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        紅肉蘋(píng)果MdMKK9互作蛋白的篩選與鑒定

        2023-08-28 06:01:54孫曉紅李欣欣王彥博陳奕州張玉剛
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年2期

        孫曉紅 李欣欣 王彥博 陳奕州 張玉剛

        摘要:MKK9是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成員之一,是在植物細(xì)胞響應(yīng)外界脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的酶。為深入研究蘋(píng)果MKK9的相關(guān)功能,以紅肉蘋(píng)果‘黛紅為材料,克隆到MdMKK9基因CDS序列,利用酵母雙雜交試驗(yàn)篩選蘋(píng)果cDNA文庫(kù),并通過(guò)酵母雙雜交篩選、體內(nèi)雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)和體外Pull-down試驗(yàn)進(jìn)行MdMKK9互作蛋白驗(yàn)證。結(jié)果表明,通過(guò)對(duì)蘋(píng)果cDNA文庫(kù)的篩選,共獲得11個(gè)參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)答逆境脅迫的候選互作蛋白;選取花青苷合成相關(guān)蛋白MdCHS及氮脅迫調(diào)控相關(guān)蛋白MdSPX3進(jìn)行酵母雙雜交、體內(nèi)BiFC及體外Pull-down試驗(yàn),結(jié)果證明MdMKK9可與MdSPX3互作。

        關(guān)鍵詞:紅肉蘋(píng)果,MdMKK9,酵母雙雜交;雙分子熒光互補(bǔ);互作蛋白

        中圖分類號(hào):S661.I:Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2023)02-0020-10

        絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protem kmase,MAPK)級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)是廣泛存在于真核生物的信號(hào)傳遞系統(tǒng),尤其在植物響應(yīng)外界環(huán)境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MAPK模塊包括3種激酶,分別為MKKK、MKK和MAPK,其中MAPKKs成員數(shù)量最少(擬南芥10個(gè),番茄5個(gè),黃瓜6個(gè)),可分為A、B、C、D4個(gè)亞族,另外,部分植物中也發(fā)現(xiàn)了MAP-KKKKs的存在。當(dāng)植物受到輻射、病原體、干旱等外界信號(hào)刺激時(shí),MKKK、MKK和MAPK會(huì)改變靜止?fàn)顟B(tài),發(fā)生順序的磷酸化反應(yīng),激活下游靶標(biāo)基因,從而對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、基因表達(dá)和環(huán)境適應(yīng)等方面進(jìn)行調(diào)控。如擬南芥中4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫代葡萄糖苷的生物合成和積累,為其硫代葡萄糖苷響應(yīng)非生物脅迫提供了MAPK介導(dǎo)的信號(hào)通路:MKK9是MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑MKKs中D亞族的重要成員,在擬南芥中響應(yīng)低氮、低磷脅迫從而調(diào)控花青苷的合成:棉花中GhMKK9與GhRaf19存在互作關(guān)系,參與棉花抗枯萎病的生物過(guò)程;擬南芥的MKK9-MPK6級(jí)聯(lián)系統(tǒng)通過(guò)調(diào)控RCA、Ftsz2-2,TOR2和PRPSJ的磷酸化在響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮作用,輕度鹽滲透脅迫能夠激活MKK9 -MAPK3/6級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng);MKK9作為鹽處理擬南芥愈傷組織積累H2O2的正因子,與MAPK3/6形成信號(hào)通路增強(qiáng)細(xì)胞的呼吸作用;MKK9 -MAPK3/6級(jí)聯(lián)反應(yīng)能夠促進(jìn)擬南芥幼苗對(duì)磷的吸收;RAF22-MKK7/MKK9-MPK3/MPK6形成一個(gè)完整的級(jí)聯(lián)過(guò)程,通過(guò)參與蔗糖分解代謝來(lái)調(diào)控?cái)M南芥的生長(zhǎng);磷脂酸(phosphatidic acid,PA)能夠同時(shí)結(jié)合MPK6和MKK9,增強(qiáng)MKK9對(duì)MPK6的磷酸化活性;MKK9的組成型和誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)導(dǎo)致擬南芥葉片過(guò)早衰老,敲除MKK9后葉片則延遲衰老;擬南芥MKK9通過(guò)調(diào)節(jié)花青素積累和氮狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)低氮脅迫的適應(yīng)。但蘋(píng)果中MdMKK9生物學(xué)功能研究尚少,MdMKK9互作蛋白的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)紅肉蘋(píng)果cDNA文庫(kù)的篩選得到MdMKK9互作蛋白,選取與花青苷合成和氮調(diào)控相關(guān)蛋白,利用酵母雙雜交、體內(nèi)雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)和體外Pull-down試驗(yàn)進(jìn)行互作蛋白驗(yàn)證,以期為今后預(yù)測(cè)MdMKK9在花青苷積累和氮脅迫響應(yīng)方面的功能提供參考。

