陸蘭菲,趙學(xué)平,馬 正,方 楠,駱玉琴,王曉梅,葉 會,雷 圓,王 強(qiáng),*,張昌朋,*

(1.中國計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所,浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為我國中醫(yī)藥記載的名貴藥食兩用藥材,素有“神仙草”之稱[1]。鐵皮石斛中富含多糖、多酚、氨基酸、黃酮等活性物質(zhì)[2],具有預(yù)防及治療癌癥[3],改善肝臟氧化應(yīng)激、炎癥和肝脂質(zhì)積累等作用[4]。最新研究表明,鐵皮石斛對慢性免疫性疾病具有潛在的治療作用[5],還可增強(qiáng)自身免疫及抗氧化等多種功能[6]。2008—2014年鐵皮石斛鮮莖產(chǎn)量由1 200 t增至14 800 t,呈現(xiàn)逐年增加的態(tài)勢[7]。因其生長條件不喜陽不耐干燥,鐵皮石斛黑斑病、蛞蝓等病蟲害發(fā)生較嚴(yán)重。經(jīng)查詢,目前在鐵皮石斛上登記的農(nóng)藥產(chǎn)品僅23個(gè)(殺蟲劑8個(gè));在鐵皮石斛生產(chǎn)過程中,存在著超范圍使用農(nóng)藥的情況。Zhang等[8]研究了24種農(nóng)藥在鐵皮石斛中殘留,83.33%的樣品檢出農(nóng)藥殘留,農(nóng)藥殘留是影響鐵皮石斛質(zhì)量安全的重要因素。

蕓苔素內(nèi)酯(圖1-A)是一類具有顯著促進(jìn)作物生長的新型植物激素,被認(rèn)為是具有多效作用的植物生長調(diào)節(jié)劑[9-10]。蕓苔素內(nèi)酯可有效誘導(dǎo)番茄果實(shí)成熟,增加番茄中可溶性糖、番茄紅素含量、抗壞血酸、呼吸速率和乙烯生成,這說明蕓苔素內(nèi)酯在調(diào)節(jié)果實(shí)成熟的同時(shí)也參與了番茄果實(shí)品質(zhì)性狀的形成[11];通過葉面噴施蕓苔素內(nèi)酯固醇類似物(Biobras-16)對菠蘿果實(shí)生長具有積極的作用[12]。這類化合物不含離子基團(tuán)故很難離子化;不含共軛結(jié)構(gòu)以及光電響應(yīng)基團(tuán)導(dǎo)致常規(guī)紫外檢測器、熒光檢測器無法檢測其含量;沸點(diǎn)高,不易氣化。目前檢測方法有高效液相紫外檢測技術(shù)[13]、高效液相色譜熒光檢測器檢測技術(shù),因其結(jié)構(gòu)的特性,這些方法繁雜且需衍生化。蕓苔素內(nèi)酯種類眾多,2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯(圖1-B)因生物活性和人工合成效率高等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用在各種農(nóng)作物中。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯相關(guān)農(nóng)藥殘留研究少及進(jìn)展不足,但在前期調(diào)查表明,盡管尚未登記,但鐵皮石斛生產(chǎn)中已使用2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯。因此進(jìn)一步研究2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛中殘留,為其在鐵皮石斛上合理使用和提升鐵皮石斛質(zhì)量安全提供數(shù)據(jù)支撐。

圖1 蕓苔素內(nèi)酯(A)和2,4-表蕓苔素內(nèi)酯(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of brassinolide (A) and 2, 4-epibrassinolide (B)

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯原藥[13-14](純度93%,CAS:78821-43-9)購自浙江世佳科技股份有限公司;2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;甲醇、乙腈 (HPLC級,Merck公司);甲酸 (HPLC級,美國ACS公司);甲酸銨(HPLC級,德國Honeywell公司);丙酮、正己烷(AR級)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;試驗(yàn)用水為屈臣氏瓶裝礦泉水;萃取鹽包(含1.5 g NaCl和6 g MgSO4,分析純)購自杭州易鎂創(chuàng)科技有限公司;Cleanert Pesti carb/NH2固相萃取小柱(500 mg,6 mL)購自上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;陶瓷均質(zhì)子購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;0.22 μm一次性針式過濾器有機(jī)尼龍針頭濾膜購自天津博納艾爾杰科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

