樂金海 林湘東 向 茗 張 強(qiáng) 胡 哲

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,長沙,410007; 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所,長沙,410208)

缺血性腦血管疾病是致殘、死亡的重要危險因素[1-2]。缺血性腦血管疾病往往發(fā)病突然,若未得到及時救治極易造成腦組織的不可逆損害,存在諸如半側(cè)肢體功能障礙、語言障礙等后遺癥,是嚴(yán)重威脅居民健康與生命、降低患者生命質(zhì)量、增加患者不良事件風(fēng)險的常見病、多發(fā)病[3]?，F(xiàn)階段缺血性腦血管疾病是醫(yī)學(xué)界頗為棘手的難題,是研究者亟須攻克的臨床重點(diǎn),當(dāng)前臨床治療本病的關(guān)鍵是重建腦組織血運(yùn),恢復(fù)缺血區(qū)域血液供應(yīng),改善腦組織損傷程度[4]。但是CAMPBELL等[5]研究顯示,腦卒中患者的腦組織在重建血運(yùn)之后,缺血再灌注的腦組織會發(fā)生異常凋亡事件,觸發(fā)局部腦組織一系列級聯(lián)效應(yīng),反而加劇缺血區(qū)域的損傷程度,形成缺血再灌注損傷。尋求治療缺血性腦血管疾病,保護(hù)腦組織缺血區(qū)域再灌注損傷的治療方法意義重大。

缺血性腦血管疾病屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”“卒中”等范疇[6],諸多醫(yī)家對本病的病因病機(jī)及發(fā)展預(yù)后多有論述,認(rèn)為“氣虛血瘀,腦絡(luò)受阻”是本病的基本病機(jī),“益氣活血,護(hù)腦安神”是治療本病的基本原則[7-8]。腦泰通組方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療缺血性腦血管疾病的效方,在多年的臨床運(yùn)用中取得了顯著、穩(wěn)定的療效,不良反應(yīng)較小,但其具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步明確。尼莫地平是目前臨床用于改善急性腦血管病血液循環(huán)的西藥,目前該藥聯(lián)合中醫(yī)藥治療腦卒中、改善腦缺血病變的研究較多,但其聯(lián)合中藥復(fù)方改善腦組織缺血再灌注的研究鮮有報道。本研究以前期預(yù)實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),采用大腦中動脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模型構(gòu)建局灶性腦缺血再灌注大鼠模型,基于轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O3a(Forkhead Box O3a,FoxO3a)/低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)/核因子κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)信號通路探討腦泰通組方對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的影響及保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 100只無特定病原體動物(Specific Pathogen Free,SPF)級健康雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠,6～7周齡,180～200 g,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,動物許可證號:SCXK(湘)2019-0004,合格證號:43072663411303347,實(shí)驗(yàn)前給予1周適應(yīng)飼養(yǎng),環(huán)境溫度22～26 ℃,濕度55%～60%,自由攝食,實(shí)驗(yàn)全程按照動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行(倫理審批號:LL201818B240)。

1.1.2 藥物 腦泰通組方中藥材購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房,經(jīng)制劑鑒定中心鑒定合格,具體藥物組成:黃芪20 g、當(dāng)歸10 g、赤芍10 g、川芎10 g、桃仁10 g、紅花10 g、三七10 g、人參10 g、地龍10 g。上述中藥材經(jīng)純凈水浸泡1 h后由制劑室根據(jù)人等效劑量進(jìn)行水煎濃縮為浸膏劑,使其終濃度為1.80 g/mL,置于常溫下陰涼處儲存;尼莫地平(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,德國,批號:20210307)。