        1材料與方法

        1.1試驗(yàn)材料與試劑、儀器

        供試材料為紅肉蘋(píng)果‘黛紅,種植于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)膠州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園。

        大腸桿菌(E.coli)DH5a感受態(tài)、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y2H Gold感受態(tài),購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司;pGADT7文庫(kù)質(zhì)粒及pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-53(對(duì)照載體)、pGADT7-T、pGBKT7-Lam、pCAMBIA1300-nLUC、pCAMBIA1300-cLUC、pET-32a、pGEX-4T-l載體均為實(shí)驗(yàn)室保存。

        SD缺陷培養(yǎng)基、YPDA培養(yǎng)基、X-a-gal、AbA購(gòu)于TaKaRa。

        PCR儀(TaKaRa TP-600)、植物活體熒光儀、電泳儀(Bio-Rad PowerPac-3000)、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱及搖床等。

        1.2試驗(yàn)方法

        1.2.1pGBKT7-MdMKK9誘餌表達(dá)栽體構(gòu)建把本實(shí)驗(yàn)室前期擴(kuò)增得到的MdMKK9基因的CDS區(qū)域(GenBank登錄號(hào)為ON427820)重組到pGBKT7載體的EcoRI和BamHI之間,構(gòu)建誘餌表達(dá)載體,命名為pGBKT7-MdMKK9。

        1.2.2誘餌質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率和毒性檢測(cè)及AbA(金擔(dān)子素)濃度篩選 參照YestmakerYeast Transformation System 2 User Manual中菌落數(shù)要求,根據(jù)公式計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。通過(guò)比對(duì)pGBKT7空載和pGBKT7-MdMKK9在SD-Trp板上酵母菌落生長(zhǎng)狀況檢測(cè)誘餌質(zhì)粒毒性。通過(guò)對(duì)pGBKT7-MdMKK9自激活檢測(cè)篩選適宜的AbA濃度。

        1.2.3酵母文庫(kù)雙雜交 按照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作說(shuō)明進(jìn)行酵母文庫(kù)雙雜交。將轉(zhuǎn)化好的雜交菌液涂布于直徑150mm的SD-Trp-Leu/AbA培養(yǎng)基平板上,30℃倒置培養(yǎng)3-4 d。將SD-Trp-Leu/AbA培養(yǎng)基上有明顯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的單克隆菌落,用滅菌槍頭劃線于SD-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-a-gal培養(yǎng)基上,30℃倒置培養(yǎng)2-3 d,得到藍(lán)色菌斑。挑取藍(lán)色明顯單菌落,加入10uL ddH2O均勻稀釋進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選,利用引物pGADT7-F/pGADT7-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將只擴(kuò)增出一條帶的菌液進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)及蘋(píng)果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)可能互作的相關(guān)蛋白編碼基因進(jìn)行注釋分析。

