丁佰娟 張立偉 楊慧 崔秀娟 李南

1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬滕州市中心人民醫(yī)院婦科，滕州 277500；2上海復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011

卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤，5年生存率為48.6%［1-2］。卵巢癌中最常見的病理類型是上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC），占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，其中高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）是卵巢癌中最常見和具有侵襲性的亞型，占卵巢癌亞型的67.5%［3］。由于其發(fā)病早期無明顯癥狀且易轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者診斷時已為晚期，預(yù)后不良［4］。標(biāo)準(zhǔn)化治療是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類加紫杉醇的化學(xué)治療，然而，超過30%的EOC患者對鉑或其他化療藥物耐藥，導(dǎo)致疾病持續(xù)或復(fù)發(fā)［5］。免疫球蛋白超家族成員9（IGSF9）最早被克隆并被鑒定為免疫球蛋白超家族的一員，在人類和小鼠的多種組織中表達(dá)［6-8］。在多種腫瘤中，IGSF9出現(xiàn)表達(dá)變化：在黑色素瘤全基因組表達(dá)譜中，IGSF9在晚期黑色素瘤中表達(dá)約下調(diào)7倍［9］；但是，在膽囊癌中，IGSF9表達(dá)明顯升高，大約是正常膽囊組織的18倍［10］。本研究擬結(jié)合數(shù)據(jù)庫及EOC臨床樣本分析IGSF9在EOC患者中的表達(dá)及其臨床意義，細(xì)胞實驗分析IGSF9對卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，以期為EOC的診治提供新思路。

資料與方法

1.臨床資料

選取2010年6月至2020年6月于滕州市中心人民醫(yī)院婦科就診的EOC患者原發(fā)病灶石蠟樣本76例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴EOC患者術(shù)前未接受任何化療或其他抗腫瘤治療；⑵無其他身體部位腫瘤、盆腔炎癥及卵巢相關(guān)疾病。收集同期具有完整上皮的正常卵巢組織石蠟標(biāo)本30例（因子宮肌瘤等良性疾病行卵巢切除患者）作為對照組。EOC樣本組患者年齡（59.62±1.58）歲，對照組患者年齡（58.34±2.76）歲，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。組織樣本的病理診斷均由滕州市中心人民醫(yī)院的2位主治病理醫(yī)生獨(dú)立確認(rèn)?；颊呦嚓P(guān)的臨床病例信息從滕州市中心人民醫(yī)院病案室獲得，組織樣本收集告知患者并簽署知情同意書。

本研究經(jīng)滕州市中心人民醫(yī)院、上海復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（kyy2021-126）。

2.數(shù)據(jù)庫資料

使用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（GEPIA）網(wǎng)站綜合分析IGSF9 mRNA表達(dá)情況，該網(wǎng)站是由國人開發(fā)用于分析癌組織和正常組織基因表達(dá)譜差異的公共數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)來源于TCGA和GTEx的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)［11］。采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：http： //kmplot.com）分析IGSF9對卵巢癌患者生存期的影響。

3.免疫組化石蠟切片

免疫組織化學(xué)染色過程交由武漢谷歌生物科技有限公司代為完成，兔抗人IGSF9多克隆抗體購買于英國Abcam公司，貨號ab121324，稀釋比1∶100，HRP-山羊抗兔/鼠通用二抗購買于丹麥DAKO公司，貨號K5007，稀釋比1∶1。免疫組化染色結(jié)果分析由2位研究者獨(dú)立完成，評分標(biāo)準(zhǔn)如下。染色強(qiáng)度評分（a）：無著色0分，淡黃色1分，深黃色2分，黃褐色3分；根據(jù)陽性細(xì)胞占該視野面積評分（b）：1分<25%，2分≥25%～50%，3分≥50%～75%，4分≥75%～100%；免疫組化綜合得分=a×b。每張組化切片隨機(jī)觀察5個獨(dú)立的高倍鏡視野，5個觀察區(qū)域的得分平均值為該組織樣本的最終得分，得分≤6分為低表達(dá)，得分>6分為高表達(dá)。

4.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，培養(yǎng)于McCoy 5A（Gibico，USA）培養(yǎng)基，根據(jù)ATCC細(xì)胞培養(yǎng)說明添加10%的胎牛血清（Gibico，USA）和10%的青霉素、鏈霉素。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱（37 ℃，含5% CO2）培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：IGSF9干擾質(zhì)粒慢病毒濃縮液購買于山東維真生物科技公司，質(zhì)粒載體為hRNA pAV-U6-GFP載體克隆，干擾載體序列如下；shRNA1：GGTCGAGGGAAGCCT GAGGTGGT；shRNA2：AATGCCTCCCAGGATGTTTCATT；shRNA3：CCTGCGACCAT TGACCAAGGAGG；shRNA4：GGCAGCTTCGTCAGCGACCCCAG。待細(xì)胞密度達(dá)70%后，將細(xì)胞用胰酶消化傳代，取處于對數(shù)生長狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行實驗。將細(xì)胞消化后均勻接種至6孔板，控制細(xì)胞密度為50%左右。待細(xì)胞過夜貼壁，更換培養(yǎng)基，加入shRNA慢病毒顆粒濃縮液進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素清除未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況，待陽性細(xì)胞占比達(dá)90%以上，收集一部分細(xì)胞用于抽提總RNA，qRT-PCR檢測IGSF9 mRNA表達(dá)情況，挑選干擾效果最佳的IGSF9-shRNA2和IGSF9-shRNA3及shRNA NC陰性對照細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