1.1.3 試劑與儀器 FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)、B細(xì)胞淋巴瘤2(B Cell Lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl2-Associated X,Bax)抗體(Proteintech公司,美國,貨號:66428-1-Ig、20960-1-AP、10745-1-AP、28205-1-AP、12789-1-AP、50599-2-Ig);HRP goat anti-mouse IgG二抗(Proteintech公司,美國,貨號:SA00001-1);磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution,PBS)(Hyclone公司,美國,貨號:80334412);電鏡(徠卡公司,德國,型號:8344-Ⅱ);熒光PCR板(Thermo,美國,型號:66347-A);電動搖床(江蘇其林貝爾儀器制造公司,型號:TS-92);水平瓊脂糖電泳槽(北京六一儀器廠,型號:JK3056);熒光定量PCR儀(Thermo,美國,型號:PIKOREAL96);電泳儀(北京六一儀器廠,型號:DYY-2C);轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠,型號:DYCZ-40D),其余實(shí)驗(yàn)試劑及儀器均由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 參考MIAO等[9]的局灶性腦缺血再灌注大鼠模型構(gòu)建方法(MCAO法),具體為:隨機(jī)選取90只SPF級SD大鼠,術(shù)前禁食12 h,制備尼龍繩栓結(jié),配制10%水合氯醛(300 mg/kg)。麻醉大鼠后取仰臥位頸中部術(shù)口,分離各層組織及右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈,于頸總動脈分叉近心端結(jié)扎頸外動脈并以小動物動脈夾阻斷血流,于頸外動脈分叉行V形切口,將制備好的無菌尼龍繩栓結(jié)緩慢放入并收緊線結(jié),放開小動物動脈夾,緩慢將尼龍繩栓結(jié)沿著冠狀動脈經(jīng)過頸內(nèi)動脈放入大鼠腦內(nèi),放入約20 mm,感覺到存在阻力時立即停止放入線結(jié),使線結(jié)尾端平齊冠狀動脈起始處,阻斷冠狀動脈血流,拉緊尼龍繩,行止血操作,縫合術(shù)口,單籠飼養(yǎng)。待大鼠蘇醒后,根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)評分法對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型進(jìn)行評價,即NIHSS評分2～3分的大鼠視為成模,納入后續(xù)研究。在本研究,共死亡24只,成功造模53只。隨機(jī)選取40只已成模的局灶性腦缺血再灌注大鼠,分為模型對照組、陽性藥物組(尼莫地平組)、中藥組(腦泰通組方組)、聯(lián)合用藥組(尼莫地平+腦泰通組方組),每組10只。另選取10只健康的SPF級SD大鼠作為假手術(shù)組,僅給予同部位分離頸內(nèi)、外動脈及頸總動脈,不用尼龍繩栓結(jié)。

1.2.2 給藥方法 假手術(shù)組與模型對照組均予以2 mL的0.9%生理鹽水灌胃;中藥組大鼠給予腦泰通組方浸膏灌胃,給藥劑量0.9 g/kg,1次/d;陽性藥物組給予尼莫地平片粉末溶于2 mL的0.9%生理鹽水灌胃,給藥劑量16.2 mg/kg,1次/d;聯(lián)合用藥組給予尼莫地平片+腦泰通組方浸膏灌胃,劑量同前,1次/d。各組均連續(xù)干預(yù)7 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 NIHSS評分測定 根據(jù)KWAH等[10]制定的NIHSS評分標(biāo)準(zhǔn),在干預(yù)后1 d、3 d、7 d分別進(jìn)行NIHSS評分測定:緩慢抓起大鼠尾部,距離實(shí)驗(yàn)臺約10 cm,前爪趴于臺面,輕柔推動其前肢大關(guān)節(jié)直至向前滑動2 cm,選擇方向測試數(shù)次,腦組織未損傷大鼠在反方向可感受到抵抗,腦組織損傷大鼠則呈偏癱狀前爪屈曲。正常記為0分;前爪屈曲,抓尾試驗(yàn)陽性記1分;前推抵抗程度明顯下降,前爪屈曲記2分;自發(fā)單側(cè)轉(zhuǎn)圈,爬行時出現(xiàn)偏癱記3分。

1.2.3.2 腦組織含水量測定 各組大鼠在最后1次干預(yù)2 h后處死,完整取出腦組織,于精準(zhǔn)天平稱取腦組織濕重,后置于烘箱烘干后稱取腦組織干重,腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.2.3.3 腦組織缺血體積百分比測定 取出完整的腦組織后以大腦冠狀溝線進(jìn)行切片,放入1%的氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride,TTC)染色液中孵育20 min,健康腦組織表現(xiàn)為鮮紅色,缺血腦組織表現(xiàn)為白色,借助Image Pro Plus軟件分析腦組織缺血體積百分率,腦組織缺血體積百分率(%)=腦組織切片缺血區(qū)域面積/腦組織切片總面積×100%。

1.2.3.4 免疫組織化學(xué)法染色 根據(jù)說明書步驟進(jìn)行操作:脫蠟后進(jìn)行封閉,添加一抗、二抗,二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色,進(jìn)一步脫水、封片,隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行分析,用Image Pro Plus 6.0軟件計算平均光密度值(Average Optical Density,AOD)。

1.2.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表達(dá)水平 提取各組大鼠腦組織總蛋白,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulphate-polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)后將蛋白置于聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,5%脫脂奶粉完全封閉孵育60 min,添加一抗抗體FoxO3a(1∶1 000),HIF-1α(1∶1 000),NF-κB(1∶1 000),BDNF(1∶1 000),4 ℃環(huán)境下靜置12 h,棄去一抗,洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗膜3次,每次5 min。室溫孵育二抗2 h,洗滌后棄去二抗,TBST洗膜3次,每次5 min。顯色后以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參,計算各蛋白的灰度比值。

