冷吉明，葛向平，劉長(zhǎng)浩

（1.山東省膠州市里岔鎮(zhèn)人民政府，山東 膠州 266300；2.山東省膠州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 膠州；3.齊魯動(dòng)物保健品有限公司，山東 濟(jì)南）

水貂出血性肺炎是一種主要由銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）感染而引起水貂以口鼻流血、急性死亡為主要特征的急性細(xì)菌傳染病，是危害水貂養(yǎng)殖的重要疾病之一。該病在世界各地均有發(fā)生，我國(guó)是水貂養(yǎng)殖大國(guó)，由于養(yǎng)殖模式差異、管理水平差異、注射褪黑激素等原因，導(dǎo)致該病在我國(guó)呈現(xiàn)多年流行的情況。銅綠假單胞菌是引發(fā)水貂出血性肺炎的主要病原菌之一[1-4]，近年來(lái)也有報(bào)道其他病原菌引起水貂肺炎的病例。郭蕊、孫虎芝等報(bào)道了由肺炎克雷伯氏桿菌引起的水貂肺炎的病例[5-9]。于杰等報(bào)道了水貂出血性肺炎病例中存在銅綠假單胞菌與大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌等的混合感染[10]。但是銅綠假單胞菌仍然是造成水貂出血性肺炎，進(jìn)而導(dǎo)致其死亡的主要病原。水貂的血清型眾多，目前研究發(fā)現(xiàn)，水貂中常見(jiàn)的血清型以G型、B型為主，極少有其他血清型感染的報(bào)道。趙志騰、葛愛(ài)民等曾分別在水貂出血性肺炎病例中檢測(cè)到C型、D型銅綠假單胞菌，但占比很低[11-12]，優(yōu)勢(shì)血清型仍然是G型、B型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例來(lái)源及背景 病例來(lái)源于山東、河北、遼寧、黑龍江等23 個(gè)發(fā)生肺炎死亡的養(yǎng)殖場(chǎng)，發(fā)病死亡水貂均已注射褪黑激素，皮張?jiān)?～10 月份成熟銷(xiāo)售，其中8 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)已經(jīng)免疫出血性肺炎疫苗，15 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)未免疫出血性肺炎疫苗。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 銅綠假單胞菌血清型鑒別抗體購(gòu)自北京易購(gòu)安生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品為日本生研株式會(huì)社生產(chǎn)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、銅綠假單胞菌鑒別培養(yǎng)基、馬丁瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自中海生物科技有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；DNA Marker DL 2 000、2×Taq Master Mix，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T 載體，購(gòu)自TAKARA 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 解剖病死水貂，無(wú)菌采取肺臟，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，并將平板置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～18 h。

1.2.2 細(xì)菌分離與純化 挑取單個(gè)典型菌落，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上做劃線培養(yǎng)純化，并挑取單個(gè)菌落接種于馬丁瓊脂、麥康凱瓊脂及銅綠假單胞菌鑒別培養(yǎng)基平皿上，37 ℃ 培養(yǎng)14～24 h，取單個(gè)菌落進(jìn)行16s RNA 鑒定。

1.2.3 PCR 鑒定及遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 挑取培養(yǎng)基上直徑1～2 mm 單菌落，放入盛有100 μL 去離子水的1.5 mL 離心管內(nèi)，沸水浴放置15 min。取出離心管并自然冷卻至室溫后，10 000 r/min離心5 min，取上清3 μL，用于細(xì)菌16s rRNA 的PCR 擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與GenBank庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，鑒定細(xì)菌種屬。16s rRNA引物（上游引物F：5’-GAGTTTGATCCTGGCT CAG-3’；下游引物R：5’-ACGGCTACCTTGTTA CGACT-3’）。PCR 反應(yīng)體系見(jiàn)表1，PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min 后；按照94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s 循環(huán)，設(shè)置30 個(gè)循環(huán)，最終72 ℃ 延伸10 min 后4 ℃ 保溫完成擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送生物公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行比對(duì)。

表1 . 細(xì)菌16s rRNA 的PCR 反應(yīng)體系

1.2.4 血清型鑒定 將1.2.3 所鑒定的9 株銅綠假單胞菌進(jìn)行血清型鑒定，采用銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 將經(jīng)16s rRNA 鑒定的細(xì)菌，均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，按照NCCLS 推薦的K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)及結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 病原的分離純化結(jié)果

從23 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)水貂肺臟分離純化出9 株細(xì)菌，細(xì)菌培養(yǎng)特性一致，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上長(zhǎng)出圓形、扁平、邊緣整齊的中等大小菌落，培養(yǎng)16 h 以上，菌落周邊培養(yǎng)基被染成黃綠色（圖1）。在銅綠假單胞菌選擇培養(yǎng)基平板上，可長(zhǎng)出相同形狀大小的菌落，且整個(gè)菌落明顯呈藍(lán)綠色。12株細(xì)菌均為革蘭氏陰性小桿菌，呈單個(gè)或成對(duì)排列，偶爾呈鏈狀排列，染色形態(tài)一致（圖2）。

