孫曉紅 李欣欣 王彥博 陳奕州 張玉剛

摘要：MKK9是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族重要成員之一，是在植物細(xì)胞響應(yīng)外界脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的酶。為深入研究蘋果MKK9的相關(guān)功能，以紅肉蘋果‘黛紅為材料，克隆到MdMKK9基因CDS序列，利用酵母雙雜交試驗(yàn)篩選蘋果cDNA文庫，并通過酵母雙雜交篩選、體內(nèi)雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和體外Pull-down試驗(yàn)進(jìn)行MdMKK9互作蛋白驗(yàn)證。結(jié)果表明，通過對蘋果cDNA文庫的篩選，共獲得11個(gè)參與調(diào)控植物生長發(fā)育及應(yīng)答逆境脅迫的候選互作蛋白；選取花青苷合成相關(guān)蛋白MdCHS及氮脅迫調(diào)控相關(guān)蛋白MdSPX3進(jìn)行酵母雙雜交、體內(nèi)BiFC及體外Pull-down試驗(yàn)，結(jié)果證明MdMKK9可與MdSPX3互作。

關(guān)鍵詞：紅肉蘋果，MdMKK9，酵母雙雜交；雙分子熒光互補(bǔ)；互作蛋白

中圖分類號：S661.I：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0020-10

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protem kmase，MAPK）級聯(lián)信號系統(tǒng)是廣泛存在于真核生物的信號傳遞系統(tǒng)，尤其在植物響應(yīng)外界環(huán)境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。MAPK模塊包括3種激酶，分別為MKKK、MKK和MAPK，其中MAPKKs成員數(shù)量最少（擬南芥10個(gè)，番茄5個(gè)，黃瓜6個(gè)），可分為A、B、C、D4個(gè)亞族，另外，部分植物中也發(fā)現(xiàn)了MAP-KKKKs的存在。當(dāng)植物受到輻射、病原體、干旱等外界信號刺激時(shí)，MKKK、MKK和MAPK會(huì)改變靜止?fàn)顟B(tài)，發(fā)生順序的磷酸化反應(yīng)，激活下游靶標(biāo)基因，從而對植物生長發(fā)育、基因表達(dá)和環(huán)境適應(yīng)等方面進(jìn)行調(diào)控。如擬南芥中4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫代葡萄糖苷的生物合成和積累，為其硫代葡萄糖苷響應(yīng)非生物脅迫提供了MAPK介導(dǎo)的信號通路：MKK9是MAPK級聯(lián)信號途徑MKKs中D亞族的重要成員，在擬南芥中響應(yīng)低氮、低磷脅迫從而調(diào)控花青苷的合成：棉花中GhMKK9與GhRaf19存在互作關(guān)系，參與棉花抗枯萎病的生物過程；擬南芥的MKK9-MPK6級聯(lián)系統(tǒng)通過調(diào)控RCA、Ftsz2-2，TOR2和PRPSJ的磷酸化在響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮作用，輕度鹽滲透脅迫能夠激活MKK9 -MAPK3/6級聯(lián)信號系統(tǒng)；MKK9作為鹽處理擬南芥愈傷組織積累H2O2的正因子，與MAPK3/6形成信號通路增強(qiáng)細(xì)胞的呼吸作用；MKK9 -MAPK3/6級聯(lián)反應(yīng)能夠促進(jìn)擬南芥幼苗對磷的吸收；RAF22-MKK7/MKK9-MPK3/MPK6形成一個(gè)完整的級聯(lián)過程，通過參與蔗糖分解代謝來調(diào)控?cái)M南芥的生長；磷脂酸（phosphatidic acid，PA）能夠同時(shí)結(jié)合MPK6和MKK9，增強(qiáng)MKK9對MPK6的磷酸化活性；MKK9的組成型和誘導(dǎo)型過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥葉片過早衰老，敲除MKK9后葉片則延遲衰老；擬南芥MKK9通過調(diào)節(jié)花青素積累和氮狀態(tài)來調(diào)節(jié)植物對低氮脅迫的適應(yīng)。但蘋果中MdMKK9生物學(xué)功能研究尚少，MdMKK9互作蛋白的研究未見報(bào)道。本研究通過對紅肉蘋果cDNA文庫的篩選得到MdMKK9互作蛋白，選取與花青苷合成和氮調(diào)控相關(guān)蛋白，利用酵母雙雜交、體內(nèi)雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和體外Pull-down試驗(yàn)進(jìn)行互作蛋白驗(yàn)證，以期為今后預(yù)測MdMKK9在花青苷積累和氮脅迫響應(yīng)方面的功能提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試劑、儀器

