王 皎，彭苑哲，普 青，王文蘋,

（1. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點實驗室，云南 昆明 650500；3. 云南省南藥可持續(xù)利用重點實驗室，云南 昆明 650500）

葡萄籽原花青素（PC）是由不同數(shù)量的兒茶素、表兒茶素單體聚合而成的多聚體，具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗輻射等藥理作用；因結(jié)構(gòu)中富含羥基，故抗氧化活性是維生素C的幾十倍，是目前世界上公認(rèn)的最有效的天然抗氧化劑，已在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[1-3]。但PC穩(wěn)定性不佳，易受光照、溫度、氧化劑等多重因素影響，且PC在胃腸道中不易吸收，口服生物利用度較低[4]，致使其應(yīng)用受限。

乙基纖維素（ethyl cellulose，EC）已廣泛用作藥物載體，其不溶于水，但在乙醇等有機溶劑中溶解性較高。EC具有無毒無害、廉價易得、富含羥基、易被改性、可生物降解、可塑性強等優(yōu)點，可形成機械性能良好的韌性薄膜[5]。EC薄膜具有良好的熱穩(wěn)定性，即使在低溫下仍保有一定的柔韌性。此外，還可通過一些簡單的方法將EC制備成密度更小、力學(xué)性能更好的多孔聚合物微粒，粒徑多為微米級，在藥物的保存、運輸、釋放過程中起隔絕污染和破壞的保護(hù)作用，同時控制藥物釋放速度以改善藥效[6]。EC在人體胃部酸性環(huán)境中也無法溶解，口服后能通過腸道排出，對人體無毒副作用。

微粒是一種常見緩控釋藥物載體，其容納范圍廣、釋藥行為可調(diào)，且能實現(xiàn)藥物固態(tài)化和穩(wěn)定化。其一般制法包括乳化-溶劑揮發(fā)、反溶劑沉淀、噴霧干燥或高壓電紡絲工藝等，需特殊設(shè)備[7]；另有一種涂膜粉碎法，其操作簡單、無需特殊設(shè)備和有機溶劑、物料利用率高，目前僅有少數(shù)報道涉及。因此本研究以EC為載體材料、PC為模型藥物，采用涂膜粉碎法制備載藥微粒，并初步考察工藝和藥載比例對微粒形態(tài)、成型過程、載藥量和包封率、相互作用、體外釋放等的影響，為涂膜粉碎工藝的深入研究和推廣利用提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

BCE224-1CCN十萬分之一電子天平（北京賽多利斯）；T6新世紀(jì)紫外分光光度計（北京普析）；Great20傅立葉變換紅外光譜儀（天津中科瑞捷）；TGL-16.5M高速冷凍離心機（上海盧湘儀）；MVE067464-60046-S Phenom飛納臺式掃描電鏡（Thermo Fisher scientific）；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒）；SG250HP超聲波清洗器（上海冠特）；EU-KI-20TF純水機（南京歐鎧）；針頭式過濾器（常德比克曼）。

1.2 試劑

PC（天津尖峰，批號：002-1905036-10）；EC（江西阿爾法高科藥業(yè)，批號：20220210）；4-二甲基氨基肉桂醛（DMAC，上海麥克林）；氫氧化鈉，磷酸二氫鉀（天津風(fēng)船）；鹽酸（云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 PC測定方法

用70 %乙醇配制0.5 mg/ml PC溶液。精密量取1.00 ml PC溶液，用70 %乙醇分別稀釋4，5，6，8，10，18，40倍，分別取1 ml各濃度溶液和70 %乙醇空白溶液，加DMAC顯色劑[8]3 ml，室溫放置30 min，于644 nm處測定吸收值，以PC濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=6.4852C+0.0313，r2=0.9991。結(jié)果表明，PC在12.5～125 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗RSD為0.39 %，重現(xiàn)性試驗RSD為1.75 %，加樣回收率在99.46 %～106.29 %范圍內(nèi)，RSD為3.24 %。

2.2 微粒的制備

采用涂膜粉碎法[9]：將PC、EC分別溶于80 %乙醇溶液中，按藥載比PC:EC=1:5，2:3，2:1混勻；將混合液涂布于水平潔凈玻璃板上，室溫下自然揮干，將膜刮下研細(xì)過100目篩，即得微粒樣品，分別記為PE15、PE23、PE21，密封，置陰涼干燥處保存。同法分別制備空白微粒（EC-MP）和藥物微粒（PC-MP）作為對照。

