(hù)人體組織免受氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的損害,尤其是腦組織等需氧量較多的高能量代謝部位。在缺血性腦血管疾病中,存在著極為復(fù)雜的缺氧級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及組織重構(gòu),HIF-1α屬于代謝調(diào)節(jié)蛋白,RAHMATI等[22]研究顯示,在缺血性腦血管疾病中HIF-1α能夠有效調(diào)節(jié)缺血缺氧時(shí)腦組織細(xì)胞內(nèi)的氧平衡,維持在缺氧缺血狀態(tài)下的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),并調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)缺氧。BDNF是人體內(nèi)最重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,其對(duì)腦組織及神經(jīng)細(xì)胞存在顯著的保護(hù)效應(yīng)[23],同時(shí)BEMBENEK等[24]研究顯示,BDNF對(duì)腦組織及神經(jīng)細(xì)胞的重構(gòu)、細(xì)胞生長(zhǎng)再生具有重要的維持和促進(jìn)作用。此外,CHEN等[25]研究顯示FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信號(hào)通路對(duì)于腦組織缺血后的腦血管復(fù)通、重構(gòu)血管通道、細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)建等存在重要的調(diào)控功能,這對(duì)于缺血性腦血管疾病的治療與康復(fù)具有重要意義。研究該信號(hào)通路在缺血性腦血管疾病的具體作用機(jī)制,為本病的治療提供了新的思路及方法,是較為值得去嘗試的重要研究方向。
綜上所述,腦泰通組方契合缺血性腦血管疾病的病因病機(jī),能有效保護(hù)局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的腦組織損傷,改善局部腦缺血,抑制腦組織細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng),并與西藥聯(lián)用存在較明顯的“協(xié)同增效”作用,其作用機(jī)制可能與腦泰通組方調(diào)控FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果凸顯了中西醫(yī)結(jié)合治療缺血性腦血管疾病的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),腦泰通組方的中藥材均為常見(jiàn)藥物,方便易得,價(jià)位合理,操作簡(jiǎn)單,適于臨床進(jìn)一步推廣,也為中西醫(yī)結(jié)合治療缺血性腦血管疾病提供了新的思路與方法。
利益沖突聲明:無(wú)。