殷一明　趙德剛　鄭文佳

摘要：為了實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)篩選綠茶中抑菌成分，對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。以3個(gè)貴州特色茶樹品種（黔茶1號(hào)、黔湄419、黔湄601）夏季的一芽三葉為原料，福鼎大白茶為對(duì)照，分別加工成綠茶，采用雙層平板法比較抑菌活性，并測定各提取物活性成分的含量，以相關(guān)成分的含量為指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)研究提取工藝。結(jié)果表明，4個(gè)茶樹品種綠茶甲醇提取物與水提取物共8個(gè)樣品均表現(xiàn)出一定的抑菌效果，其中黔茶1號(hào)綠茶醇提取物的抑菌效果最佳。相關(guān)性分析表明，與抑菌作用呈相關(guān)關(guān)系的成分有總酚、總黃酮、兒茶素類、EGCG、ECG和EC。以上述6種成分為指標(biāo)，最佳的提取工藝條件為：浸提時(shí)間12 min，浸提溫度70 ℃，料液質(zhì)量體積比1∶25，甲醇體積分?jǐn)?shù)75%。3次平行驗(yàn)證RSD值均在5%以內(nèi)。綜上所述，本研究優(yōu)選出的甲醇提取工藝條件科學(xué)合理、簡單可行，可為黔茶1號(hào)的進(jìn)一步研究和生產(chǎn)抑菌產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：綠茶；抑菌；提取工藝；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS272.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1000－3150（2023）08-10-8

Optimization of the Extraction Process of

Antibacterial Ingredients in Green Tea

YIN Yiming1， ZHAO Degang1，2， ZHENG Wenjia3*

1. Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region， College of

Life Sciences/Institute of Agro-bioengineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China;

2. Guizhou Plant Conservation Technology Application Engineering Research Center， Guizhou Academy of Agricultural Sciences，

Guiyang 550006， China; 3. Tea Research Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550009， China

Abstract： In order to achieve multi indicator screening of antibacterial components in green tea， the extraction process was optimized.? Three Guizhou characteristic tea cultivars （'Qiancha 1' 'Qianmei 419' 'Qianmei 601'） were used as raw materials in summer， with one bud and three leaves as raw materials. 'Fudingdabaicha' was used as the control. These materials were processed into green tea. The antibacterial activity of each extract was compared using the double-layer plate method. The contents of active ingredients in each extract were determined. An orthogonal experiment was designed to study the extraction process， with the contents of related components as the index. The results show that a total of 8 samples of methanol and water extracts from four tea cultivars （'Fudingdabaicha' 'Qiancha 1' 'Qianmei 419'? 'Qianmei 601'） exhibited certain bacteriostatic effects. Among these samples， the methanol extract of 'Qiancha 1' green tea showed the best antibacterial effect. Correlation analysis reveals that the components related to antibacterial activities include total phenols， total flavonoids， catechins， EGCG， ECG， and EC. Based on the above six components as the index， the best extraction process conditions are extraction time of 12 minutes， extraction temperature at 70 ℃， material-liquid ratio of 1∶25， and methanol concentration of 75%. The relative standard deviation （RSD） values of three parallel verifications were within 5%. The methanol extraction conditions selected in this study are scientific， reasonable， simple and feasible， which can provide a theoretical basis for further research and production of bacteriostatic products using 'Qiancha 1' as raw material.

Keywords： green tea， antibacterial， extraction process， optimization

多酚類物質(zhì)作為茶葉中重要的功能性成分，主要包括兒茶素類、黃酮類、花青素類和酚酸類等[1]，不僅具有抗癌[2]、抗血栓[3]、防治心血管疾病[4]、助消化[5]、抗菌[6]、抗氧化[7]等功能，還具有美容護(hù)膚[8]等保健功效。研究表明，茶葉對(duì)于多種細(xì)菌、霉菌具有廣譜抗菌作用，且在六大茶類中，綠茶的抑菌效果最佳[9]，特別是其中富含的茶多酚類物質(zhì)表現(xiàn)出很好的抗菌能力。目前臨床上對(duì)于細(xì)菌感染多使用抗生素治療[10]，然而像銅綠假單胞菌這類細(xì)菌由于具有多重耐藥機(jī)制，常導(dǎo)致抗生素治療的失敗[11]。因此，開發(fā)新的抗菌藥物和尋找天然具有抗菌作用的替代物是臨床治療的理想選擇[12]。