圖1 分離株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂生長(zhǎng)照片

圖2 分離菌株革蘭氏染色照片

2.2 PCR 鑒定及遺傳進(jìn)化樹(shù)

針對(duì)9 株分離的疑似銅綠假單胞菌進(jìn)行16s rRNA 擴(kuò)增分析，擴(kuò)增片段大小均約為1 500 bp（圖3），擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果為1 512 bp。經(jīng)與GenBank 基因庫(kù)中序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，9 株分離株的序列與編號(hào) AJ549293.1的“ P. aeruginosa AT10”、編號(hào)Z76651.1 的“P. aeruginosa LMG 1242T”銅綠假單胞菌序列一致性為 99.1%～100%（圖4），確定9 株分離株為銅綠假單胞菌。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，WF01、WD03、WD04、HY01、LN01、LN03、LN04、HB01、HB02 與P. aeruginosaAT10（ 編 號(hào) ：AJ549293.1）、P. aeruginosa LMG 1242T（編號(hào)：Z76651.1）為同一分支（圖5），證實(shí)這9株分離株均為銅綠假單胞菌。

圖3 分離株16s rDNA 鑒定結(jié)果

圖4 WF01、WD03、WD04、HY01、LN01、LN03、LN04、HB01、HB02 16s rDNA 同源性分析

圖5 分離株WF01、WD03、WD04、HY01、LN01、LN03、LN04、HB01、HB02 16s rDNA 基因序列遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 血清型鑒定

將2.1 所鑒定的9 株疑似銅綠假單胞菌進(jìn)行血清型鑒定，采用銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)血清經(jīng)平板凝集試驗(yàn)（圖6）鑒定，結(jié)果顯示，9 株細(xì)菌分離株中7 株為血清型G型，2 株為血清型B型（表2）。

圖6 分離株平板凝集試驗(yàn)

表2 9 株銅綠假單胞菌血清型鑒定結(jié)果

3 討論

水貂是我國(guó)特種養(yǎng)殖中重要的動(dòng)物種類(lèi)之一，多年來(lái)由于國(guó)內(nèi)中小養(yǎng)殖場(chǎng)的養(yǎng)殖模式，在環(huán)境控制、飼料營(yíng)養(yǎng)搭配等方面仍然存在一定不足，同時(shí)為了通過(guò)提前取皮，降低養(yǎng)殖成本，注射褪黑激素使水貂提前換毛，造成水貂出血性肺炎發(fā)病的加劇。山東及河北等地7 月初出現(xiàn)發(fā)病情況，而且發(fā)病持續(xù)期長(zhǎng)達(dá)3 個(gè)月以上，這給本病的防控帶來(lái)較大挑戰(zhàn)。本研究中的15 個(gè)未免疫出血性肺炎疫苗的養(yǎng)殖場(chǎng)，肺炎發(fā)病率在5%～10%，病貂死亡率平均為41.6%，其中8 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)病死貂中均分離到了銅綠假單胞菌；8 個(gè)免疫出血性肺炎疫苗的養(yǎng)殖場(chǎng)，肺炎發(fā)病率在0.5%～3%，病貂死亡率平均為28.5%，其中僅有1 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的病死貂中分離到銅綠假單胞菌，說(shuō)明免疫出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗能有效降低水貂死亡率。閆新武、趙志騰等曾分別報(bào)道，水貂免疫銅綠假單胞菌滅活疫苗對(duì)水貂出血性肺炎具有良好的免疫保護(hù)效果[13-14]。銅綠假單胞菌由于具有較強(qiáng)耐藥性，在對(duì)山東、河北、遼寧等地臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，水貂養(yǎng)殖場(chǎng)分離的銅綠假單胞菌對(duì)臨床常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖甙類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)等抗生素均呈現(xiàn)不同程度耐藥性[15-17]，而且在肺炎發(fā)病高峰期，大劑量使用抗生素藥物，也會(huì)造成藥物中毒風(fēng)險(xiǎn)提高。有研究顯示，個(gè)別地區(qū)的銅綠假單胞菌分離株對(duì)中藥（五味子、烏梅）有較強(qiáng)敏感性，因此水貂養(yǎng)殖場(chǎng)在免疫出血性肺炎疫苗的同時(shí)，可選擇配合部分中藥制劑，進(jìn)一步控制水貂出血性肺炎發(fā)病率，降低水貂死亡率，進(jìn)而減少養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié)論

本研究從發(fā)生水貂肺炎養(yǎng)殖場(chǎng)的病死貂肺臟中分離到9 株細(xì)菌，經(jīng)PCR 鑒定和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析確定是銅綠假單胞菌，表明水貂出血性肺炎的主要病原仍然是銅綠假單胞菌；9 株銅綠假單胞菌經(jīng)平板凝集試驗(yàn)鑒定，其中7 株G型，2 株B型，表明目前造成水貂出血性肺炎的銅綠假單胞菌優(yōu)勢(shì)血清型仍然是G型和B型，與目前臨床應(yīng)用的水貂出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗具有相同血清型。