張強，樊鈺瑩，王立偉，劉倬希

1.牡丹江醫(yī)學院臨床學院，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院消化內科，黑龍江牡丹江 157011

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是一種常見的胰腺外分泌炎癥性疾病，可導致嚴重腹痛和多器官功能障礙，還可能導致胰腺壞死和持續(xù)性器官衰竭，病死率為1%~5%，盡管以往進行了許多隨機研究，對發(fā)病機制的理解有所進步，但仍沒有特定的治療方法[1]。缺乏針對AP的特異性治療，破譯其發(fā)病機制的分子機制可能有助于治療干預。炎癥的級聯(lián)反應是促使急性胰腺炎由發(fā)病進展為急性重癥胰腺炎的主要原因，是由TOLL樣受體（toll like receptor, TLR）核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）激活和在腺泡細胞中產(chǎn)生的細胞因子啟動的，在急性胰腺炎早期，NF-κB增加多種促炎基因的表達，增加血管通透性并誘發(fā)血栓形成和出血，最終導致組織壞死[2-3]，因此，減少NF-κB活化和促炎介質可能是減輕AP的良好治療策略。利膽清胰湯是治療急性胰腺炎之效方，體現(xiàn)疏肝利膽、瀉熱通腑法則，已證明其可以改善AP患者的胰腺和腸道損傷[4]，然而，利膽清胰湯對AP影響的確切機制尚未完全闡明。薈萃分析顯示，利膽清胰湯可抑制NF-kB活性，從而抑制炎癥因子釋放并保護細胞免受損傷[5]。本研究2020年10月—2021年4月在牡丹江醫(yī)學院臨床學院對30只C57BL/6雄性小鼠進行實驗研究，旨在探討利膽清胰湯對雨蛙素重復腹腔注射誘導的小鼠急性胰腺炎模型的保護作用，以及對NF-κB通路的調控機制，為臨床治療提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性 C57BL/6小鼠（年齡：6周，體質量：15~20 g）購自實驗動物研究中心。所有動物飼養(yǎng)在環(huán)境溫度為（23±2）℃和12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的氣候控制室中。所有小鼠都喂食標準實驗室食物，允許在標準條件下通過空氣過濾隨意飲水，并允許在誘導胰腺炎之前適應新環(huán)境7 d，將C57BL/6雄性小鼠30只隨機分為正常組、模型組和利膽清胰湯組，每組10只，正常組小鼠體質量15~19 g，平均（18.44±3.22）g；模型組小鼠體質量15~20 g，平均（18.96±3.74）g；利膽清胰湯組小鼠體質量15~20 g，平均（18.84±3.56）g。3組小鼠一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準。

1.1.2 試劑與藥物 茵陳、川芎、白芍、大黃各15 g，遏藍菜、延胡索、守田、枳實各12 g，郁金、柴胡各10 g，芒硝、黃芩、陳皮、木香、紅花各9 g，桃仁8 g，甘草、龍膽草各6 g。藥品及熬制湯劑均由本院中藥房提供。血清淀粉酶、髓過氧化物酶（myeloper‐oxidase, MPO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，蘇木精、伊紅和HEPES購自Sigma。針對NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3）、半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein, ASC）、磷酸化p65抗體購自Cell Signaling Technology，HRP標記羊抗鼠二抗購自 anta Cruz Biotechnology。

1.2 方法

C57BL/6雄性小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后開始實驗，正常組小鼠以等量生理鹽水進行腹腔內注射，模型組和利膽清胰湯組小鼠按50 μg/kg,100 μl/（次·只）腹腔內注射雨蛙素，注射1次/h，共8次，利膽清胰湯組小鼠按照“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表”折算利膽清胰湯給藥劑量，共分為3次給藥，第1次給藥是在第1次腹腔注射雨蛙素1 h后，第2次給藥是在第8次腹腔注射雨蛙素1 h后，第3次給藥在第8次腹腔注射雨蛙素24 h后，正常組和模型組小鼠灌服等量0.9%雙蒸水溶液。觀察模型組小鼠疼痛行為（舔/抬后爪和跳躍），于末次注射3 h后麻醉處死小鼠，之后立即收集胰腺和血液樣本用于進一步檢查。