G 6470型高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);SK-7200 H型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);NMSG-12型渦旋振蕩器(泰州米諾醫(yī)療科技有限公司);6430 R型高速冷凍離心機(jī)(Pendorf 公司);BSA2202S型萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 樣品制備

選2年生鐵皮石斛組培苗為供試材料,種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地大棚內(nèi)。在大棚中煉苗一個(gè)月后進(jìn)行噴霧處理[15]。噴霧時(shí)添加助劑:1%乙醇與3%吐溫80[16]。試驗(yàn)共設(shè)3組:T1組,2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯濃度為0.02 mg·L-1;T2組,2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯濃度為0.05 mg·L-1;T3組,對照組。采用葉面噴施方式共施藥兩次,施藥間隔為30 d,在第二次施藥后采集0、1、7、14、28和35 d的鐵皮石斛樣品(莖、葉),留樣500 g,保存在-20 ℃冰箱待測。

1.4 樣品前處理

提取:分別精準(zhǔn)稱取10.00 g(精準(zhǔn)至0.01 g)鐵皮石斛葉和莖樣品于50 mL離心管中,加入5 mL水充分浸潤樣品后再加入15 mL乙腈,超聲提取15 min,然后加入1.50 g NaCl和6.00 g MgSO4,在每個(gè)離心管中放置一只陶瓷均質(zhì)子,渦旋振蕩2 min后以8 000 r·min-1離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶,在40 ℃水浴下旋蒸近干,然后用2 mL丙酮∶正己烷=6∶4(體積比)的混合液復(fù)溶,待凈化。

凈化:Cleanert Pesti carb/NH2小柱用10 mL混合液活化,將2 mL上述復(fù)溶液上樣,再用25 mL混合液淋洗小柱,收集所有濾液,40 ℃水浴旋蒸近干,再用2 mL乙腈復(fù)溶,超聲1 min,過0.22 μm有機(jī)濾膜,待上機(jī)測定。

1.5 儀器條件

液相色譜條件:色譜柱為Waters C18柱 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動相為甲醇(A)、含0.1%甲酸和2 mmol·L-1的甲酸銨水溶液(B),柱溫40 ℃,流速為0.4 mL·min-1,進(jìn)樣體積20 μL。梯度洗脫為:0～0.5 min,10% A;0.5～2.5 min,10%～92% A;2.5～4 min 92% A;4～4.01 min,92%～10% A;5.5 min,10% A。

質(zhì)譜條件:采用ESI+模式,MRM多反應(yīng)監(jiān)測,干燥器溫度300 ℃,干燥器流量為5 L·min-1,霧化器壓力為45 psi,鞘氣溫度為350 ℃,鞘氣流量為11 L·min-1,毛細(xì)管電壓為4 000 V。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)譜條件Table 1 The mass spectrometric parameters of 2, 4-epibrassinolide

1.6 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品0.011 1 g于100 mL容量瓶中,用乙腈定容,配制成100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃下保存。用空白基質(zhì) (莖、葉)提取液逐級稀釋成0.000 5、0.002 5、0.025、0.05、0.1、0.25 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。按1.5節(jié)中儀器條件測定,重復(fù)3次,以2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),對應(yīng)濃度的峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用外標(biāo)定量法。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有明顯的基質(zhì)效應(yīng),故選擇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度的計(jì)算[17]。

1.7 添加回收試驗(yàn)

在空白鐵皮石斛莖和葉中分別添加0.005、0.05、0.5 mg·kg-1的2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯,同時(shí)設(shè)置空白對照,每個(gè)處理重復(fù)3次,混勻后靜置30 min,樣品前處理及儀器測定分別按1.4節(jié)與1.5節(jié)進(jìn)行,并計(jì)算平均回收率(average recovery,%)以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD,%)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

基質(zhì)效應(yīng)[18]由公式(1)計(jì)算所得:

(1)

其中VME為基質(zhì)效應(yīng),A為繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線所得斜率,B為繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得斜率。 當(dāng)VME值為正時(shí),基質(zhì)呈增強(qiáng)作用;VME值為負(fù)時(shí)為抑制作用,絕對值越大則相應(yīng)作用愈明顯。

農(nóng)藥降解動態(tài)方程和半衰期[19](T1/2)由公式(2)和公式(3)計(jì)算所得:

Ct=C0e-kt;

(2)

(3)

其中Ct為t時(shí)刻農(nóng)藥濃度(mg·kg-1),C0為農(nóng)藥初始濃度即原始沉積量(mg·kg-1),k為2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛中降解速率常數(shù)。

采用Excel 2019和SPSS 26進(jìn)行殘留數(shù)據(jù)分析,Graph Pad Prism 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

比較了同等梯度下甲醇和乙腈作為有機(jī)溶劑時(shí),2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的峰型以及峰面積,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為溶劑時(shí)靈敏度更高且峰型更好,水相中加入2 mmol·L-1甲酸銨能使2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯更容易離子化,響應(yīng)值更佳。對比色譜柱T3與C18的響應(yīng)值發(fā)現(xiàn)C18柱無論是響應(yīng)值還是峰形均比T3色譜柱好。所以最終選取甲醇-0.1%甲酸水(內(nèi)含2 mmol·L-1甲酸銨)和C18為最佳流動相和色譜柱。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選用正離子ESI+模式對2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,先進(jìn)行質(zhì)譜全掃描從而確定母離子,通過離子掃描以優(yōu)化錐孔電壓,最后在子離子掃描模式通過優(yōu)化碰撞電壓。優(yōu)化后的2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)譜條件及離子色譜圖見表1和圖2。

圖2 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯(0.1 mg·L-1)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatogram of 2, 4-epibrassinolide (0.1 mg·L-1) matrix standard solution

2.3 前處理的優(yōu)化

2.3.1 提取方式的選擇

對比超聲、渦旋、超聲與渦旋聯(lián)用3種方式進(jìn)行提取條件優(yōu)化,以回收率為指標(biāo),3種提取方式回收率結(jié)果:81.67%、67.63%、90.50%,如圖3-A。超聲有助于提高2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在乙腈中的溶解,渦旋有效提取目標(biāo)化合物,二者聯(lián)用提升2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯提取率。

圖3 不同條件對回收率的影響Fig.3 The effect of different conditions on the recovery rate

2.3.2 提取溶劑選擇

實(shí)驗(yàn)選擇乙腈[20-21]、丙酮、甲醇這3種提取溶劑進(jìn)行對比優(yōu)化,以提取效率為指標(biāo)對3種不同試劑進(jìn)行對比,提取率分別為84.98%、95.18%、77.46%,如圖3-B所示。丙酮能將樣品中的脂類、大量色素等物質(zhì)提取出來,經(jīng)SPE小柱凈化后提取液顏色呈黃綠色,且色譜圖基線雜質(zhì)干擾較大。鮮樣水分較干樣多,用乙腈提取后鹽析效果比丙酮佳,且色譜圖基線穩(wěn)雜質(zhì)干擾較小,因此選擇乙腈作為提取溶劑。為了讓樣品充分浸潤,提高提取率,添加乙腈前加入5 mL水。

2.3.3 提取溶劑體積的優(yōu)化

比較了10 mL、15 mL、20 mL乙腈對2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯回收率的影響,結(jié)果如圖3-C所示。加入10 mL乙腈時(shí),回收率小于70.00%;加入15 mL乙腈時(shí),回收率為95.18%;加入20 mL乙腈時(shí),回收率為88.10%。因此,提取溶劑乙腈的體積選取15 mL。

2.3.4 凈化材料的選擇

考察Oasis HLB (500 mg,6 mL)、Cleanert NH2(500 mg,6 mL)、Cleanert Pesti Carb/NH2(500 mg,6 mL)、 Cleanert PEP-2(500 mg,6 mL)、 Cleanert TPH (2 g,12 mL)和Cleanert NANO(1 mL)碳納米凈化萃取小柱等6種凈化材料對2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯回收率的影響,結(jié)果如圖3-D所示。選用Cleanert Pesti Carb/NH2固相萃取小柱時(shí),回收率達(dá)到91.52%,RSDs在5.1%～7.9%,且雜質(zhì)凈化效果佳。因此,選擇Cleanert Pesti Carb/NH2對樣品進(jìn)行凈化。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)工作方程、線性范圍和基質(zhì)效應(yīng)