5.qRT-PCR檢測IGSF9的表達(dá)

TRIzol-酚-氯仿法從新鮮收集的細(xì)胞中提取總RNA。使用TaKaRa公司的mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR036A）配制逆轉(zhuǎn)錄體系，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85 ℃ 5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的qRT-PCR反應(yīng)體系中，選擇TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（Code No.RR820A）進(jìn)行qRT-PCR，根據(jù)操作手冊配制反應(yīng)體系，在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System儀器上進(jìn)行PCR。反應(yīng)步驟一：預(yù)變性95 ℃ 30 s；步驟二：PCR 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT計算IGSF9的相對表達(dá)量，其中CT值為循環(huán)閾值，實驗重復(fù)3次。引物序列如下：IGSF9正向引物5'-GAAGCCTGAGGTGGTATCGG-3'，反向引物5'-CAGCCACTCGATGACATGC-3'；GAPDH正向引物5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，反向引物5'-ACACCA TGTATTCCGGGTCAAT-3'。

6.Transwell小室檢測干擾IGSF9后卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力變化

使用無血清培養(yǎng)基制備IGSF 9-shRNA2和IGSF9-shRNA3及shRNA NC對照3組細(xì)胞的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度為2×105個/ml，取0.2 ml細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入0.5 ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育48 h，取出Transwell小室上室，棉簽擦上室內(nèi)的細(xì)胞，固定后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照計數(shù)，結(jié)果取平均值。

7.統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，以（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.數(shù)據(jù)庫分析IGSF9基因在卵巢癌和正常卵巢組織中的表達(dá)差異

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中檢索IGSF9在33種腫瘤中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，IGSF9在卵巢癌等12種腫瘤中的表達(dá)明顯高于正常組織，而在肝細(xì)胞癌、睪丸生殖細(xì)胞瘤中的表達(dá)明顯低于正常組織，其中在卵巢癌中表達(dá)水平最高，且與正常組織相比差異最大，是正常組織的21.8倍（圖1A）。匹配GTEx數(shù)據(jù)分析顯示，IGSF9在卵巢癌組織中的表達(dá)高于正常對照，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1B）。

圖1 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析數(shù)據(jù)庫分析IGSF9基因的表達(dá)差異。A：IGSF9在人體正常組織和癌組織中表達(dá)差異；B：IGSF9在卵巢癌組織和正常對照組織中的表達(dá)情況

2.IGSF9表達(dá)與EOC患者預(yù)后的相關(guān)性

使用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析IGSF9（Affy ID：229276_at）表達(dá)與EOC患者無進(jìn)展生存期（PFS）和整體生存期（OS）的關(guān)系。PFS分析中滿足條件的病例數(shù)有614例，其中高表達(dá)患者461例，低表達(dá)患者153例；Kaplan-Meier Plotter結(jié)果顯示，高表達(dá)患者死亡風(fēng)險比HR=1.90（1.49～2.43），logrankP=1.6e-07（圖2A）。OS分析中滿足條件的病例數(shù)為655例，其中高表達(dá)患者459例，低表達(dá)患者196例；Kaplan-Meier Plotter結(jié)果顯示，高表達(dá)患者死亡風(fēng)險比HR=1.30（1.04～1.64），log-rankP=0.023（圖2B）。PFS與OS分析均提示高表達(dá)IGSF9為EOC患者預(yù)后不良的預(yù)測因子。

圖2 IGSF9表達(dá)與EOC患者預(yù)后的相關(guān)性。A：IGSF9與EOC患者PFS之間的關(guān)系；B：IGSF9與EOC患者OS之間的關(guān)系

3.免疫組化分析IGSF9在EOC組織樣本中的表達(dá)

免疫組化SP法顯示，IGSF9的蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞膜及胞漿，在EOC組織中高表達(dá)，在正常卵巢組織上皮幾乎不表達(dá)（圖3A）。IGSF9在EOC組織和正常對照卵巢組織的高表達(dá)率分別是69.7%（53/76）和16.7%（5/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖3B）。

圖3 免疫組化SP法分析IGSF9在EOC組織和正常組織中的表達(dá)。A：IGSF9在正常卵巢組織呈陰性表達(dá)，在EOC組織中呈陽性表達(dá)（×200）；B：IGSF9在EOC組織和正常對照卵巢組織的高表達(dá)率