在其他條件一致的情況下，夏茶含有更高的茶多酚、咖啡堿、兒茶素等成分[13-14]，這些成分正是茶提取物中的主要活性成分[15]。夏茶產(chǎn)量高，但是由于飲用口感不佳，銷售價(jià)格不高，茶農(nóng)不愿采摘，常常造成資源的浪費(fèi)[16-17]。本試驗(yàn)基于夏茶的這一特點(diǎn)，從貴州特色茶樹品種[18-19]中篩選抗菌效果好的品種，并針對(duì)抗菌成分進(jìn)行多指標(biāo)提取工藝研究，為利用夏茶開發(fā)抗菌藥物或抑菌產(chǎn)品提供支持。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)品種為黔茶1號(hào)（QC1H）、黔湄601（QM601）和黔湄419（QM419）3個(gè)貴州特色茶樹品種和福鼎大白茶（FD），于2022年5月31日下午采自貴州省遵義市湄潭縣貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所象山茶園，采摘標(biāo)準(zhǔn)均為一芽三葉。試驗(yàn)供試菌株：金黃色葡萄球菌CMCC 26003（Staphylococcus aureus）菌株、銅綠假單胞菌CMCC 10104（Pseudomonas aeruginosa）菌株和大腸桿菌CMCC 44102（Escherichia coli）菌株，購自南京樂診生物技術(shù)有限公司。

1.2? 試劑與儀器

1.2.1? 試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，上海博微生物科技有限公司；甲醇（分析純）、無水乙醇（分析純），富宇化工有限公司；咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼思特生物科技有限公司；抗壞血酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉，德國Biofroxx；乙腈（色譜級(jí)），湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2.2? 主要儀器與設(shè)備

ME203T/02電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX-100-B-Z恒溫培養(yǎng)箱，上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HHS-21-4恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SpectraMax ABS Plus酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司；島津LC-2030C Plus高效液相色譜儀，日本島津株式會(huì)社；XBridge C18色譜柱，美國沃特世公司。

1.3? 試驗(yàn)方法

1.3.1? 制樣方法

茶青采用滾筒殺青機(jī)210 ℃殺青，80 ℃烘干至恒重，制得綠茶樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，密封低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2? 提取方法

參考陳峰等[20]的方法，取10 g茶葉樣品用250 mL水或甲醇在70 ℃水浴鍋中浸提10 min，4 ℃，3 800 r/min離心20 min，取上清液并用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35 ℃進(jìn)行濃縮，濃縮后得到的浸膏用無水乙醇定容至100 mL，密封低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3? 抑菌圈的測定

采用雙層平板法，將菌液加入固體培養(yǎng)基中并調(diào)節(jié)菌體含量為1×105 CFU/mL，牛津杯打孔，待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯，在每個(gè)孔中注入100 μL茶葉提取物。將平板置于冰箱中過夜后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后測定并記錄抑菌圈大小，用溶劑做空白對(duì)照，重復(fù)3次。

1.3.4? 綠茶提取物成分檢測

總酚、總黃酮含量按照蘇州格銳思生物科技有限公司試劑盒進(jìn)行測定；兒茶素組分含量按照《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018）[21]進(jìn)行測定；咖啡堿含量參照《茶 咖啡堿測定》（GB/T 8312—2013）進(jìn)行測定。

1.3.5? 提取工藝單因素試驗(yàn)

參考盧利平等[22]的方法稍作修改，設(shè)浸提時(shí)間（A）、浸提溫度（B）、料液比（C）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（D）4個(gè)因素，各因素水平設(shè)定如下，每個(gè)水平3次重復(fù)。測定各處理總酚、總黃酮、兒茶素類、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）的浸出量。

浸提時(shí)間（A）試驗(yàn)：提取溫度70 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液質(zhì)量體積比1∶25，浸提時(shí)間設(shè)6、8、10、12、14 min 5個(gè)水平。

浸提溫度（B）試驗(yàn)：甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間10 min，料液比1∶25，浸提溫度設(shè)40、50、60、70、80 ℃ 5個(gè)水平。

料液比（C）試驗(yàn)：提取溫度70 ℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間10 min，料液比設(shè)1∶25、1∶50、1∶75、1∶100等4個(gè)水平。

甲醇體積分?jǐn)?shù)（D）試驗(yàn)：提取溫度70 ℃，提取時(shí)間10 min，料液比1∶25，甲醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)60%、70%、80%、90%、100% 5個(gè)水平。

1.3.6? ?提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比和甲醇體積分?jǐn)?shù)這4個(gè)因素的不同水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），以總酚、總黃酮、兒茶素類、EGCG、ECG和EC的浸出量為指標(biāo)，采用因子分析法計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，并計(jì)算綜合評(píng)分，篩選出最佳工藝方案。

1.4? 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 26軟件，數(shù)據(jù)處理、繪圖使用Microsoft Excel軟件。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 抑菌圈測定結(jié)果

