高毅敏 ，耿大升 , ，李新鳴 ，劉光焱，金慧，張家鑫

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110034；3.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110024）

念珠菌是機(jī)會(huì)致病性真菌，在健康人群皮膚黏膜、開放腔道等部位可以檢出，當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫防御功能降低時(shí)，念珠菌入侵機(jī)體引發(fā)皮膚念珠菌病、黏膜念珠菌病、念珠菌血癥等侵襲性真菌疾?。?］。近年來，由于慢性病患者、免疫缺陷疾病患者等免疫力低下人群的增加，以及機(jī)械通氣、腹部手術(shù)、中心靜脈導(dǎo)管等侵入性操作的應(yīng)用和抗真菌藥物的大量使用，導(dǎo)致院內(nèi)念珠菌感染率和死亡率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅住院患者生命安全［2-3］。了解東北地區(qū)院內(nèi)念珠菌感染的病原譜和臨床分布特征，從而為防治本地區(qū)醫(yī)院內(nèi)真菌感染提供依據(jù)。本研究對沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院住院患者的念珠菌檢出情況進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

采集2020 年10 月至2021 年10 月沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院住院病人送檢真菌的各類標(biāo)本。收集標(biāo)本資料，包括患者性別、年齡、所在病區(qū)、標(biāo)本來源、鑒定真菌結(jié)果等信息。

納入標(biāo)準(zhǔn)：同一患者同一標(biāo)本類型檢出非重復(fù)念珠菌。排除標(biāo)準(zhǔn)：檢出念珠菌以外真菌的標(biāo)本；患者性別、所在病區(qū)、標(biāo)本類型等數(shù)據(jù)缺失標(biāo)本。

1.2 主要儀器與試劑

VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀（法國生物梅里埃股份有限公司）；生化培養(yǎng)箱（SHP-300 型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；霉菌培養(yǎng)箱（MHP-300 型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；念珠菌顯色瓊脂培養(yǎng)基（沈陽彥程生物制品有限公司）和沙保氏瓊脂培養(yǎng)基（沈陽彥程生物制品有限公司）；革蘭氏染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。質(zhì)控菌株為白色念珠菌ATCC14053（衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心）。

1.3 標(biāo)本采集與送檢

1.3.1 呼吸道標(biāo)本的采集與送檢 痰液標(biāo)本：患者清晨用清水反復(fù)漱口，用力咳出第一口痰于滅菌容器中。支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本：以支氣管鏡向局部肺泡內(nèi)注入無菌生理鹽水，負(fù)壓回收灌洗液于無菌容器內(nèi)。鼻咽拭子、咽拭子、咽分泌物標(biāo)本：用無菌拭子輕輕擦拭病人鼻咽部黏膜，蘸取分泌物于無菌容器中。呼吸道標(biāo)本于室溫條件下2 h 內(nèi)送檢，如不能及時(shí)送檢，4℃保存不超過24 h。

1.3.2 尿液標(biāo)本的采集與送檢 清洗尿道口，留取清晨清潔中段尿標(biāo)本10～20 mL 并及時(shí)送檢。室溫條件下2 h 內(nèi)送檢，如不能及時(shí)送檢，4℃保存不超過8 h。

1.3.3 便標(biāo)本的采集與送檢 挑取有黏液、膿血部分的新鮮便標(biāo)本（2～3 g），放置于無菌容器中。室溫條件下2 h 內(nèi)送檢，如不能及時(shí)送檢，室溫條件下使用磷酸鹽甘油緩沖液（PH 7.0）保存不超過24 h。

1.3.4 膿液、傷口分泌物標(biāo)本的采集與送檢 開放膿腫用無菌生理鹽水擦洗，用滅菌拭子采取膿液和病灶深處的分泌物；封閉性膿腫用75%酒精對周圍皮膚消毒，無菌注射器抽取膿液。室溫條件下2 h 內(nèi)送檢，如不能及時(shí)送檢，4℃保存不超過24 h。

1.3.5 分泌物（眼、耳等分泌物）標(biāo)本的采集與送檢 眼結(jié)膜標(biāo)本：預(yù)先沾濕拭子，在結(jié)膜上滾動(dòng)采集標(biāo)本并于30 min 內(nèi)送檢。內(nèi)耳標(biāo)本：用肥皂水清洗耳道，用注射器或拭子收集液體，室溫條件下2 h 內(nèi)送檢。

1.3.6 胸水標(biāo)本的采集與送檢 在未使用抗生素之前，或停止使用抗生素之后2～3 d，無菌穿刺抽取或外科手術(shù)采集標(biāo)本10 mL 于無菌試管中。室溫條件下2 h 內(nèi)送檢，如不能及時(shí)送檢，4℃保存不超過24 h。

1.4 真菌培養(yǎng)與鑒定

1.4.1 真菌分離培養(yǎng) 痰液、便、膿液、傷口分泌物標(biāo)本用無菌棉簽挑取帶血、黏液部分接種于沙保氏培養(yǎng)基，尿液、無菌體液標(biāo)本離心后取沉淀物接種于沙保氏培養(yǎng)基，鼻咽拭子、咽拭子、咽分泌物、分泌物標(biāo)本直接接種于沙保氏培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～7 d。當(dāng)沙保氏培養(yǎng)基出現(xiàn)酵母樣菌落生長，挑取可疑菌落接種于念珠菌顯色培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，每日觀察菌落顏色和特征。