        1.2.4pGADT7-MdCHS、pGADT7-MdSPX3載體構(gòu)建 根據(jù)pGADT7載體圖譜及MdCHS、MdSPX3基因序列設(shè)計(jì)分別含Nde I和BamH I及EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的引物。將雙酶切的載體與基因產(chǎn)物16℃連接并過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài),挑取Kan抗性板上的單克隆搖菌,菌液經(jīng)交叉引物PCR篩選后進(jìn)行測(cè)序。將構(gòu)建的載體分別命名為pGADT7-MdCHS和pGADT7-MdSPX3。

        1.2.5酵母雙雜交驗(yàn)證MdMKK9與MdCHS、Md-SPX3互作情況 將Bait質(zhì)粒pGBKT7-MdMKK9與Prey質(zhì)粒pGADT7-MdCHS、pGADT7-MdSPX3共轉(zhuǎn)Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞,并涂布在SD-Trp-Leu培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)3-5 d:分別設(shè)置陽(yáng)性(pGBKT7-53+pGADT7-T)與陰性(pGBKT7-Lam+pGADT7-T)對(duì)照,分別挑取對(duì)照組與試驗(yàn)組培養(yǎng)基上的單菌落,用滅菌ddH2O稀釋10倍,取8uL點(diǎn)于SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上,觀察菌落顏色變化。

        1.2.6BiFC栽體構(gòu)建及體內(nèi)蛋白互作驗(yàn)證 將無(wú)MdMKK9終止密碼子的ORF區(qū)域克隆到pCAMBIA1300-nLUC載體中,并將MdSPX3克隆到pCAMBIA1300-cLUC載體上,將兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,送公司測(cè)序成功后,轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101。菌液于28℃搖至OD600為0.5-0.8,離心后用重懸液重懸,將nLUC-Md-MKK9+cLUC-MdSPX3作為試驗(yàn)組、nLUC-Md-MKK9+eLUC作為對(duì)照組,注射本生煙,培養(yǎng)2-3d,使用活體熒光儀檢測(cè)LUC表達(dá)情況。

        1.2.7Pull-down載體構(gòu)建及體外蛋白互作驗(yàn)證

        (1)原核表達(dá)載體構(gòu)建及重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá):將MdMKK9克隆到pGEX-4T-1載體、MdSPX3克隆到pET-32a載體上,構(gòu)建pGEX-4T-l-GST-MdMKK9(GST-MdMKK9)和pET-32a-HIS-Md-SPX3(HIS-MdSPX3)載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)人大腸桿菌BL21,測(cè)序成功后提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化DE3大腸桿菌。

        菌液在37℃培養(yǎng)至OD。00為0.5~0.8時(shí),加入200 mmol/L IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo),30℃繼續(xù)搖菌6h。分別于搖菌2、4、6h各取1 mL菌液作為陽(yáng)性對(duì)照,取誘導(dǎo)前菌液1mL作為陰性對(duì)照(O h)。在離心管中加入0.2mol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)80 uL,用超聲波破碎菌液。超聲波破碎條件:工作時(shí)間5s,間歇10s,功率35%,60-70 min,4℃。破碎后的菌液于4℃、5 000 r/min離心15 min,分離上清和沉淀,用PBS緩沖液(pH=7.4)重懸沉淀,用SDS -PAGE對(duì)上清和沉淀分別進(jìn)行檢測(cè)。

        (2)重組蛋白純化:分別對(duì)誘導(dǎo)的pGEX-4T-1-GST-MdMKK9(GST-MdMKK9)/pET-32a-HIS-MdSPX3(HIS-MdSPX3)蛋白使用Pierce試劑盒純化,過(guò)柱子后洗脫蛋白。加上GST/HIS標(biāo)簽的純化蛋白用于SDS-PAGE檢測(cè)。