2.3 微觀形態(tài)

取少量上述樣品以雙面導(dǎo)電膠固定于樣品臺上，噴金處理后置于掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）下觀察其形態(tài)。結(jié)果見圖1。

圖1 SEM下樣品微觀形態(tài)

由圖1可知，PC原料呈皺縮粒子（圖1A），個別為飽滿球形、表面光滑，粒徑約在10～25 μm范圍內(nèi)，大量粒子破裂、暴露出內(nèi)部空心，壁厚約1～2 μm；經(jīng)醇溶揮干再粉碎后，PC形態(tài)發(fā)生顯著改變（圖1B），呈50～80 μm的疏松類球形微粒，由1～2 μm球形或不規(guī)則粒子相互黏接、融合形成。

EC本身為不規(guī)則顆粒、粒徑較大（60～70 μm），表面粗糙、密布孔道、結(jié)構(gòu)疏松（圖1C）；經(jīng)處理后，自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蚣?xì)小的球形微粒，直徑約0.7～2 μm、表面光滑，大量粒子密集排列、粘連成片（圖1D）。

當(dāng)藥物與輔料混合處置后，不同PC:EC比例所得樣品含大量球形粒子、聚集成塊片狀（圖1E、F、G）；樣品中EC含量越高，則微粒粒徑較小且均勻度更佳，其中PE15粒徑為2～3 μm，PE21粒徑為3～10 μm；隨著PC比例增大，逐漸出現(xiàn)一些不規(guī)則塊狀物，其斷面略粗糙，推測可能是在溶劑揮發(fā)過程中發(fā)生了相分離，形成微粒的同時產(chǎn)生塊狀物。還可能是因EC具有黏性，使載藥微粒在干燥過程中形成粘連結(jié)塊，在一定程度上影響微粒粒徑分布。

2.4 微粒形成過程的觀測

取少量藥物、載體或二者混合溶液，滴至潔凈載玻片上，置光學(xué)顯微鏡下，觀察溶劑揮發(fā)過程中體系的動態(tài)變化，并錄制視頻，結(jié)果見圖2。

圖2 PC、EC、PE21 揮發(fā)過程圖（20×）

由圖2可知，0 min時三者均有細(xì)小微粒浮動；PC在溶劑揮發(fā)過程中微粒沉積并逐漸聚集成片，形成藥物富集區(qū)域，待溶劑揮干后PC聚集區(qū)更密集。溶劑揮發(fā)過程中EC無明顯聚集，與0 min相比有明顯的細(xì)小顆粒分散分布，2 min25 s時溶劑揮干，可看出溶劑揮干后有大量粒徑約1 μm的細(xì)小顆粒析出，終點時顆粒大部分呈均勻分布，少部分堆積。PE21在0 min出現(xiàn)稀疏的細(xì)小顆粒，1 min時與EC 3 min時現(xiàn)象類似，有密集細(xì)小顆粒均勻分布；隨著溶劑揮發(fā)，發(fā)生相分離現(xiàn)象，呈現(xiàn)顆粒狀和界限分明的溝壑狀，可能是在此過程中EC包裹PC形成顆粒，而未被包裹的PC則以另一種形式存在，出現(xiàn)藥物富集區(qū)。溶劑揮干后大部分區(qū)域呈均勻分布。

2.5 載藥量和包封率的測定

準(zhǔn)確稱取5 mg微粒樣品，加70 %乙醇使其充分溶解并定容至10 ml，按2.1項下方法測定原花青素含量；按以下公式計算微粒的載藥量和包封率，平行測定3次，結(jié)果見表1。

表1 PE微粒的載藥量和包封率（n=3）

結(jié)果表明，PE微粒的包封率均較高，隨著藥物比例的增加，微粒載藥量也在增加，但包封率先增后減。可能是因為EC具有黏性，使得載藥微粒的載藥量與包封率均較高。

2.6 傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）

采用105 ℃烘干5 h的溴化鉀（KBr）混合研磨壓片，掃描范圍4000～400 cm-1，分辨率4.0 cm-1，掃描信號累加次數(shù)為16次；分別對PC、PC-MP、EC、EC-MP、PC與EC物理混合物（PE-PM）、PE15、PE23、PE21進(jìn)行掃描，并繪制FT-IR譜圖，結(jié)果見圖3。