1.4.2 革蘭染色 參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4 版）的標(biāo)準(zhǔn)操作，使用革蘭氏染液對可疑菌落進(jìn)行涂片染色，鏡檢觀察是否有假菌絲和孢子。

1.4.3 生化鑒定 對可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，按照檢驗(yàn)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（Standard Operating Precdure,SOP）操作，使用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀鑒定菌種。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0 軟件統(tǒng)計(jì)和分析數(shù)據(jù)，患者人數(shù)和標(biāo)本數(shù)為計(jì)數(shù)資料，用百分率（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 院內(nèi)念珠菌感染患者年齡分布情況

標(biāo)本念珠菌陽性患者共212 人，年齡為29～100 歲，其中60 歲以下9 人（4.25%），60 歲及以上203 人（95.75%），見表1。

表1 院內(nèi)念珠菌感染患者年齡分布

2.2 念珠菌檢出情況

念珠菌檢出前五位分別為白色念珠菌136 例（52.51%），熱帶念珠菌47 例（18.15%），光滑念珠菌43 例（16.60%），近平滑念珠菌10 例（3.86%），克柔念珠菌5 例（1.93%）。其中，非白色念珠菌占47.49%，見表2。

表2 念珠菌檢出情況

2.3 不同病區(qū)念珠菌檢出情況

不同臨床病區(qū)念珠菌檢出前五位為重癥醫(yī)學(xué)科（intensive care unit,ICU）（52.51%）、呼吸重癥監(jiān)護(hù)室（respiratory intensive care unit,RICU）（18.92%）、呼吸科（17.37%）、干診內(nèi)科（5.41%）和全科醫(yī)學(xué)科風(fēng)濕免疫科（2.70%），見表3。

表3 不同病區(qū)念珠菌檢出情況

重癥醫(yī)學(xué)科中念珠菌檢出前三位為白色念珠菌（46.32%）、熱帶念珠菌（21.32%）和光滑念珠菌（19.85%）。呼吸重癥監(jiān)護(hù)室中念珠菌檢出前三位為白色念珠菌（48.98%）、熱帶念珠菌（16.33%）和光滑念珠菌（16.33%）。呼吸科中念珠菌檢出前三位為白色念珠菌（75.56%）、熱帶念珠菌（8.89%）和光滑念珠菌（4.44%）。干診內(nèi)科中念珠菌檢出前三位為白色念珠菌（42.86%）、熱帶念珠菌（28.57%）和光滑念珠菌（14.29%）。全科醫(yī)學(xué)科風(fēng)濕免疫科中念珠菌檢出為白色念珠菌（57.14%）和光滑念珠菌（42.86%）。見表4。

表4 不同病區(qū)中念珠菌分布情況

2.4 不同標(biāo)本念珠菌檢出情況

在不同類型檢出標(biāo)本中，痰液中念珠菌檢出最多（50.19%），其次為便（26.25%）、尿液（17.76%）、咽拭子（3.09%），而分泌物、支氣管灌洗液等標(biāo)本檢出較少（2.70%），見表5。

表5 不同標(biāo)本念珠菌檢出情況

在呼吸道標(biāo)本（痰液、咽拭子、咽分泌物、支氣管灌洗液、鼻咽拭子）中檢出的念珠菌排在前三位的依次為白色念珠菌（57.45%）、熱帶念珠菌（15.60%）和光滑念珠菌（12.06%）。在便標(biāo)本中檢出情況前三位依次為白色念珠菌（57.35%）、光滑念珠菌（25.00%）和熱帶念珠菌（14.71%）。在尿液標(biāo)本中檢出情況前三位為白色念珠菌（30.43%）、熱帶念珠菌（30.43%）和光滑念珠菌（19.57%）。在分泌物標(biāo)本中檢出白色念珠菌（50.00%）和其他念珠菌（50.00%）。在膿液、傷口分泌物標(biāo)本中只檢出白色念珠菌。在胸水標(biāo)本中只檢出熱帶念珠菌。見表6。

表6 不同標(biāo)本中念珠菌分布情況

3 討論

隨著臨床頻繁地使用抗菌藥物、抗感染治療、化學(xué)療法等診療手段，院內(nèi)念珠菌感染率居高不下［2］。院內(nèi)真菌感染不僅增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)，還延長患者住院時(shí)間、增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、引起病情惡化甚至威脅患者生命安全［4］。由于念珠菌感染缺乏典型癥狀，臨床診斷率較低，病情發(fā)展迅速，導(dǎo)致院內(nèi)念珠菌感染的病死率較高［5］。因此，有必要開展對院內(nèi)念珠菌感染的監(jiān)測分析。真菌培養(yǎng)和染色鏡檢仍然是診斷念珠菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確的微生物檢測結(jié)果有助于臨床的早期診斷和及時(shí)治療［6-7］。