        (3)Pull-down驗(yàn)證互作:Pull-down試驗(yàn)步驟同上,將誘導(dǎo)的HIS-MdSPX3融合蛋白與GST-MdMKK9融合蛋白按照1:1比例混合,過(guò)帶有HIS活化柱料的蛋白過(guò)濾柱,洗脫蛋白用于West-ern blot檢測(cè)。

        SDS-PAGE跑膠后轉(zhuǎn)PVDF膜,將轉(zhuǎn)后的PVDF膜分別放入封閉液封閉2-3 h、放人含GST抗體的一抗抗體反應(yīng)液孵育過(guò)夜及放入二抗抗體反應(yīng)液孵育2-3 h,最后加入超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色液進(jìn)行蛋白顯影。

        1.2.8本研究所用引物名稱及序列 研究中進(jìn)行克隆基因、構(gòu)建載體等工作所需的引物及其序列見(jiàn)表1。

        2結(jié)果與分析

        2.1pGBKT7-MdMKK9載體構(gòu)建及誘餌質(zhì)粒細(xì)胞毒性檢測(cè)

        將紅肉蘋(píng)果‘黛紅的MdMKK9基因產(chǎn)物連接到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中,得到pGBKT7-MdMKK9重組質(zhì)粒。將pGBKT7和pG-BKT7-MdMKK9轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,鑒定結(jié)果證明pGBKT7-MdMKK9成功轉(zhuǎn)化(圖1A)。

        參照YeastmakerTM Yeast Transformation Sys-tem 2 User Manual中菌落數(shù)要求,選擇菌落數(shù)在30-300個(gè)范圍的SD-Trp平板來(lái)計(jì)算誘餌質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率,根據(jù)轉(zhuǎn)化效率計(jì)算公式得到最終轉(zhuǎn)化效率為6x10個(gè)轉(zhuǎn)化子。通過(guò)比對(duì)pGBKT7空載和pGBKT7-MdMKK9在SD-Trp板上酵母菌落生長(zhǎng)狀況證實(shí)pGBKT7-MdMKK9并無(wú)毒性(圖1B)。

        2.2誘餌質(zhì)粒細(xì)胞自激活檢測(cè)及AbA抗性濃度篩選

        通過(guò)對(duì)pGBKT7-MdMKK9自激活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化pGBKT7-MdMKK9誘餌質(zhì)粒的Y2H Gold酵母細(xì)胞能夠在SD-Trp-Leu/AbA(200 ng/uL)上正常生長(zhǎng)(圖2A),證明誘餌質(zhì)粒具有自激活能力。通過(guò)pGBKT7-MdMKK9質(zhì)粒在不同濃度AbA上的生長(zhǎng)篩選結(jié)果顯示,pGBKT7-MdMKK9在300 ng/uL和400 ng/uL AbA上均沒(méi)有酵母單菌落生長(zhǎng)(圖2B),所以后續(xù)試驗(yàn)選擇300 ng/uLAbA進(jìn)行文庫(kù)篩選。

        制作pGBKT7-MdMKK9酵母感受態(tài),共轉(zhuǎn)文庫(kù)質(zhì)粒,涂布在SD-Trp-Leu/AbA培養(yǎng)基上。2-3d后選取生長(zhǎng)明顯的單菌落(圖2C)作為陽(yáng)性克隆,劃線于SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上,融合蛋白表達(dá)激活半乳糖苷酶活性,使得酵母菌落在含有X-a-gal的培養(yǎng)基上顯藍(lán)色(圖2D)。

        2.3互作蛋白的功能注釋

        將SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上篩選的藍(lán)色菌斑進(jìn)行PCR分析,選取單片段插入菌斑進(jìn)行測(cè)序,獲得11條讀碼框完整的cDNA序列,通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),獲取每條序列登錄號(hào)、蛋白名稱及功能(表2),并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇花青苷合成相關(guān)蛋白CHS及氮素調(diào)控相關(guān)蛋白SPX3進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證。

