陳亮，唐堅(jiān)，褚永權(quán)，葉劍宏，沈超，錢曉宇，姚旭楓

胰腺癌臨床表現(xiàn)隱匿、早期診斷困難、容易發(fā) 生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是預(yù)后很差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，總體五年生存率約10%[1]。盡管手術(shù)切除是唯一可能的治愈手段，但由于早期癥狀不典型、易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，大部分胰腺癌患者就診時(shí)已無法行根治性切除[2-3]。而且接受了手術(shù)治療，其預(yù)后仍然不是十分理想。

大黃素具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用，Liu 等[4]報(bào)道大黃素可通過多種途徑抑制胰腺癌細(xì)胞的生長，起到抗癌作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。DNA 甲基化是指在 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的催化下，對CG 二核苷酸的胞嘧啶進(jìn)行化學(xué)修飾，使其成為5-甲基胞嘧啶（5mc），DNMTs在腫瘤中的表達(dá)增強(qiáng)，引起高甲基化抑癌基因失活，最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生[5]。目前最常用的去甲基化藥物主要包括核苷類似物地西他濱和5AzA-cdR，在低濃度下通過抑制DNMT 活性發(fā)揮去甲基化作用[6]。本文主要研究大黃素對胰腺癌細(xì)胞基因組5mc 的影響，及對抑癌基因ppENK啟動子區(qū)CpG島的去甲基化作用，探討大黃素是否可以通過降低5mc 的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)ppENK 的甲基化狀態(tài)，從而使其重新表達(dá)生物活性。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 大黃素、5AzA-cdR 購自sigma，CCK-8 試劑盒購自Gibco，細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心菌株型）購自上海杰瑞生物工程有限公司，EpiTect?MSP 套件購自QIAGEN。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系和培養(yǎng) 本課題組引進(jìn)并保存胰腺癌細(xì)胞系Panc1 細(xì)胞株，培養(yǎng)于胎牛血清、鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，飽和水分和5%CO2條件下生長，每2 ～4 d 換一次培養(yǎng)基，當(dāng)生長到70%～80%時(shí)傳代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8） 取對數(shù)生長期的Panc1 細(xì)胞，每孔接種5×103/100l 細(xì)胞于96 孔板中，分別使用濃度為0、10、20、40 及80l 的大黃素處理細(xì)胞24、48、72 h。用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長下的吸光度值（OD 值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值）×100%。

1.2.3 Dot-blot 各組作用于Panc1 細(xì)胞72 h后，用細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒按照說明提取各組DNA，使用HS dsDNA Kit和Qubit Fluormete（rInvitrogen）通過熒光測定術(shù)來測定DNA 的濃度。Dotblot 過程參考文獻(xiàn)[7]的方法。

1.2.4 mRNA-Seq Panc1 細(xì)胞用0、10、20及40mol/L大黃素和1mol/L 5AzA-cdR 處理72 h，然后用TRIzol?試劑提取每組總RNA，從5g 真核總RNA 開始。磁珠法分離mRNA，離子裂解mRNA，用TruseqTMRNA 樣品制備試劑盒合成雙鏈cDNA，連接index linker，經(jīng)PCP 富集后，用2%的瓊脂糖膠回收目的條帶，TBS380（Picogreen）定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機(jī)，cBot 上橋式擴(kuò)增，用Truseq SR Cluster Kit v3-cBot-HS 生成clusters，Hiseq2000 測序平臺，進(jìn)行1*50 bp 測序?qū)嶒?yàn)[Hiseq2000 Truseq SBS Kit v3-HS（50cycles）]。

1.2.5 DNA的提取與亞硫酸鹽修飾 使用Cell/Tissue Genomic DNA Extraction Kit 按照說明書分別提取DNA，檢查DNA 的純度和濃度后，取1g DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，修飾過程按照EpiTect的說明書進(jìn)行，最后修飾的DNA 溶于30l 的Buffer EB 溶液中，立即用于PCR 反應(yīng)或保存于-20℃冰箱備用。

1.2.6 甲基化特異性PCR（MSP） 根據(jù)EpiTect?MSP Kit 試劑盒說明要求，PCR 反應(yīng)體系結(jié)束后，取10l PCR產(chǎn)物，經(jīng)含GoldViewI型核酸染色劑的2%瓊脂糖凝膠電泳45min，電泳結(jié)束后紫外拍照分析。1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析和t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對胰腺癌細(xì)胞的生長抑制作用 大黃素可以抑制Panc1 細(xì)胞的生長，表現(xiàn)為時(shí)間和濃度梯度形式。40mol/L 處理72h 后，生長抑制率為49.4%，80mol/L處理72h后，其抑制率達(dá)到了64.4%，見圖1。鑒于藥物的去甲基化作用通常在相應(yīng)較低的藥物濃度下，不會對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，因此大黃素的濃度選擇為0、10、20 和40mol/L，用于后續(xù)研究。