本研究中，95.75%的念珠菌陽性住院患者在60 歲及以上，表明老年患者是念珠菌感染的高發(fā)人群。老年患者一般患有慢性消耗性疾病，機(jī)體免疫防御功能低下，并且經(jīng)常接受中心靜脈導(dǎo)管、機(jī)械通氣、腹部手術(shù)、腸外營養(yǎng)等侵入性操作，容易發(fā)生院內(nèi)機(jī)會(huì)性真菌感染［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)醫(yī)院內(nèi)念珠菌感染以白色念珠菌檢出率最高，而非白色念珠菌以熱帶念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌為主，與北京市多家念珠菌檢出一致［9］，表明白色念珠菌是引起本地區(qū)念珠菌感染最普遍的病原菌，但是非白色念珠菌在念珠菌感染中的作用也不容忽視。法國尼斯某醫(yī)院也發(fā)現(xiàn)白色念珠菌檢出最高，但是非白色念珠菌構(gòu)成與我們的結(jié)果不同［10］。院內(nèi)念珠菌感染中菌種構(gòu)成差異可能是因?yàn)榈乩矸植?、醫(yī)院類型、患者特征等因素而呈現(xiàn)不同結(jié)果［11-12］。因此，研究念珠菌感染的地域特點(diǎn)不僅有助于比較不同地區(qū)的念珠菌感染率、死亡率以及評估念珠菌病帶來的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，還可以根據(jù)當(dāng)?shù)蒯t(yī)院感染情況進(jìn)行針對性防治［4,11］。

本研究發(fā)現(xiàn)ICU 和RICU 的念珠菌檢出率最高，與PINTO-MAGALH?ES 等［13］報(bào)道葡萄牙某醫(yī)院ICU 病房念珠菌檢出率最高一致。因?yàn)镮CU類病區(qū)的患者通常病情危急，由于機(jī)械通氣、全胃腸外營養(yǎng)、留置尿管、抗生素及免疫抑制劑的應(yīng)用而使機(jī)體免疫力下降，增加了念珠菌感染幾率［14］。呼吸科念珠菌檢出也較高，可能因?yàn)樵摬^(qū)患者以呼吸系統(tǒng)疾病為主，因呼吸機(jī)、纖支鏡等操作引起機(jī)體免疫力下降，定植在呼吸道的念珠菌通過黏附、誘導(dǎo)內(nèi)吞和積極滲透作用入侵機(jī)體［15-16］；同時(shí)為了防治肺部細(xì)菌感染而不規(guī)范使用抗生素，導(dǎo)致肺部微生態(tài)失衡，增加機(jī)體對真菌的易感性，使肺部二重感染經(jīng)常出現(xiàn)［17］。此外，本研究中，念珠菌在不同臨床病區(qū)均有檢出且種類豐富，表明院內(nèi)念珠菌感染具有復(fù)雜性，提示臨床不應(yīng)該只重視重點(diǎn)病區(qū)真菌感染情況，而是要加強(qiáng)對整個(gè)醫(yī)院真菌流行病學(xué)的監(jiān)測。

筆者的研究也發(fā)現(xiàn)，呼吸道標(biāo)本中念珠菌檢出率最高，與JAMIL 等［18］的結(jié)果一致。由于呼吸道具有開放型部位的解剖特點(diǎn)，暴露于環(huán)境中的念珠菌孢子被機(jī)體吸入［19］。當(dāng)呼吸道防御屏障因使用氣管插管等侵入性設(shè)備發(fā)生損傷時(shí)，呼吸道黏膜上皮細(xì)胞清除異物能力下降，定植于呼吸道的念珠菌孢子轉(zhuǎn)變?yōu)榫z入侵機(jī)體引發(fā)感染［20］。另外，當(dāng)免疫力低下患者發(fā)生皮膚、胃腸道等呼吸道以外部位的念珠菌感染時(shí)，念珠菌可能通過血液播散到肺部而引起繼發(fā)性真菌感染［21］，因此，呼吸道極易受到院內(nèi)念珠菌侵襲。此外，念珠菌在便、尿液等其他標(biāo)本中均有檢出，提示念珠菌在機(jī)體內(nèi)寄居部位廣泛。

綜上所述，隨著院內(nèi)念珠菌感染趨勢的不斷擴(kuò)大和菌種構(gòu)成的多樣化，念珠菌已成為影響住院患者生存與預(yù)后的重要致病菌。因此，醫(yī)院應(yīng)定期對患者念珠菌的感染情況進(jìn)行監(jiān)測。目前，我國東北地區(qū)關(guān)于院內(nèi)真菌感染的數(shù)據(jù)仍然較少，筆者對本院院內(nèi)念珠菌檢出情況進(jìn)行了分析，可為東北地區(qū)院內(nèi)真菌感染研究提供依據(jù)。由于念珠菌感染的病原譜有明顯的地域特點(diǎn)，因此，開展本地區(qū)院內(nèi)念珠菌病原學(xué)監(jiān)測，有利于預(yù)防、早期診斷院內(nèi)感染的發(fā)生。