1.3 觀察指標

①疼痛行為觀察：記錄小鼠在30 s內疼痛行為（舔/抬后爪和跳躍）第一次出現(xiàn)時間。

②血清淀粉酶和髓過氧化物酶（MPO）活性：使用淀粉酶比色測定試劑盒（Sigma，St Louis，MO）測定血清的α-淀粉酶活性。

③組織病理學變化：小鼠胰腺在10%福爾馬林中固定至少24 h，然后包埋在石蠟中。通過標準程序對約4 μm胰腺切片進行蘇木精-伊紅（H/E）染色處理。用于光學顯微鏡下的組織學檢查。對代表每組至少100個視野的胰腺切片進行隨機半定量評估。對胰腺進行了炎癥（浸潤性炎癥細胞）和水腫（腺泡細胞分離）評分。每個測試都按照從0（正常）~3（嚴重）的等級評分。

④Nf-κB信號通路相關蛋白檢測：免疫印跡法檢測胰腺組織中NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3），半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1），凋亡相關斑點樣蛋白（ASC），磷酸化p65以及總p65蛋白。組織在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的蛋白質裂解緩沖液中勻漿。使用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。蛋白質樣品（50 μg）通過還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，然后在4℃下轉移到PVDF膜上過夜。膜在含5%脫脂牛奶的Tris 緩沖鹽水中封閉，棄去封閉液加入NLRP3，Cas‐pase1、ASC、磷酸化p65、一抗進行雜交，于4℃反應過夜，隨后與二抗HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG二抗一起孵育1h，化學發(fā)光顯影，內參定量分析。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，采用F檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠疼痛行為第1次出現(xiàn)時間比較

與對照組小鼠相比，模型組小鼠疼痛行為第1次出現(xiàn)的時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組相比，利膽清胰湯組小鼠疼痛行為第1次出現(xiàn)的時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組小鼠疼痛行為第1次出現(xiàn)時間比較[(±s)，s]

注：*表示與對照組比較，P<0.05；#表示與模型組比較，P<0.05。

組別對照組（n=10）模型組（n=10）利膽清胰湯組（n=10）F值P值疼痛行為第一次出現(xiàn)的時間24.19±4.69（16.68±3.83）*（25.91±5.52）#10.766 0.002

2.2 各組小鼠血清淀粉酶、MPO水平比較

與對照組小鼠相比，模型組小鼠血清淀粉酶、MPO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組相比，利膽清胰湯組小鼠血清淀粉酶、MPO水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 各組小鼠血清淀粉酶、MPO水平比較(±s)

表2 各組小鼠血清淀粉酶、MPO水平比較(±s)

注：*表示與對照組比較，P<0.05；#表示與模型組比較，P<0.05。

組別對照組（n=10）模型組（n=10）利膽清胰湯組（n=10）F值P值血清淀粉酶（IU/L）265.41±78.96（1246.87±185.69）*（596.69±126.98）*#131.576<0.001 MPO（ng/mL）1.78±0.64（2.79±0.41）*（1.92±0.55）#10.206 0.003

2.3 各組小鼠胰腺組織病理評分比較

與對照組相比，模型組小鼠胰腺組織損傷明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組相比，利膽清胰湯組小鼠胰腺組織損傷明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表3 各組小鼠胰腺組織病理評分比較[(±s)，分]

表3 各組小鼠胰腺組織病理評分比較[(±s)，分]

注：*表示與對照組比較，P<0.05；#表示與模型組比較，P<0.05。

組別對照組（n=10）模型組（n=10）利膽清胰湯組（n=10）F值P值水腫0.30±0.15（2.67±0.21）*（1.82±0.34）#237.371<0.001炎性細胞浸潤0.25±0.22（2.71±0.24）*（2.00±0.33）#265.843<0.001

2.4 各組小鼠胰腺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB p65、NF-κB p65比較

與對照組相比，模型組小鼠胰腺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、p- NF-κB p65表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組相比，利膽清胰湯組小鼠胰腺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB p65表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但各組小鼠非磷酸化NF-kB-p65蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表4。

表4 各組小鼠胰腺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB p65、NF-κB p65比較(±s)

表4 各組小鼠胰腺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB p65、NF-κB p65比較(±s)

