施 敏 劉富林 夏旭婷 張 婷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué),長沙,410208)

慢傳輸型便秘(Slow Transit Constipation,STC)是指因為結(jié)腸傳輸功能障礙而導(dǎo)致的腸內(nèi)容物滯留或排出不順利的狀態(tài)[1]。Preston和Lennard-Jones[2]在1986年首次提出STC的概念,認為臨床主要以便意減退或消失、便次減少,糞質(zhì)干結(jié)、排便不暢并伴隨腹部不適等癥狀為主要表現(xiàn)。流行病學(xué)研究顯示,STC在慢性便秘中發(fā)病率占首位[3],其發(fā)病機制尚不明確,現(xiàn)有研究認為可能與腸神經(jīng)遞質(zhì)、Cajal間質(zhì)細胞、腸道菌群等多種因素有關(guān)[4-6]。STC不僅嚴重影響患者的生命質(zhì)量,且易導(dǎo)致肛腸、心腦血管等危險疾病發(fā)生。目前西醫(yī)主要有藥物和手術(shù)治療[7],而西藥有一定的依賴性和不良反應(yīng),手術(shù)治療存在風(fēng)險性,STC在中醫(yī)學(xué)歸屬于便秘范疇,傳統(tǒng)中醫(yī)治療STC有其獨特的優(yōu)勢作用[8]。STC多以虛證為主,少有實證。《丹溪心法·脾約丸論》云:“胃強脾弱,約束津液不得四布……故曰脾約……脾弱不得通也。”故STC治療重點在于健脾益氣。黃芪有健脾益氣的功效,現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,黃芪有調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用,尤其適用于體虛的老年便秘患者[9]。單崇武[10]用黃芪湯加味治療將50例肺脾氣虛型功能性便秘患者,觀察組總有效率為88.0%,高于對照組50例的70.0%。

本研究基于系統(tǒng)生物學(xué)相關(guān)理論[11],借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù),探討黃芪的活性化合物與靶點之間的關(guān)系,探究黃芪多成分、多靶點、多通路治療STC的作用機制,以期為黃芪治療STC提供科學(xué)依據(jù)與臨床應(yīng)用參考。

1 資料與方法

1.1 黃芪活性成分和靶蛋白 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索并結(jié)合文獻[12-17]篩選黃芪的活性成分,以類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18和口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%進行篩選,得到黃芪的有效成分,并下載其分子結(jié)構(gòu),同時檢索活性成分對應(yīng)的靶蛋白。篩選完成后統(tǒng)一在Uniprot(https://www.uniprot.org/)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等數(shù)據(jù)庫輸入靶點蛋白名稱,限定物種為“Homo sapiens”將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點進行規(guī)范。

1.2 STC疾病靶點篩選 在人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,http://omim.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)中輸入關(guān)鍵詞“slow transit contipation”檢索疾病靶點。去除重復(fù)靶點并經(jīng)Uniprot校正整合得到STC相關(guān)靶點。運用R語言(VennDiagram包)將黃芪有效成分的靶蛋白與STC疾病靶點取交集,得到黃芪治療STC的靶點。

1.3 構(gòu)建黃芪中藥-活性成分-疾病靶基因網(wǎng)絡(luò)圖 借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建中藥-活性成分-疾病基因網(wǎng)絡(luò),并計算其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)特征值。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI) 將黃芪與STC交集靶基因?qū)隨tring(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,將物種設(shè)定為“Homo sapiens”,相互作用閾值設(shè)定為“median confidence”(0.4),其余均為默認設(shè)置,獲取交互作用,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并計算其網(wǎng)絡(luò)中每個靶基因Degree,采用R語言繪制Degree最大的前20個靶基因的柱狀圖。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入CytoScape3.7.2,借助CytoNCA插件分析靶點的連接度(Degree)、介度(Betweenness)等網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù),根據(jù)Degree和Betweenness≥2倍中位數(shù)篩選核心靶點。將疾病與中藥取交集得到的基因進行PPI分析,得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖其中“邊”代表作用靶基因之間的關(guān)聯(lián),粗細用combine score表示,“邊”越粗,combine score值越大,代表其結(jié)合度越大;節(jié)點代表作用靶基因。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 應(yīng)用R語言(dose、clusterProfiler、enrichplot包)從生物過程(Biological Process,BP),細胞組分(Cellular Component,CC),分子功能(Molecular Function,MF)進行GO通路富集分析,同時進行KEGG通路富集分析,設(shè)定閾值P<0.05,繪制條形圖和氣泡圖以進一步揭示黃芪治療STC的作用機制。