圖3 FT-IR圖譜

由圖3可見，PC在3356 cm-1處為其分子結(jié)構(gòu)中酚羥基由氫鍵作用引起的伸縮振動，1606，1519，1445 cm-1處是苯環(huán)骨架中C=C的伸縮振動吸收峰；1281，1152，1108，1060 cm-1對應(yīng)的吸收峰為PC分子結(jié)構(gòu)C環(huán)的C-O-C的伸縮振動；PC-MP與PC的紅外吸收特征基本一致。EC在3477和2984 cm-1處的吸收峰由其分子中的-OH和-CH2伸縮振動產(chǎn)生，-CH3彎曲振動形成1380 cm-1處的峰。EC-MP相應(yīng)位置的吸收峰均減弱。物理混合物的紅外圖譜基本為PC和EC的疊加。載藥微粒的紅外譜圖基本一致且與原花青素譜圖類似，表明載藥微粒里的化合物主要以原花青素為主，苯環(huán)骨架C=C的伸縮振動吸收峰紅移，載藥微粒譜圖在3416 cm-1處有吸收峰，這可能是因為原花青素與載體物質(zhì)產(chǎn)生了分子間作用力，形成了氫鍵，-OH伸縮振動藍(lán)移變?yōu)镺-H伸縮振動產(chǎn)生的。

1606 cm-1處為PC的特征峰，在PE-PM圖譜中的同一位置仍存在且強度增大，表明PC未被EC包裹并與其發(fā)生相互作用，與載藥微粒相比，同一位置的峰仍存在但強度減弱，表明PC被EC包裹，且隨PC的比例增加，1606 cm-1處的峰強度逐漸增大，表明有部分PC未被EC包裹，載藥微?？赡軙l(fā)生相分離現(xiàn)象。EC在3477，2984 cm-1處的吸收峰可為其特征峰，在PE-PM譜圖中仍存在，但強度減弱，表明PC與EC物理混合時可能形成氫鍵，從而影響其強度。與載藥微粒相比，同一位置的峰仍存在，但由于EC將PC包裹產(chǎn)生分子間作用力，使其強度更弱。

2.7 體外釋放考察

分別精密稱取一定量的PC-MP、PE21于5 ml離心管中，加入3 ml釋放介質(zhì)（pH 6.8磷酸鹽緩沖液），離心管置于恒溫培養(yǎng)搖床內(nèi)（37±0.5 ℃，100 r/min），分別于0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h高速（10 000 r/min）離心5 min后，取上清（2.7 ml），同時補充同溫等量介質(zhì)，經(jīng)0.22 μm水系針頭式微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液 1 ml，按2.1項下方法測定PC含量，平行測定3次，據(jù)PC標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，根據(jù)以下計算累積釋放量（Q）[10]，并以累積釋放量對相應(yīng)的時間作圖，分別繪制體外釋放曲線。

其中，V0為釋放介質(zhì)總體積；Vi為釋放介質(zhì)置換體積；Ci為在第i個時間點取樣時釋放介質(zhì)中的藥物濃度；m為微粒所載藥物總質(zhì)量；n為取樣次數(shù)，結(jié)果見圖4。

圖4 原花青素緩釋微粒累計釋放曲線

由圖4可知，兩者在12 h時均已釋放80 %，24 h釋放較完全；PE21在0.5 h時釋藥略低于PCMP，此后均較高；PE21在12 h內(nèi)的釋放呈典型的緩釋特征，而PC-MP在2 h內(nèi)快速釋放50 %之后，此后10 h內(nèi)釋藥速率幾乎恒定。

0.5 h之前PC-MP是直接釋放，PE21因緩釋材料EC的存在使得釋放減慢，0.5 h之后PC-MP釋藥速率低于PE21。PE21的粒徑為3～10 μm，PC-MP粒徑10～25 μm，PE21粒徑小、比表面積大，且EC具有黏性使載藥微粒表面吸附有PC， 0.5 h后，微粒表面吸附及靠近微粒外層的藥物迅速釋放，使得PE21在0.5 h后的釋放較快，此后，因EC的存在出現(xiàn)緩釋特征。