注：*表示與對照組比較，P<0.05；#表示與模型組比較，P<0.05。

組別對照組（n=10）模型組（n=10）利膽清胰湯組（n=10）F值P值NLRP3 0.62±0.10（1.47±0.15）*（0.99±0.12）#116.183<0.001 caspase-1 0.35±0.08（1.19±0.10）*（0.77±0.12）#171.818<0.001 ASC 0.28±0.06（1.89±0.26）*（0.92±0.10）#242.771<0.001 p-NF-κB p65 0.09±0.04（0.57±0.10）*（0.24±0.08）#100.500<0.001 NF-κB p65 0.48±0.09 0.50±0.08 0.49±0.10 0.122 0.886

3 討論

AP的發(fā)病過程涉及多種因素[6-7]，目前準確的機制尚不清楚。有證據(jù)表明，促炎細胞因子是急性胰腺炎的介質，通過減少早期細胞因子的級聯(lián)反應并改善疾病及其全身并發(fā)癥，對于AP的治療至關重要[8]。雨蛙素是膽囊收縮素的類似物，大劑量使用導致白細胞廣泛浸潤，淀粉酶產(chǎn)生過多，進而誘發(fā)AP的發(fā)生[9]。本研究結果表明，雨蛙素誘導的AP顯示出更急性的胰腺炎模型，胰腺炎癥惡化，血清細胞因子水平升高，以及劇烈的全身炎癥反應。說明建模成功。利膽清胰湯是一種中草藥制成的口服制劑，在AP患者中，能夠緩解患者術后疼痛、減少炎癥反應[10]，在實驗性AP模型中，可以改善微循環(huán)障礙和胰腺、腸道的損傷[11]。本研究中通過利膽清胰湯可以明顯改善雨蛙素誘導AP小鼠胰腺組織損傷，降低血清淀粉酶、MPO活性，縮短疼痛行為，可見，用利膽清胰湯可能是治療AP的一種有效的藥物。

NLRP3炎性小體介導了機體對微生物感染和細胞損傷的免疫應答，是多種疾病病理生理機制的重要組成部分。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除NLRP3炎癥體組分NLRP3、ASC、caspase-1基因，發(fā)現(xiàn)雨蛙素誘導AP的嚴重程度減輕[12-13]。王兵兵等[12]研究顯示，與正常對照組NLRP3、ASC及caspase-1蛋白的相對表達水平分別為（0.62±0.11）、（0.15±0.04）、（0.37±0.05）比較，AP模型組顯著升高[分別為（1.50±0.08）、（1.81±0.07）、（1.11±0.04）]（P<0.05）。本研究顯示與正常對照組NLRP3、caspase-1及ASC蛋白的相對表達水平[分別為（0.62±0.10）、（0.35±0.08）、（0.28±0.06）]比較，雨蛙素誘導AP小鼠NLRP3、cas‐pase-1及ASC蛋白表達明顯增加[分別為（1.47±0.15）、（1.19±0.10）、（1.89±0.26）]（P<0.05），這與以往研究一致，也說明NLRP3炎性小體通路參與AP發(fā)病過程，吳浪等[13]研究發(fā)現(xiàn)AP炎癥過程伴隨NF-κB依賴性抗凋亡基因轉錄激活，降低NF-κB活性和細胞因子水平，也可以抑制NLRP3炎性小體的激活，相關研究顯示，與對照組p-NF-κB p65表達量（0.23±0.02）相比，雨蛙素誘導的AP模型小鼠p-NF-κB p65表達量（0.82±0.02）明顯升高（P<0.05）[14]，本研究發(fā)現(xiàn)在AP小鼠中p-NF-κB p65表達明顯升高，而NF-kB-p65表達無變化，這說明AP炎癥過程伴隨NF-κB通路被激活，而利膽清胰湯干預后p-NF-κB p65表達明顯降低，并降低NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達，這說明利膽清胰湯可通過減少NF-κB的激活和阻斷炎癥因子來預防AP，從而共同降低AP的嚴重程度。

綜上所述，利膽清胰湯通過調節(jié)抑制NF-κB通路與NLRP3炎性小體激活可減輕胰腺組織損傷，降低全身炎性反應。