供試材料為紅肉蘋果‘黛紅，種植于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)膠州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園。

大腸桿菌（E.coli）DH5a感受態(tài)、大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)、酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y2H Gold感受態(tài)，購于上海唯地生物技術(shù)有限公司；pGADT7文庫質(zhì)粒及pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-53（對照載體）、pGADT7-T、pGBKT7-Lam、pCAMBIA1300-nLUC、pCAMBIA1300-cLUC、pET-32a、pGEX-4T-l載體均為實(shí)驗(yàn)室保存。

SD缺陷培養(yǎng)基、YPDA培養(yǎng)基、X-a-gal、AbA購于TaKaRa。

PCR儀（TaKaRa TP-600）、植物活體熒光儀、電泳儀（Bio-Rad PowerPac-3000）、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱及搖床等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1pGBKT7-MdMKK9誘餌表達(dá)栽體構(gòu)建把本實(shí)驗(yàn)室前期擴(kuò)增得到的MdMKK9基因的CDS區(qū)域（GenBank登錄號為ON427820）重組到pGBKT7載體的EcoRI和BamHI之間，構(gòu)建誘餌表達(dá)載體，命名為pGBKT7-MdMKK9。

1.2.2誘餌質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率和毒性檢測及AbA（金擔(dān)子素）濃度篩選 參照YestmakerYeast Transformation System 2 User Manual中菌落數(shù)要求，根據(jù)公式計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。通過比對pGBKT7空載和pGBKT7-MdMKK9在SD-Trp板上酵母菌落生長狀況檢測誘餌質(zhì)粒毒性。通過對pGBKT7-MdMKK9自激活檢測篩選適宜的AbA濃度。

1.2.3酵母文庫雙雜交 按照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作說明進(jìn)行酵母文庫雙雜交。將轉(zhuǎn)化好的雜交菌液涂布于直徑150mm的SD-Trp-Leu/AbA培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)3-4 d。將SD-Trp-Leu/AbA培養(yǎng)基上有明顯生長優(yōu)勢的單克隆菌落，用滅菌槍頭劃線于SD-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-a-gal培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2-3 d，得到藍(lán)色菌斑。挑取藍(lán)色明顯單菌落，加入10uL ddH2O均勻稀釋進(jìn)行陽性克隆篩選，利用引物pGADT7-F/pGADT7-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將只擴(kuò)增出一條帶的菌液進(jìn)行測序，測序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫及蘋果基因組數(shù)據(jù)庫對可能互作的相關(guān)蛋白編碼基因進(jìn)行注釋分析。

1.2.4pGADT7-MdCHS、pGADT7-MdSPX3載體構(gòu)建 根據(jù)pGADT7載體圖譜及MdCHS、MdSPX3基因序列設(shè)計(jì)分別含Nde I和BamH I及EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的引物。將雙酶切的載體與基因產(chǎn)物16℃連接并過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，挑取Kan抗性板上的單克隆搖菌，菌液經(jīng)交叉引物PCR篩選后進(jìn)行測序。將構(gòu)建的載體分別命名為pGADT7-MdCHS和pGADT7-MdSPX3。

1.2.5酵母雙雜交驗(yàn)證MdMKK9與MdCHS、Md-SPX3互作情況 將Bait質(zhì)粒pGBKT7-MdMKK9與Prey質(zhì)粒pGADT7-MdCHS、pGADT7-MdSPX3共轉(zhuǎn)Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在SD-Trp-Leu培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5 d：分別設(shè)置陽性（pGBKT7-53+pGADT7-T）與陰性（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）對照，分別挑取對照組與試驗(yàn)組培養(yǎng)基上的單菌落，用滅菌ddH2O稀釋10倍，取8uL點(diǎn)于SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上，觀察菌落顏色變化。