1.2.3.6 實(shí)時定量PCR檢測大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB和BDNF的mRNA表達(dá)水平 提取大鼠腦組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,特異性擴(kuò)增FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF。反應(yīng)條件為95 ℃,10 min變性;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;40次循環(huán)。采用2-△△Ct法計算各蛋白的表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠NIHSS評分比較 假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損。對各組大鼠于干預(yù)后1 d、3 d、7 d分別進(jìn)行NIHSS評分,模型對照組大鼠的NIHSS評分均隨著時間推移而升高,存在明顯的時間推移效應(yīng),而陽性藥物組、中藥組、聯(lián)合用藥組大鼠的NIHSS評分均隨著時間推移而降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組大鼠在不同時間點(diǎn)的NIHSS評分均低于陽性藥物組與中藥組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組局灶性腦缺血再灌注大鼠模型NIHSS評分比較分,n=10)

2.2 各組大鼠腦組織含水量及缺血體積百分率比較 假手術(shù)組的腦組織含水量顯著低于模型對照組(P<0.05);與模型對照組比較,陽性藥物組、中藥組、聯(lián)合用藥組大鼠的腦組織含水量及缺血體積百分率均顯著降低(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組大鼠的腦組織含水量及缺血體積百分率均顯著低于陽性藥物組與中藥組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量及缺血體積百分率比較

2.3 各組大鼠腦組織凋亡因子水平比較 假手術(shù)組Bax、Bcl-2均處于較低水平,在造模各組中,模型對照組Bax表達(dá)水平最高,中藥組、陽性藥物組、聯(lián)合用藥組Bax表達(dá)水平依次降低;模型對照組Bcl-2表達(dá)水平最低,中藥組、陽性藥物組、聯(lián)合用藥組Bax表達(dá)水平依次升高。假手術(shù)組大鼠腦組織Bax、Bcl-2平均光密度值、Bax/Bcl-2值顯著低于模型對照組(均P<0.05);與模型對照組比較,陽性藥物組、中藥組、聯(lián)合用藥組的腦組織Bax平均光密度值、Bax/Bcl-2值顯著降低(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組的降低程度最大(P<0.05);Bcl-2平均光密度值顯著升高(P<0.05),其中聯(lián)合用藥組的升高程度最大(P<0.05),提示腦泰通組方可有效抑制腦組織凋亡,對腦組織具有保護(hù)作用。見圖1,表4。

圖1 大鼠腦組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況(DAB染色,×200)

表4 各組大鼠腦組織凋亡因子水平比較

2.4 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較,模型對照組腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05);與模型對照組比較,陽性藥物組、中藥組、聯(lián)合用藥組的腦組織NF-κB蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組的降低程度最大(P<0.05),FoxO3a、HIF-1α、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05),其中聯(lián)合用藥組的升高程度最大(P<0.05)。見圖2,表5～6。

圖2 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表達(dá)水平

表5 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF蛋白表達(dá)水平比較

表6 各組大鼠腦組織FoxO3a、HIF-1α、NF-κB、BDNF mRNA表達(dá)情況

3 討論

缺血性腦血管疾病的臨床發(fā)病率較高并呈現(xiàn)出逐年增加趨勢,臨床預(yù)后較差,致殘率較高,是目前亟須解決的重大衛(wèi)生問題[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,缺血性腦血管疾病屬于“本虛標(biāo)實(shí)”之證,其中病機(jī)關(guān)鍵在于“氣虛血瘀,腦絡(luò)受阻”。氣虛使血行不利,血行滯緩,日久成瘀,阻塞腦絡(luò),最終發(fā)為本病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,缺血性腦血管疾病的主要發(fā)病機(jī)制為腦組織內(nèi)血管被血栓堵塞、血液循環(huán)受限造成局部腦組織氧分及營養(yǎng)供應(yīng)不足,誘發(fā)腦組織神經(jīng)一系列的級聯(lián)反應(yīng)與細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致神經(jīng)生物信號紊亂及功能障礙,并由此產(chǎn)生的致殘、致死等不良事件,嚴(yán)重威脅著患者的健康與生命,此外導(dǎo)致的后遺癥造成患者的生命質(zhì)量顯著下降,預(yù)后不佳[11-14]。XUE等[15]針對缺血性腦血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合研究進(jìn)展顯示,氣虛血瘀主要體現(xiàn)在腦組織內(nèi)血栓形成,或動脈內(nèi)管腔狹窄,導(dǎo)致血液循環(huán)速度減慢,同時各種缺氧級聯(lián)反應(yīng)持續(xù)發(fā)生,炎癥介質(zhì)釋放,極大地?fù)p傷腦組織及神經(jīng)的形態(tài)與功能。因此,中醫(yī)治療缺血性腦血管疾病的總體原則為益氣活血、護(hù)腦安神。由于缺血性腦血管疾病的特殊性及復(fù)雜性,針對本病發(fā)現(xiàn)新的治療手段已成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。腦泰通組方化裁于中醫(yī)經(jīng)典方劑補(bǔ)陽還五湯,具有益氣活血、護(hù)腦安神的功效?，F(xiàn)階段,中醫(yī)藥因其多作用靶點(diǎn)、多信號通路、多層次、綜合性的整體調(diào)控作用備受矚目[16]。