1.6 分子對接 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載核心靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)pdb格式文件,用Pymol軟件移去水分子和配體分子,在TCMSP中下載化合物3D結(jié)構(gòu)的mol格式。導(dǎo)入Swiss Dock在線分子對接工具(http://www.swissdock.ch/)將靶點與黃芪活性成分進行對接,用以評價活性成分與關(guān)鍵靶點之間的對接效果。

2 結(jié)果

2.1 篩選黃芪的活性成分和靶蛋白 篩選到黃芪所含20個活性成分。見表1。篩選出作用靶基因953個,去重后獲得相關(guān)靶基因189個。

表1 黃芪主要活性成分

2.2 STC疾病靶基因 篩選從GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索分別得到STC靶基因3 278個、143個,整合后共3 817個,經(jīng)過Uniprot校正整合后得到3 174個,將其與2.1得到的藥物作用靶基因189個借助R語言取交集得到PGR、NOS2、PTGS1、AR、SCN5A等共143個。見圖1。

圖1 藥物-疾病交集基因韋恩圖

2.3 構(gòu)建黃芪中藥活性成分-疾病靶基因網(wǎng)絡(luò)圖 得到黃芪-活性成分-疾病靶基因網(wǎng)絡(luò)見圖2。各節(jié)點上連線越多,代表其相關(guān)的靶基因和成分越多。

圖2 黃芪活性成分-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓撲分析 共有143個節(jié)點、2 353條邊,平均節(jié)點度為32.9,平均局部聚類系數(shù)為0.619。見圖3。

圖3 靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)

Degree最大的前20個靶基因。Degree值排名前10位的核心節(jié)點分別為AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、JUN、MYC、MAPK8、EGF、EGFR、MAPK1。見圖4。

圖4 靶基因Degree值柱狀圖

Degree值排在前10位的分別為JUN、VEGFA、AKT1、CASP3、IL-6、MAPK1、EGF、MAPK8、MYC、EGFR。黃芪治療STC的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖5。

圖5 靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)拓撲分析

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析 GO功能富集分析得到GO條目2 173個,其中生物過程、細胞組分、分子功能各1 943個、77個、153個。生物過程主要與對脂多糖的回應(yīng)、對細菌起源分子的反應(yīng)、對抗生素的反應(yīng)等信號通路有關(guān);在細胞組分主要與薄膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、突觸后膜的組成部分等信號通路有關(guān);在分子功能主要與核受體結(jié)合、類固醇激素受體活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、組蛋白激酶活性、泛素-蛋白連接酶結(jié)合等信號通路有關(guān)。見表2。

表2 GO功能富集分析結(jié)果

KEGG富集分析共得到163條信號通路,可知黃芪可通過乙型肝炎、前列腺癌、IL-17信號通路、TNF信號通路等作用通路發(fā)揮對STC的治療作用,KEGG通路富集分析結(jié)果前20個條形圖和氣泡圖,條形圖顏色代表富集程度,條形長度代表富集的基因數(shù)目,氣泡圖顏色代表富集程度,氣泡大小代表富集的基因數(shù)目。見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析條形圖和氣泡圖

2.6 分子對接 分子對接結(jié)果顯示葉酸、1,7-二羥基-3,9-二甲氧基紫檀素、山柰酚、槲皮素4種成分與5個靶點結(jié)合比較緊密。見表3。蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合越緊密,結(jié)合能值越低,可看出葉酸和IL-6形成氫鍵作用,使得蛋白與化合物形成穩(wěn)定的復(fù)合物。見圖7。

圖7 葉酸與IL-6對接圖

表3 分子對接結(jié)果

3 討論

慢傳輸型便秘是由于大腸傳導(dǎo)功能紊亂而導(dǎo)致的排便困難,中醫(yī)學(xué)歸屬不大便、脾約等范疇[18]。其病機主要為氣虛大腸傳導(dǎo)無力。本病屬本虛標實,主要以脾氣虛為主?！栋Y因脈治》中指出氣虛則大腸傳道失司,腸失濡潤致糟粕傳送失常,形成腑氣不通,而致便秘[19]。黃芪有補氣健脾、升陽舉陷、利水消腫的功效,臨床上用于治療肺脾氣虛證等。有研究表明,黃芪可明顯升高脾虛小鼠Hb值、LAK細胞活性、白細胞介素-2活性及CD4+/CD8+細胞比值,并對其免疫功能低下有改善作用[20]。余克強等[21]通過對26項研究1 955例患者進行Meta分析證明以黃芪為主的中成藥或方劑治療氣虛型功能性便秘安全有效。