1.2.6BiFC栽體構(gòu)建及體內(nèi)蛋白互作驗(yàn)證 將無MdMKK9終止密碼子的ORF區(qū)域克隆到pCAMBIA1300-nLUC載體中，并將MdSPX3克隆到pCAMBIA1300-cLUC載體上，將兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，送公司測序成功后，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101。菌液于28℃搖至OD600為0.5-0.8，離心后用重懸液重懸，將nLUC-Md-MKK9+cLUC-MdSPX3作為試驗(yàn)組、nLUC-Md-MKK9+eLUC作為對照組，注射本生煙，培養(yǎng)2-3d，使用活體熒光儀檢測LUC表達(dá)情況。

1.2.7Pull-down載體構(gòu)建及體外蛋白互作驗(yàn)證

（1）原核表達(dá)載體構(gòu)建及重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：將MdMKK9克隆到pGEX-4T-1載體、MdSPX3克隆到pET-32a載體上，構(gòu)建pGEX-4T-l-GST-MdMKK9（GST-MdMKK9）和pET-32a-HIS-Md-SPX3（HIS-MdSPX3）載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)人大腸桿菌BL21，測序成功后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DE3大腸桿菌。

菌液在37℃培養(yǎng)至OD。00為0.5～0.8時(shí)，加入200 mmol/L IPTG（異丙基-B-D-硫代半乳糖苷）進(jìn)行誘導(dǎo)，30℃繼續(xù)搖菌6h。分別于搖菌2、4、6h各取1 mL菌液作為陽性對照，取誘導(dǎo)前菌液1mL作為陰性對照（O h）。在離心管中加入0.2mol/L PMSF（苯甲基磺酰氟）80 uL，用超聲波破碎菌液。超聲波破碎條件：工作時(shí)間5s，間歇10s，功率35%，60-70 min，4℃。破碎后的菌液于4℃、5 000 r/min離心15 min，分離上清和沉淀，用PBS緩沖液（pH=7.4）重懸沉淀，用SDS -PAGE對上清和沉淀分別進(jìn)行檢測。

（2）重組蛋白純化：分別對誘導(dǎo)的pGEX-4T-1-GST-MdMKK9（GST-MdMKK9）/pET-32a-HIS-MdSPX3（HIS-MdSPX3）蛋白使用Pierce試劑盒純化，過柱子后洗脫蛋白。加上GST/HIS標(biāo)簽的純化蛋白用于SDS-PAGE檢測。

（3）Pull-down驗(yàn)證互作：Pull-down試驗(yàn)步驟同上，將誘導(dǎo)的HIS-MdSPX3融合蛋白與GST-MdMKK9融合蛋白按照1：1比例混合，過帶有HIS活化柱料的蛋白過濾柱，洗脫蛋白用于West-ern blot檢測。

SDS-PAGE跑膠后轉(zhuǎn)PVDF膜，將轉(zhuǎn)后的PVDF膜分別放入封閉液封閉2-3 h、放人含GST抗體的一抗抗體反應(yīng)液孵育過夜及放入二抗抗體反應(yīng)液孵育2-3 h，最后加入超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色液進(jìn)行蛋白顯影。

1.2.8本研究所用引物名稱及序列 研究中進(jìn)行克隆基因、構(gòu)建載體等工作所需的引物及其序列見表1。

2結(jié)果與分析

2.1pGBKT7-MdMKK9載體構(gòu)建及誘餌質(zhì)粒細(xì)胞毒性檢測

將紅肉蘋果‘黛紅的MdMKK9基因產(chǎn)物連接到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中，得到pGBKT7-MdMKK9重組質(zhì)粒。將pGBKT7和pG-BKT7-MdMKK9轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，鑒定結(jié)果證明pGBKT7-MdMKK9成功轉(zhuǎn)化（圖1A）。

參照YeastmakerTM Yeast Transformation Sys-tem 2 User Manual中菌落數(shù)要求，選擇菌落數(shù)在30-300個(gè)范圍的SD-Trp平板來計(jì)算誘餌質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率，根據(jù)轉(zhuǎn)化效率計(jì)算公式得到最終轉(zhuǎn)化效率為6x10個(gè)轉(zhuǎn)化子。通過比對pGBKT7空載和pGBKT7-MdMKK9在SD-Trp板上酵母菌落生長狀況證實(shí)pGBKT7-MdMKK9并無毒性（圖1B）。