        2.4互作蛋白驗(yàn)證

        2.4.1酵母雙雜交驗(yàn)證MdMKK9與MdCHS和MdSPX3的互作 以‘黛紅組織cDNA為模板克隆得到MdCHS和MdSPX3。構(gòu)建pGBKT7-Md-MKK9、pGADT7-MdCHS及pGADT7-MdSPX3載體(圖3)。將pGBKT7-MdMKK9+pGADT7-MdCHS(標(biāo)注為MdMKK9+MdCHS)、pGBKT7-MdMKK9+pGADT7-MdSPX3(標(biāo)注為MdMKK9+MdSPX3)分別共轉(zhuǎn)Y2H Gold酵母感受態(tài),涂于SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA及SD-Trp-Leu-His/AbA培養(yǎng)基上。分別以pGBKT7-Md-MKK9+pGADT7(標(biāo)注為MdMKK9+AD)、pGBK17+pGADT7-MdCHS(標(biāo)注為MdCHS+BD)、pGBKT7+pGADT7-MdSPX3(標(biāo)注為MdSPX3+BD)作為陰性對(duì)照,pGBKT7-53(標(biāo)注為53對(duì)照)作為陽(yáng)性對(duì)照。

        由圖4A發(fā)現(xiàn),在SD-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上,MdMKK9+MdSPX3共轉(zhuǎn)菌斑生長(zhǎng)并變藍(lán),而MdMKK9+MdCHS共轉(zhuǎn)菌斑未生長(zhǎng)未變藍(lán),三組對(duì)照(MdMKK9+AD,MdCHS+BD,MdSPX3+BD)菌斑均未生長(zhǎng)未變藍(lán)。圖4B結(jié)果顯示,在SD-Trp-Leu-His/AbA培養(yǎng)基上,MdMKK9+MdSPX3共轉(zhuǎn)菌斑長(zhǎng)勢(shì)與53對(duì)照相似,長(zhǎng)勢(shì)良好,MdMKK9+MdCHS共轉(zhuǎn)菌斑及陰性對(duì)照均未生長(zhǎng)。因此,初步判斷MdMKK9與MdSPX3互作,與MdCHS不互作或互作較弱。

        2.4.2BiFC驗(yàn)證互作 為進(jìn)一步驗(yàn)證MdMKK9與MdSPX3互作,構(gòu)建了pCAMBIA1300-nLUC-MdMKK9和pCAMBIA1300-cLUC-MdSPX3載體,進(jìn)行本生煙注射,觀察LUC表達(dá)情況得知,Md-MKK9與MdSPX3在體內(nèi)互作(圖5)。

        2.4.3Pull-down驗(yàn)證互作 (1)為了進(jìn)一步驗(yàn)證MdMKK9與MdSPX3互作,構(gòu)建pET-32a-HIS-MdSPX3、pGEX-4T-l-GST-MdMKK9原核蛋白表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,測(cè)序成功后提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化DE3大腸桿菌(圖6A、B)。利用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),從變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中可以發(fā)現(xiàn),30℃誘導(dǎo)6h后MdSPX3(48.6 kD)和MdMKK9(63.1 kD)蛋白條帶比誘導(dǎo)前(0h)明顯變粗(圖6C、D),說(shuō)明這兩個(gè)蛋白已經(jīng)被成功誘導(dǎo)。

        (2)誘導(dǎo)蛋白經(jīng)親和層析方法純化后,通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在48.6、63.1 kD處有明顯的目的條帶(圖7A)。利用純化后的蛋白進(jìn)行Pull-down蛋白下拉試驗(yàn)及Westem blot蛋白印跡試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證MdSPX3與MdMKK9的互作關(guān)系,結(jié)果(圖7B)顯示,MdMKK9-GST可以通過(guò)與MdSPX3-HIS結(jié)合被下拉,證明MdMKK9與Md-SPX3可以在體外相互結(jié)合,即MdMKK9與Md—SPX3蛋白互作。