2.8 模型擬合與釋藥機制分析

為了進(jìn)一步闡明不同藥載比原花青素微粒的體外釋藥特性，探討其釋藥機理，在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用4種動力學(xué)模型對PC-MP、PE21的釋放曲線進(jìn)行擬合[11]，包括：零級動力學(xué)模型（Qt=kt）、一級動力學(xué)模型[ln（1-Qt）=-kt]、Higuchi模型（Qt=kt0.5）、Ritger-Peppas模型（Qt=ktn）。

式中：為t時刻的累積釋放分?jǐn)?shù)；k為釋放常數(shù)；Ritger-Peppas模型中的n值表示釋放機制，n≤0.45為菲克擴散（Fick diffusion），n≥0.89為骨架溶蝕，當(dāng)n值介于二者之間為非菲克擴散（結(jié)合擴散與骨架溶蝕作用）[12]。根據(jù)所得方程的相關(guān)系數(shù)R2，判斷釋放方程擬合的最佳模型。

由表2可知，零級動力學(xué)模型擬合結(jié)果最差，表明藥物與微粒釋放不是恒定的即非控釋；一級動力學(xué)模型擬合效果僅次于Ritger-Peppas模型，且PC-MP的R2大于PE21，原因可能是累計釋放曲線PC-MP在2～12 h階段為一級動力學(xué)釋放。原花青素微粒的體外釋放最佳模型為Ritger-Peppas模型，兩者n值均小于0.45，因此其釋放機制為菲克擴散，屬于非穩(wěn)態(tài)擴散。

表2 原花青素緩釋微粒體外釋放的擬合結(jié)果

3 討論

據(jù)圖1結(jié)果推測生產(chǎn)PC時可能采用了噴霧干燥工藝，因而形成了大量中空球形粒子、且在快速固化過程中發(fā)生表面塌陷，這與文獻(xiàn)報道中噴霧干燥過程中的條件、處方組成等多種因素造成可能造成微粒表面皺褶相符合[13-14]。而本文采用涂膜粉碎法制備微粒的過程中，將PC粒子復(fù)溶、自然揮干之后再粉碎，完全改變了PC原料藥的原有形貌，與文獻(xiàn)中采用涂膜粉碎法制備微膠囊的結(jié)果相似[9]，均呈現(xiàn)不規(guī)則的顆粒且粒徑較大。比較EC涂膜粉碎法處理前后，EC粒子的形態(tài)改變更明顯，從酥松塊狀物轉(zhuǎn)變?yōu)槌善募?xì)小均勻微粒，此結(jié)果與EC的特性一致。此法操作簡單，可用于制備微米級且密度更小、力學(xué)性能更好的聚合物微粒。以上可表明不同的制備工藝對粒子形態(tài)有極大影響。

研究表明，當(dāng)溶液中化合物濃度超過其無定形形式的溶解度時，就會在過飽和溶液中形成聚集體。在此濃度（通常為結(jié)晶溶解度的5～50倍）下，會超過化合物液體形式的混溶性極限，并發(fā)生液-液相分離（LLPS），從而形成初始為膠體大小的藥物富集相[15]。因PC的極性比EC大，親水性較EC好，在乙醇溶劑揮發(fā)剩余部分水時更易形成藥物富集區(qū)；而EC不溶于水、極性小，在溶劑中乙醇揮發(fā)完之后產(chǎn)生相分離且比PC早，不易形成藥物富集區(qū)；載藥微粒因PC與EC發(fā)生相互作用形成分子間氫鍵， EC極性小于PC，且PC結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)不易變形，EC結(jié)構(gòu)中無苯環(huán)易變形，在乙醇揮發(fā)之后EC不溶于剩余水分，使得EC包裹PC形成較規(guī)則且粒徑較EC大的粒子，未被包裹的PC則形成藥物富集區(qū)。還可能因EC具有黏性，可吸附PC形成藥物富集區(qū)，在干燥過程中形成粘連結(jié)塊。

本文采用涂膜粉碎法成功制備了載PC的EC緩釋微粒，結(jié)果表明通過改變藥載比能方便有效地調(diào)節(jié)所得載藥微粒的形態(tài)，進(jìn)而影響其載藥和釋藥性能，證實涂膜粉碎用于制備載藥微粒高效便捷、可控性強。本研究為涂膜粉碎工藝推廣用于其他活性成分制劑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，也對微粒結(jié)構(gòu)和性能的調(diào)控策略進(jìn)行了有益探索。