2.2誘餌質(zhì)粒細(xì)胞自激活檢測及AbA抗性濃度篩選

通過對pGBKT7-MdMKK9自激活檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化pGBKT7-MdMKK9誘餌質(zhì)粒的Y2H Gold酵母細(xì)胞能夠在SD-Trp-Leu/AbA（200 ng/uL）上正常生長（圖2A），證明誘餌質(zhì)粒具有自激活能力。通過pGBKT7-MdMKK9質(zhì)粒在不同濃度AbA上的生長篩選結(jié)果顯示，pGBKT7-MdMKK9在300 ng/uL和400 ng/uL AbA上均沒有酵母單菌落生長（圖2B），所以后續(xù)試驗(yàn)選擇300 ng/uLAbA進(jìn)行文庫篩選。

制作pGBKT7-MdMKK9酵母感受態(tài)，共轉(zhuǎn)文庫質(zhì)粒，涂布在SD-Trp-Leu/AbA培養(yǎng)基上。2-3d后選取生長明顯的單菌落（圖2C）作為陽性克隆，劃線于SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上，融合蛋白表達(dá)激活半乳糖苷酶活性，使得酵母菌落在含有X-a-gal的培養(yǎng)基上顯藍(lán)色（圖2D）。

2.3互作蛋白的功能注釋

將SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上篩選的藍(lán)色菌斑進(jìn)行PCR分析，選取單片段插入菌斑進(jìn)行測序，獲得11條讀碼框完整的cDNA序列，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲取每條序列登錄號、蛋白名稱及功能（表2），并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇花青苷合成相關(guān)蛋白CHS及氮素調(diào)控相關(guān)蛋白SPX3進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證。

2.4互作蛋白驗(yàn)證

2.4.1酵母雙雜交驗(yàn)證MdMKK9與MdCHS和MdSPX3的互作 以‘黛紅組織cDNA為模板克隆得到MdCHS和MdSPX3。構(gòu)建pGBKT7-Md-MKK9、pGADT7-MdCHS及pGADT7-MdSPX3載體（圖3）。將pGBKT7-MdMKK9+pGADT7-MdCHS（標(biāo)注為MdMKK9+MdCHS）、pGBKT7-MdMKK9+pGADT7-MdSPX3（標(biāo)注為MdMKK9+MdSPX3）分別共轉(zhuǎn)Y2H Gold酵母感受態(tài)，涂于SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA及SD-Trp-Leu-His/AbA培養(yǎng)基上。分別以pGBKT7-Md-MKK9+pGADT7（標(biāo)注為MdMKK9+AD）、pGBK17+pGADT7-MdCHS（標(biāo)注為MdCHS+BD）、pGBKT7+pGADT7-MdSPX3（標(biāo)注為MdSPX3+BD）作為陰性對照，pGBKT7-53（標(biāo)注為53對照）作為陽性對照。

由圖4A發(fā)現(xiàn)，在SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上，MdMKK9+MdSPX3共轉(zhuǎn)菌斑生長并變藍(lán)，而MdMKK9+MdCHS共轉(zhuǎn)菌斑未生長未變藍(lán)，三組對照（MdMKK9+AD，MdCHS+BD，MdSPX3+BD）菌斑均未生長未變藍(lán)。圖4B結(jié)果顯示，在SD-Trp-Leu-His/AbA培養(yǎng)基上，MdMKK9+MdSPX3共轉(zhuǎn)菌斑長勢與53對照相似，長勢良好，MdMKK9+MdCHS共轉(zhuǎn)菌斑及陰性對照均未生長。因此，初步判斷MdMKK9與MdSPX3互作，與MdCHS不互作或互作較弱。

2.4.2BiFC驗(yàn)證互作 為進(jìn)一步驗(yàn)證MdMKK9與MdSPX3互作，構(gòu)建了pCAMBIA1300-nLUC-MdMKK9和pCAMBIA1300-cLUC-MdSPX3載體，進(jìn)行本生煙注射，觀察LUC表達(dá)情況得知，Md-MKK9與MdSPX3在體內(nèi)互作（圖5）。

2.4.3Pull-down驗(yàn)證互作 （1）為了進(jìn)一步驗(yàn)證MdMKK9與MdSPX3互作，構(gòu)建pET-32a-HIS-MdSPX3、pGEX-4T-l-GST-MdMKK9原核蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，測序成功后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DE3大腸桿菌（圖6A、B）。利用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，從變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中可以發(fā)現(xiàn)，30℃誘導(dǎo)6h后MdSPX3（48.6 kD）和MdMKK9（63.1 kD）蛋白條帶比誘導(dǎo)前（0h）明顯變粗（圖6C、D），說明這兩個(gè)蛋白已經(jīng)被成功誘導(dǎo)。