本研究從化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖可知,黃芪中山柰酚、葉酸、槲皮素、異鼠李素、芒柄花素等20個化合物作用于STC疾病相關(guān)的143個靶點,說明了黃芪是通過多成分、多靶點協(xié)同發(fā)揮治療STC的作用。String在線數(shù)據(jù)庫所得PPI網(wǎng)絡(luò)顯示節(jié)點度排名前的核心節(jié)點有AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、JUN。核心基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖拓撲分析結(jié)果中Degree值靠前的有JUN、VEGFA、AKT1、CASP3、IL-6。二者取交集得到黃芪治療STC的關(guān)鍵核心靶點AKT1、JUN、IL-6、VEGFA、CASP3。

AKT1是PI3K/AKT信號通路下游的主要靶點,主要參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[22]。張高松[23]通過實驗研究推導(dǎo)出AKT在STC大鼠表達的減少可能是STC發(fā)病機制之一?，F(xiàn)有研究認為JUN主要與癌癥的發(fā)生有關(guān),JUN癌基因激活后其蛋白以JUN或JUN同源二聚體的形式結(jié)合到轉(zhuǎn)錄激活蛋白1啟動子結(jié)合位點,誘導(dǎo)癌基因表達,參與細胞惡性轉(zhuǎn)化[24-25]。IL-6具有廣泛的促炎癥反應(yīng)作用,其過度表達會造成腸道炎性病變[26],并可導(dǎo)致胃腸運動及分泌功能紊亂,其作用機制可能與激活胃腸道黏膜下層的神經(jīng)元影響腎上腺應(yīng)激反應(yīng)和胃腸蠕動有關(guān)[27]。血管內(nèi)皮生長因子A基因的表達可使腸道細胞間的緊密連接松弛,損傷腸黏膜屏障從而導(dǎo)致腸道微生物入侵腸壁[28]。李超[29]報道胱天蛋白酶3是細胞凋亡途徑中的關(guān)鍵角色,腸細胞的非正常凋亡可能會引起腸黏膜屏障破壞受損,進一步造成STC的發(fā)生。GO富集分析預(yù)測出黃芪對STC的治療機制可能是通過對脂多糖的回應(yīng)、對細菌起源的分子反應(yīng)、薄膜筏、膜微區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、核受體結(jié)合、類固醇激素受體活性產(chǎn)生作用的。

KEGG富集分析預(yù)測出黃芪對STC的治療機制可能是通過流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、IL-17信號通路產(chǎn)生作用的,結(jié)合黃芪主要活性成分和其作用靶點,我們推測黃芪可能通過抗炎、提高免疫、保護腸黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群和神經(jīng)遞質(zhì)等作用機制,從而促進腸道運動,達到益氣健脾、通陽利水的功效,改善STC癥狀。

本研究得到的相關(guān)通路雖然與目前研究較多的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子/生長因子受體α1/神經(jīng)細胞黏附分子、SCF/c-kit、5-羥色胺、cAMP依賴性蛋白激酶和促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酶C-γ1/PLC-γ2等典型的治療STC信號通路不大相同[30-34],說明了黃芪治療STC是以多靶點、多通路的形式來發(fā)揮作用的,也恰恰體現(xiàn)了黃芪多功效治療STC的特點。

黃芪有效成分與STC疾病靶點分子對接結(jié)果顯示山柰酚、葉酸、槲皮素與JUN、VEGFA、AKT1、CASP3、IL-6核心靶點結(jié)合較好。相關(guān)研究顯示槲皮素可抑制腸炎小鼠血清中髓過氧化物酶、丙二醛和一氧化氮水平升高,減輕細胞氧化損傷,從而改善腸道微生物群失調(diào)[35]。湯利華等[36]研究發(fā)現(xiàn),山柰酚可通過抑制DN大鼠NLRP3炎性小體的激活,從而抑制炎癥介質(zhì)的表達。葉酸可增強機體免疫能力,因此可用于免疫功能低的便秘患者治療,但目前尚無公開發(fā)表的葉酸與STC相關(guān)的研究文獻。

黃芪可能通過抗炎、提高免疫力、保護腸黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群和神經(jīng)遞質(zhì),從而促進腸道運動等過程改善STC癥狀;通過調(diào)控對脂多糖的回應(yīng)、對細菌起源的分子的反應(yīng)、薄膜筏、膜微區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、核受體結(jié)合、類固醇激素受體活性、乙型肝炎、IL-17信號通路等信號通路發(fā)揮治療STC作用。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對接技術(shù),探討了黃芪活性成分、靶點、通路之間相互作用的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)黃芪能通過多靶點、多通路發(fā)揮治療STC的作用,證明了黃芪是通過多途徑發(fā)揮行氣健脾,通陽利水的功效,達到治療STC的目的,為黃芪用于治療STC的進一步實驗驗證及臨床研究提供了思路與理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明:無。