4.IGSF9表達(dá)水平與EOC患者臨床病例特征的關(guān)系

EOC患者組織樣本中IGSF9的蛋白表達(dá)與EOC患者的FIGO分期、腹腔轉(zhuǎn)移及血清CA-125水平有相關(guān)性（均P<0.05），與患者的年齡、腹水量、組織類型及腫瘤長徑無相關(guān)性（均P>0.05），見表1。

5.IGSF9-shRNA對SKOV3細(xì)胞中IGSF9表達(dá)的抑制作用

qRT-PCR結(jié)果顯示，在SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IGSF9-shRNA后，將shRNA-NC組的IGSF9 mRNA表達(dá)水平設(shè)為1.000，shRNA1～4組的IGSF9 mRNA表達(dá)水平分別為（0.320±0.086）、（0.250±0.045）、（0.190±0.075）、（0.350±0.056），均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），選取shRNA-NC組、IGSF9-shRNA2組和IGSF9-shRNA3組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

6.IGSF9對卵巢癌SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

Transwell小室實驗提示，IGSF9-shRNA-2組、IGSF9-shRNA-3組和shRNA-NC組卵巢癌細(xì)胞的每高倍鏡視野的平均穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（64.600±2.993）、（202.200±8.919）和（69.600±6.369）；IGSF9干擾組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而IGSF9-shRNA2組和IGSF9-shRNA3組間的穿膜細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 IGSF9對卵巢癌SKOV3細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力的影響

討論

卵巢癌是發(fā)生于卵巢的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌，病死率卻居女性生殖惡性腫瘤首位［12］。卵巢上皮性腫瘤是一種常見的卵巢腫瘤，發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時已為中晚期，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量［13］。早期患者通過手術(shù)聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的化療可以治愈，但大多數(shù)晚期患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)、對化療耐藥、疾病無進(jìn)展間隔期逐漸縮短，但是對于鉑類藥物具有較好反應(yīng)的患者，可以通過化療控制病情，使卵巢癌成為一種慢性疾病，改善預(yù)后［14］。因此，尋找更好的卵巢癌治療相關(guān)的基因靶點對于改善卵巢癌患者的治療和預(yù)后具有重要的意義。

IGSF9屬于免疫球蛋白超家族成員之一，隸屬于細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）大家族。CAMs介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，也可通過與其他細(xì)胞表面受體或細(xì)胞內(nèi)信號分子的相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［15］。因此，CAMs參與各種生物學(xué)和病理過程，包括細(xì)胞的存活、增殖、分化、遷移、器官發(fā)生、血管生成和炎癥等［16-18］。研究表明，IGSF9在癲癇易感性中起作用，是引起癲癇易感性變化的候選基因之一。根據(jù)IGSF9的表達(dá)譜和外顯子單核苷酸多態(tài)性可導(dǎo)致氨基酸替換，相對不易患癲癇的B6小鼠和對癲癇易感的D2小鼠的IGSF9之間的差異在于IgIV中第411位的谷氨酰胺替換為精氨酸和細(xì)胞質(zhì)尾部871位的脯氨酸替換為絲氨酸［19］。在不同的腫瘤中，IGSF9有表達(dá)差異。Shi等［20］研究表明，在子宮內(nèi)膜癌中，IGSF9的表達(dá)水平顯著高于正常腺細(xì)胞，且高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，但是在黑色素瘤中表達(dá)降低［8］。不同類型癌癥中IGSF9家族蛋白的上調(diào)和下調(diào)對癌癥的進(jìn)展是否有抑制或促進(jìn)作用仍有待確定。

本研究通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，IGSF9在EOC組織中的表達(dá)高于正常對照組織；進(jìn)一步EOC組織樣本免疫組化數(shù)據(jù)表明，IGSF9蛋白在EOC組織中高表達(dá)，在正常卵巢組織上皮幾乎不表達(dá)，并且高表達(dá)與EOC患者較差FIGO分期、腹腔轉(zhuǎn)移及血清CA-125水平升高有相關(guān)性；Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站關(guān)于PFS與OS的分析提示，高表達(dá)IGSF9為卵巢癌患者預(yù)后不良的預(yù)測因子；干擾IGSF9后細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯減弱。以上數(shù)據(jù)均表明，IGSF9可能為EOC患者的促癌因素。

綜上所述，在EOC患者的組織樣本中IGSF9表達(dá)升高，高表達(dá)的IGSF9提示EOC患者傾向于具有較差的臨床病理特征及較差的預(yù)后，并且可能促進(jìn)EOC患者的腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果提示，IGSF9在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中具有促進(jìn)作用，能否成為卵巢癌相關(guān)的治療靶點，仍有待進(jìn)一步研究。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突