（2）誘導(dǎo)蛋白經(jīng)親和層析方法純化后，通過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，在48.6、63.1 kD處有明顯的目的條帶（圖7A）。利用純化后的蛋白進(jìn)行Pull-down蛋白下拉試驗(yàn)及Westem blot蛋白印跡試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證MdSPX3與MdMKK9的互作關(guān)系，結(jié)果（圖7B）顯示，MdMKK9-GST可以通過與MdSPX3-HIS結(jié)合被下拉，證明MdMKK9與Md-SPX3可以在體外相互結(jié)合，即MdMKK9與Md—SPX3蛋白互作。

3討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)之間互作是蛋白質(zhì)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要方式。在細(xì)胞接收內(nèi)源和外源信號、通過信號途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)、保持物種生物學(xué)特性過程中，蛋白質(zhì)都占有重要地位，且大部分蛋白質(zhì)是通過與伴侶分子或其他蛋白質(zhì)復(fù)合物一起發(fā)揮作用，因此蛋白質(zhì)互作研究具有十分重要的生物學(xué)意義。

研究蛋白互作的工具和手段有多種，酵母雙雜交可為蛋白提供接近活細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境的狀態(tài)，能夠直接鑒定蛋白互作情況，在篩選和鑒定MAPK級聯(lián)途徑研究中起著重要作用。雙分子熒光互補(bǔ)與亞細(xì)胞定位原理相似，屬植物體內(nèi)試驗(yàn)，常用試驗(yàn)植物為煙草（Nicotuma tabacumL.）；BiFC利用熒光蛋白作為報(bào)告基因，將熒光蛋白分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段N端和C端，再分別與目標(biāo)蛋白連接。體外PuU-down試驗(yàn)是在蛋白提取并純化的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。本試驗(yàn)用MdMKK9作為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交技術(shù)從蘋果cDNA文庫中篩選出MdMKK9逆境相關(guān)互作蛋白11個(gè)，挑選與花青苷合成相關(guān)的MdCHS及參與氮素調(diào)控途徑的MdSPX3進(jìn)行互作驗(yàn)證，經(jīng)酵母點(diǎn)對點(diǎn)初步驗(yàn)證了MdMKK9與MdSPX3互作，而與MdCHS不互作或者互作信號弱：構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)載體pCAMBIA1300 -nLUC-MdMKK9、pCAMBIA1300-cLUC-MdMKK9、pCAMBLA1300-cLUC-MdSPX3，對MdMKK9與MdSPX3的互作關(guān)系加以驗(yàn)證，在熒光顯微鏡下觀察到MdMKK9與MdSPX3互作：體外Pull-down下拉試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了MdMKK9與Md-SPX3互作。

SPX蛋白家族普遍存在于維管植物，在植物磷脅迫反應(yīng)、缺鐵反應(yīng)、抗病性、低氧反應(yīng)和光敏色素介導(dǎo)的光信號傳導(dǎo)等代謝過程中起著重要作用。如小麥TaSPX基因在磷酸鹽（Pi）饑餓條件下被顯著誘導(dǎo)，TaSPX積極響應(yīng)小麥根部低Pi脅迫過程；ZmSPX3與ZmPHR1互作，參與了玉米對低Pi的應(yīng)激反應(yīng)；GmSPX3參與大豆的磷酸鹽穩(wěn)態(tài)；SPX結(jié)構(gòu)域與PP-InsP具有強(qiáng)親和力，可調(diào)節(jié)植物Pi平衡，維持在減少磷肥投入的情況下獲得高產(chǎn)；杜紅園研究了甘藍(lán)型油菜SPX3基因響應(yīng)低磷脅迫的工作模式。另據(jù)報(bào)道，硝酸鹽誘導(dǎo)的NIGTl-SPX-PHR級聯(lián)信號途徑亦介導(dǎo)了氮饑餓信號下的氮響應(yīng)調(diào)節(jié)。但是SPX3對MdMKK9在響應(yīng)低氮脅迫花青苷合成途徑中的功能尚待繼續(xù)研究。

綜上，本研究通過酵母雙雜交、BiFC、Pulldown等試驗(yàn)篩選并驗(yàn)證了紅肉蘋果MdMKK9的互作蛋白MdSPX3。