對(duì)抑菌圈的大小進(jìn)行測量，結(jié)果如表2所示。在4個(gè)茶樹品種中，黔茶1號(hào)提取物的抑菌效果最強(qiáng)；小葉種的黔茶1號(hào)和福鼎大白茶比大葉種的黔湄601和黔湄419對(duì)于金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果更好；黔湄419抑菌效果在4個(gè)品種中最差。

2.2? 綠茶提取物成分檢測

對(duì)4個(gè)茶樹品種2種溶劑共8個(gè)提取物樣品的抗菌相關(guān)成分進(jìn)行含量測定，結(jié)果如圖1所示?？偡?、總黃酮、兒茶素類、EGCG、ECG、EC的含量均為黔茶1號(hào)綠茶醇提取物最高，表沒食酯兒茶素（EGC）、兒茶素（C）和咖啡堿（CAF）含量則是黔湄601綠茶醇提取物含量最高。根據(jù)相似相溶原理，分子結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致其在不同極性溶劑中的溶解度不同，其中多酚類成分主要溶解在中、高極性的溶劑中[23]。

對(duì)所測各成分含量與抑菌圈大小進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。3種菌抑菌圈大小與兒茶素類和EGCG的含量均表現(xiàn)出極顯著相關(guān)，與總酚、總黃酮和ECG的含量表現(xiàn)為極顯著相關(guān)或顯著相關(guān)，只有大腸桿菌抑菌圈大小與EC含量表現(xiàn)出顯著相關(guān)，其他成分則相關(guān)關(guān)系不顯著。因此在后續(xù)試驗(yàn)中選擇總酚、總黃酮、兒茶素類、EGCG、ECG和EC作為黔茶1號(hào)醇提工藝研究的指標(biāo)成分。

2.3? 提取工藝單因素試驗(yàn)

2.3.1? 浸提時(shí)間對(duì)提取工藝的影響

如圖2-A所示，在6～12 min內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，總酚、兒茶素類、總黃酮、EGCG和ECG提取量呈上升趨勢，當(dāng)提取時(shí)間為12 min時(shí)，成分含量達(dá)到最大，分別為253.79、197.67、75.75、85.91、35.53 mg/g；12 min后提取量開始逐漸下降。EC提取量在6～14 min之間則呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，最大提取量為15.42 mg/g。綜合考慮各成分含量與相關(guān)性程度，后續(xù)選擇浸提時(shí)間11、12、13 min進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.2? 浸提溫度對(duì)提取工藝的影響

如圖2-B所示，在40～70 ℃之間，總酚、兒茶素類、總黃酮、EGCG、ECG和EC浸提量呈逐漸上升的趨勢，當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)，各成分含量達(dá)到最大，分別為240.70、191.88、62.00、83.39、34.58、13.61 mg/g；繼續(xù)升高提取溫度至80 ℃各成分含量開始逐漸降低。因此后續(xù)選擇浸 提溫度65、70、75 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.3? 料液比對(duì)提取工藝的影響

如圖2-C所示，在料液比為1∶25～1∶100之間，隨著溶劑的增加，EGCG、ECG和EC的浸提量呈逐漸減少的趨勢；總酚、總黃酮和兒茶素類成分的浸出量呈先減后增的趨勢，且料液比1∶25與1∶100處理成分提取量差異不顯著，因此綜合考慮溶劑使用量與成本，選擇料液比1∶20、1∶25、1∶30進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.4? 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取工藝的影響

如圖2-D所示，甲醇體積分?jǐn)?shù)在60%～70%之間時(shí)，隨著體積分?jǐn)?shù)的升高，總酚、兒茶素類、總黃酮、EGCG、ECG和EC的浸出量上升，在70%時(shí)達(dá)到最大值，分別為240.70、191.88、62.00、83.39、34.58、13.61 mg/g。繼續(xù)升高甲醇體積分?jǐn)?shù)，各成分提取量開始降低，因此后續(xù)選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)65%、70%、75%進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.4? 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用正交試驗(yàn)優(yōu)選黔茶1號(hào)醇提工藝，以提取物中總酚、總黃酮、兒茶素類、EGCG、ECG和EC成分的含量為指標(biāo)，以浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比和甲醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝研究。各指標(biāo)評(píng)分權(quán)重根據(jù)因子分析法 計(jì)算分別為總酚占17%、總黃酮占17%、兒茶素類占17%、EGCG占15%、ECG占18%、EC占15%，綜合評(píng)分（Y）=0.17（A－Amin）/（Amax－Amin）+0.17（B－Bmin）/（Bmax－Bmin）+0.17（C－Cmin）/（Cmax－Cmin）+0.15（D－Dmin）/（Dmax－Dmin）+0.18（E－Emin）/（Emax－Emin）+0.15（F－Fmin）/（Fmax－Fmin）。其中A為總酚含量，B為總黃酮含量，C為兒茶素類含量，D為EGCG含量，E為ECG含量，F(xiàn)為EC含量。正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果見表4和表5。從表中可知最佳工藝結(jié)果為A2B2C2D3，即提取時(shí)間12 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶25，甲醇體積分?jǐn)?shù)75%。其中影響抗菌相關(guān)成分浸出量的因素主次為D＞A＞B＞C，即甲醇體積分?jǐn)?shù)＞浸提時(shí)間＞浸提溫度＞料液比，其中浸提時(shí)間與甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醇提工藝的影響顯著。