        3討論與結(jié)論

        蛋白質(zhì)之間互作是蛋白質(zhì)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要方式。在細(xì)胞接收內(nèi)源和外源信號(hào)、通過(guò)信號(hào)途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)、保持物種生物學(xué)特性過(guò)程中,蛋白質(zhì)都占有重要地位,且大部分蛋白質(zhì)是通過(guò)與伴侶分子或其他蛋白質(zhì)復(fù)合物一起發(fā)揮作用,因此蛋白質(zhì)互作研究具有十分重要的生物學(xué)意義。

        研究蛋白互作的工具和手段有多種,酵母雙雜交可為蛋白提供接近活細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境的狀態(tài),能夠直接鑒定蛋白互作情況,在篩選和鑒定MAPK級(jí)聯(lián)途徑研究中起著重要作用。雙分子熒光互補(bǔ)與亞細(xì)胞定位原理相似,屬植物體內(nèi)試驗(yàn),常用試驗(yàn)植物為煙草(Nicotuma tabacumL.);BiFC利用熒光蛋白作為報(bào)告基因,將熒光蛋白分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段N端和C端,再分別與目標(biāo)蛋白連接。體外PuU-down試驗(yàn)是在蛋白提取并純化的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。本試驗(yàn)用MdMKK9作為誘餌蛋白,通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)從蘋(píng)果cDNA文庫(kù)中篩選出MdMKK9逆境相關(guān)互作蛋白11個(gè),挑選與花青苷合成相關(guān)的MdCHS及參與氮素調(diào)控途徑的MdSPX3進(jìn)行互作驗(yàn)證,經(jīng)酵母點(diǎn)對(duì)點(diǎn)初步驗(yàn)證了MdMKK9與MdSPX3互作,而與MdCHS不互作或者互作信號(hào)弱:構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)載體pCAMBIA1300 -nLUC-MdMKK9、pCAMBIA1300-cLUC-MdMKK9、pCAMBLA1300-cLUC-MdSPX3,對(duì)MdMKK9與MdSPX3的互作關(guān)系加以驗(yàn)證,在熒光顯微鏡下觀察到MdMKK9與MdSPX3互作:體外Pull-down下拉試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了MdMKK9與Md-SPX3互作。

        SPX蛋白家族普遍存在于維管植物,在植物磷脅迫反應(yīng)、缺鐵反應(yīng)、抗病性、低氧反應(yīng)和光敏色素介導(dǎo)的光信號(hào)傳導(dǎo)等代謝過(guò)程中起著重要作用。如小麥TaSPX基因在磷酸鹽(Pi)饑餓條件下被顯著誘導(dǎo),TaSPX積極響應(yīng)小麥根部低Pi脅迫過(guò)程;ZmSPX3與ZmPHR1互作,參與了玉米對(duì)低Pi的應(yīng)激反應(yīng);GmSPX3參與大豆的磷酸鹽穩(wěn)態(tài);SPX結(jié)構(gòu)域與PP-InsP具有強(qiáng)親和力,可調(diào)節(jié)植物Pi平衡,維持在減少磷肥投入的情況下獲得高產(chǎn);杜紅園研究了甘藍(lán)型油菜SPX3基因響應(yīng)低磷脅迫的工作模式。另?yè)?jù)報(bào)道,硝酸鹽誘導(dǎo)的NIGTl-SPX-PHR級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑亦介導(dǎo)了氮饑餓信號(hào)下的氮響應(yīng)調(diào)節(jié)。但是SPX3對(duì)MdMKK9在響應(yīng)低氮脅迫花青苷合成途徑中的功能尚待繼續(xù)研究。

        綜上,本研究通過(guò)酵母雙雜交、BiFC、Pulldown等試驗(yàn)篩選并驗(yàn)證了紅肉蘋(píng)果MdMKK9的互作蛋白MdSPX3。

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