在0.000 5～0.25 mg·L-1范圍內(nèi),2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖、葉中的線性方程分別為:y=421 887x+391.91和y=441 297x+5 053.1,兩種基質(zhì)條件下相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,峰面積和質(zhì)量濃度之間線性關(guān)系良好。基質(zhì)效應(yīng)在-31%～-53%,有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。定量限(LOQs)和檢出限(LODs)分別為0.005 mg·kg-1和0.000 5 mg·L-1,該方法靈敏度高。

2.4.2 平均回收率及精密度

在鐵皮石斛的莖、葉中分別添加2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行3個(gè)水平上的添加回收試驗(yàn),每一個(gè)添加水平重復(fù)6次,添加回收率以及RSD結(jié)果見表2所示。結(jié)果表明,2,4-表蕓苔素內(nèi)酯平均回收率在94.70%～102.25%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.3%～3.4%,方法的準(zhǔn)確度及精密度均滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NY/T 788—2018)的殘留分析要求。

表2 鐵皮石斛中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯的回收率和精密度Table 2 Average recovery and precision of 2, 4-epibrassinolide in Dendrobium officinale

2.5 實(shí)際樣品中的應(yīng)用

利用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)獲得鐵皮石斛樣品。在40盆鐵皮石斛上噴施2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯(內(nèi)含1%乙醇與3%吐溫80)。根據(jù)不同劑量分別為T1組0.02 mg·L-1;T2組0.05 mg·L-1;進(jìn)行葉面噴施兩次,間隔一個(gè)月后,根據(jù) 0、1、7、14、28和35 d的鐵皮石斛(莖、葉)樣品進(jìn)行采集,待測鐵皮石斛樣品置-20 ℃冰箱保存。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯將本文建立的方法應(yīng)用于實(shí)際鐵皮石斛樣品中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的測定。經(jīng)HPLC-MS/MS測定數(shù)據(jù)與Excel數(shù)據(jù)分析得出2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛(莖、葉)中的殘留動態(tài)(表3)符合一級動力學(xué)方程,結(jié)果見表3。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛(莖、葉)中殘留量隨時(shí)間推遲而降低。如圖4-A、B,T1組鐵皮石斛葉中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯14 d的降解率為85.59%;莖中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在14 d的降解率為75.06%。T2組鐵皮石斛葉中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在35 d的降解率為87.33%;莖中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在35 d的降解率為71.34%。2,4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖中的半衰期為10.35～22.36 d,在葉中的半衰期為8.89～11.00 d。2,4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖中的消解半衰期(22.36 d)大于葉中的消解半衰期(11.00 d)[22]。結(jié)果表明,該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均滿足鐵皮石斛實(shí)際樣品中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的分析要求。

表3 不同濃度2,4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛中的殘留、線性方程、相關(guān)系數(shù)和半衰期Table 3 Residues, linear equations, correlation coefficients and half-lives of different concentrations of 2,4-epibrassinolide in Dendrobium officinale

圖4 不同濃度2,4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛(莖和葉)中的殘留動態(tài)Fig.4 Residue dynamics of 2, 4-epibrassinolide at different concentrations in Dendrobium officinale (stem and leaf)

3 結(jié)論

本文建立了基于固相萃取結(jié)合HPLC-MS/MS檢測鐵皮石斛莖、葉中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯殘留分析方法,其定量限和檢出限分別為0.005 mg·kg-1和0.000 5 mg·L-1。在0.005、0.05和0.5 mg·kg-1添加水平下,2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛中的平均回收率在94.70%～102.25%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～3.4%。該方法操作簡便、凈化干凈,且回收率、精密度、重現(xiàn)性等指標(biāo)均滿足農(nóng)藥殘留檢測要求。利用該方法檢測了鐵皮石斛實(shí)際樣品,結(jié)果顯示,T1組鐵皮石斛葉中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯14 d 的降解率(85.59%)大于莖(75.06%);T2組鐵皮石斛莖、葉中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯35 d的降解率分別為71.34%和87.33%。和T1組(0.02 mg·L-1)相比,T2組(0.05 mg·L-1)2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖葉中的降解更慢。2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯在鐵皮石斛莖和葉中的半衰期分別為10.35～22.36 d和8.89～11.00 d。本研究為鐵皮石斛中2, 4-表蕓苔素內(nèi)酯的殘留檢測提供了可靠的分析方法。