圖1 不同濃度大黃素對Panc1 的抑制作用

圖2 不同濃度大黃素對5mc、5hmc 表達(dá)的影響

2.3 不同濃度大黃素對ppENK 甲基化的影響 0、10、20 及40mol/L的大黃素作用于胰腺癌細(xì)胞48、72 h 后，ppENK 基因甲基化條帶表達(dá)有不同程度的減弱，非甲基化條帶由幾乎不表達(dá)到有不同程度的表達(dá)，且有隨著藥物濃度增加表達(dá)逐漸增多的趨勢，對照組5AzA-cd 作用明顯強(qiáng)于大黃素組。同一濃度的大黃素分別作用于胰腺癌細(xì)胞48、72 h，其甲基化條帶隨著時(shí)間有遞減的趨勢，非甲基化條帶具有增加的趨勢，見圖4。

圖4 不同濃度大黃素對ppENK 甲基化的影響

3 討論

胰腺癌是惡性程度最高的消化系統(tǒng)腫瘤之一，是目前美國癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，其全球負(fù)擔(dān)在過去幾十年間增加了一倍以上[8-10]。大黃素可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡[11]、抑制新生血管形成[12]，與吉西他濱合用可提高胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性，但具體機(jī)制尚不十分清楚。本研究結(jié)果表明，大黃素可以通過去甲基化作用進(jìn)而影響全基因組的表達(dá)，尤其是通過降低ppENK的甲基化水平發(fā)揮抗癌作用，闡明了大黃素抗腫瘤的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。

胰腺癌抑癌基因的啟動子區(qū)CpG 島甲基化被認(rèn)為是表達(dá)失活的主要原因之一[13]。ppENK 基因與腫瘤細(xì)胞生長遲緩有關(guān)，ppENK 基因位于8q23-24，由4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子組成。ppENK 基因編碼的產(chǎn)物是阿片類生長因子[14]。對包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤都具有生長抑制功能，在胰腺癌細(xì)胞中檢測到ppENK 的高甲基化。Ueki 等[15]報(bào)道了11 種胰腺癌細(xì)胞系ppENK全甲基化，胰腺癌病理標(biāo)本中ppENK 甲基化水平顯著高于正常胰腺組織，表明CpG 島的甲基化與ppENK 表達(dá)的失活有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，大黃素、5-AzA-cdR 可以顯著地降低Panc1 細(xì)胞ppENK 的甲基化水平，但是大黃素作用強(qiáng)度要稍微弱于5-AzA-cdR。

本研究結(jié)果顯示大黃素可以隨著時(shí)間和濃度梯度抑制胰腺癌細(xì)胞的生長。當(dāng)80mol/L 大黃素作用于Panc1 細(xì)胞72 h 后，生長抑制率為64.4%，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，這與以往相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，但40mol/L時(shí)其抑制率為49.4%，細(xì)胞學(xué)形態(tài)學(xué)無明顯變化，故選擇0、10、20 及40mol/L的大黃素藥物濃度實(shí)驗(yàn)。

DNA CpG 島甲基化（5mc）對基因轉(zhuǎn)錄沉默，基因組印跡和X染色體的失活等發(fā)揮了不可或缺的作用，但是最新研究熱點(diǎn)主要集中在5hmc 上。5hmc由Ten-eleven translocation 酶（TET 酶）催化5mc 氧化而來，TET 酶主要有TET1、TET2、TET3[16]，5hmc的具體功能不是很清楚，被認(rèn)為可能是完成由5mc到C 去甲基化過程中的一個(gè)中間體，許多腫瘤組織中5hmc 的表達(dá)較正常組織相比明顯減少。本實(shí)驗(yàn)Dot-blot 結(jié)果示40mol/L 的大黃素和1mol/L 的5AzA-cdR 可顯著減少5mc 的表達(dá)，但是各濃度用藥組對5hmc的表達(dá)均無明顯差異，說明大黃素可以通過抑減少5mc 的生成、降低5mc 的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)ppENK的甲基化狀態(tài)，從而使其重新表達(dá)生物活性。