本研究采取MCAO法構(gòu)建局灶性腦缺血再灌注大鼠模型,本造模方法屬于比較成熟、穩(wěn)定的造模方法,為本研究的實(shí)施提供了動物模型基礎(chǔ)。研究顯示,缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展存在多種復(fù)雜的機(jī)制,涉及到細(xì)胞信號紊亂、細(xì)胞凋亡、組織重構(gòu)、缺氧級聯(lián)反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程[17]。本研究結(jié)果顯示,腦泰通組方能有效保護(hù)局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的腦組織損傷,改善局部腦缺血,抑制腦組織細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng),同時能夠有效促進(jìn)FoxO3a、HIF-1α、BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)水平,抑制NF-κB蛋白及mRNA的表達(dá)水平。FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的缺血性腦血管疾病的重要信號通路,其密切參與到腦組織內(nèi)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、缺氧反應(yīng)及炎癥反應(yīng)過程中,對調(diào)控腦組織及神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程具有重要作用[18]。

FoxO3a被稱為“人類長壽的密碼”,廣泛存在于人體組織中,與人類衰老表型密切相關(guān)[19],TAN等[20]研究顯示,FoxO3a屬于人體內(nèi)非常重要的能量代謝調(diào)控蛋白,其在人體腦組織、心肌組織等高能量代謝的組織內(nèi)的表達(dá)量顯著高于其他部位;LI等[21]研究表明,FoxO3a能夠?qū)?yīng)激性代謝過程進(jìn)行調(diào)節(jié),其表達(dá)水平上升能夠有效保護(hù)人體組織免受氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的損害,尤其是腦組織等需氧量較多的高能量代謝部位。在缺血性腦血管疾病中,存在著極為復(fù)雜的缺氧級聯(lián)反應(yīng)以及組織重構(gòu),HIF-1α屬于代謝調(diào)節(jié)蛋白,RAHMATI等[22]研究顯示,在缺血性腦血管疾病中HIF-1α能夠有效調(diào)節(jié)缺血缺氧時腦組織細(xì)胞內(nèi)的氧平衡,維持在缺氧缺血狀態(tài)下的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),并調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)缺氧。BDNF是人體內(nèi)最重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,其對腦組織及神經(jīng)細(xì)胞存在顯著的保護(hù)效應(yīng)[23],同時BEMBENEK等[24]研究顯示,BDNF對腦組織及神經(jīng)細(xì)胞的重構(gòu)、細(xì)胞生長再生具有重要的維持和促進(jìn)作用。此外,CHEN等[25]研究顯示FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信號通路對于腦組織缺血后的腦血管復(fù)通、重構(gòu)血管通道、細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)建等存在重要的調(diào)控功能,這對于缺血性腦血管疾病的治療與康復(fù)具有重要意義。研究該信號通路在缺血性腦血管疾病的具體作用機(jī)制,為本病的治療提供了新的思路及方法,是較為值得去嘗試的重要研究方向。

綜上所述,腦泰通組方契合缺血性腦血管疾病的病因病機(jī),能有效保護(hù)局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的腦組織損傷,改善局部腦缺血,抑制腦組織細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng),并與西藥聯(lián)用存在較明顯的“協(xié)同增效”作用,其作用機(jī)制可能與腦泰通組方調(diào)控FoxO3a/HIF-1α/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果凸顯了中西醫(yī)結(jié)合治療缺血性腦血管疾病的獨(dú)特優(yōu)勢,腦泰通組方的中藥材均為常見藥物,方便易得,價位合理,操作簡單,適于臨床進(jìn)一步推廣,也為中西醫(yī)結(jié)合治療缺血性腦血管疾病提供了新的思路與方法。

利益沖突聲明:無。