2.5? 樣品驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證工藝的可行性和合理性，以上述確定的最佳提取工藝條件，平行試驗(yàn)3次，檢測結(jié)果見表6。在此工藝條件下，總酚、總黃酮、兒茶素類、EGCG、ECG和EC的浸出量分別為（260.69±3.28）、（63.54±1.60）、（233.99±1.73）、（100.20±2.85）、（46.27±1.24）、（28.32±0.81） mg/g?？梢姡继崛∥镏械目偡?、總黃酮、兒茶素、EGCG、ECG和EC的含量基本穩(wěn)定且與正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)基本吻合，RSD值均在5%以內(nèi)，表明該優(yōu)選工藝條件可行。

3? 小結(jié)與討論

茶葉中成分復(fù)雜多樣，不同品種、不同加工方式往往使得茶葉中的各成分含量也會(huì)存在巨大差異[19]。目前相關(guān)研究多集中于EGCG成分功能的研究[20-22]，但茶葉的特定功能是多種成分相互影響、共同作用表現(xiàn)出來的綜合效果，因此若以單一指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)選往往不能保證整體質(zhì)量，對(duì)指標(biāo)成分進(jìn)行合理篩選才是提取工藝選擇的關(guān)鍵[23]。前部分試驗(yàn)表明，黔茶1號(hào)對(duì)于金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌的抗菌效果均為最佳，且對(duì)于金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果強(qiáng)于大腸桿菌。

總酚、總黃酮、兒茶素、EGCG、ECG和EC是綠茶提取物中具有抗菌功能的主要成分，因此本試驗(yàn)后續(xù)選擇上述成分為指標(biāo)，基于正交試驗(yàn)整體優(yōu)選提取工藝。利用因子分析法對(duì)指標(biāo)成分賦權(quán)并采用Hassan法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理，使得結(jié)果客觀科學(xué)，避免了主觀因素對(duì)結(jié)果的干擾。本研究所試品種中黔茶1號(hào)醇提取物的抑菌效果最強(qiáng)，優(yōu)選的抑菌成分醇提工藝為：浸提時(shí)間12 min、浸提溫度70 ℃、料液比1∶25、甲醇體積分?jǐn)?shù)75%。在相關(guān)研究中，陳峰等[20]所得到的茶多酚最佳提取工藝為：甲醇體積分?jǐn)?shù)66%、提取溫度70 ℃、浸提時(shí)間10 min、料液比1∶25，除提取時(shí)間要縮短2 min外，其余工藝條件與本研究所得結(jié)果一致。這可能是由于所選用的材料不同，而且選取的指標(biāo)成分種類、數(shù)量也有所差異，分析方法也不相同所導(dǎo)致的。

本研究以貴州特色茶樹品種綠茶提取物為研究材料，發(fā)現(xiàn)其中黔茶1號(hào)品種的抑菌效果最佳，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)提取物對(duì)所試菌種抑菌效果與其中的總酚、總黃酮、兒茶素類、EGCG、ECG與EC成分的含量相關(guān)。并對(duì)黔茶1號(hào)綠茶抗菌成分的甲醇提取工藝進(jìn)行了研究，經(jīng)驗(yàn)證合理可行，為黔茶1號(hào)的研究與推廣提供支持，并為研究利用夏茶開發(fā)抗菌藥物或抑菌產(chǎn)品開拓了思路。本研究的不足之處在于主要是針對(duì)目前相關(guān)研究中已證明有抗菌作用的成分進(jìn)行了測定比較，然而目前茶葉中已分離出2 000多種化合物[24]，仍然有很大一部分未鑒定出結(jié)構(gòu)，因此茶葉中可能還存在抗菌效果顯著但含量不高的成分，值得進(jìn)一步挖掘。

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基金項(xiàng)目：遵義市科技支撐類項(xiàng)目（遵市科合支撐NS〔2020〕25號(hào)）、貴州省人才辦“貴州省特色植物種質(zhì)資源利用與創(chuàng)新人才基地”（RCJD2018-14）

作者簡介：殷一明，男，碩士研究生，主要從事生物技術(shù)與工程方面的研究。*通信作者，E-mail：wenjia_zheng@126.com