胡瑩瑩 ，林雪娟 ，李星慧 ，黃琰鈺 ，黃偉榮

1.福建中醫(yī)藥大學，福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)證研究基地，福建省2011中醫(yī)健康管理協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350122； 2.福建中醫(yī)藥大學附屬晉江中醫(yī)院，福建 晉江 362200

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是慢性胃炎最常見的病因，Hp可長期定植于人體胃黏膜，并引起胃黏膜活動性炎癥反應[1-2]，進而出現(xiàn)消化不良癥狀。中醫(yī)藥在根除Hp、減輕臨床癥狀及改善胃黏膜病理形態(tài)方面具有顯著優(yōu)勢[3-5]。

胃腸道菌群被稱為“微生物器官”，對平衡人體微環(huán)境具有重要意義，通過參與人體生理活動和病理過程調(diào)節(jié)人體健康，并對胃腸道疾病的產(chǎn)生有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，胃內(nèi)菌群的種類和豐度與Hp感染密切相關，Hp感染可改變?nèi)梭w胃腸道菌群的正常結構，增加致病菌數(shù)量，降低腸道內(nèi)有益菌的豐度[6-9]。因此，胃腸道菌群分析可為Hp陽性人群提供重要生物學指標，胃腸道菌群變化特征可作為慢性胃炎中醫(yī)“證”的生物學基礎。

本研究探討Hp感染對慢性胃炎中醫(yī)證素與腸道菌群的影響及中醫(yī)證素與腸道菌群的相關性，為臨床辨治提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2021年3月－2022年1月就診于福建中醫(yī)藥大學附屬晉江中醫(yī)院脾胃科門診及體檢中心的慢性胃炎患者180例，同時選取來自福建中醫(yī)藥大學附屬晉江中醫(yī)院體檢中心的健康志愿者30名作為對照。

1.2 診斷標準

慢性胃炎的診斷標準參照《中國慢性胃炎共識意見（2017年，上海）》[10]。Hp感染的診斷標準參照《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》[11]：13C/14C-尿素呼氣試驗（UBT）、組織學光鏡檢查、快速尿素酶試驗任意1 項診斷為陽性，即可判定為Hp感染。

證素積分診斷標準：參照《證素辨證學》[12]。根據(jù)四診信息在診斷中的權重，以加權閾值法確定病理要素和證素。每一癥狀的輕重以中等程度為準，該癥狀重時其定量診斷值乘1.5，該癥狀輕時乘0.7。各證素的診斷確定以100作為通用閾值，各癥狀對某證素貢獻度之和達到或超過100時即可診斷為該證素。

1.3 納入標準

Hp 陽性組：①符合上述慢性胃炎診斷標準；②符合Hp感染診斷標準；③年齡18～70歲；④1個月內(nèi)未服用過抗生素和質(zhì)子泵抑制劑者；⑤1個月內(nèi)未服用過黃連素、二甲雙胍或益生菌制劑者。

Hp陰性組：①符合慢性胃炎診斷標準；②Hp-；③年齡18～70歲；④1個月內(nèi)未服用過抗生素和質(zhì)子泵抑制劑者；⑤1個月內(nèi)未服用過黃連素、二甲雙胍或益生菌制劑者。

健康組：①年齡18～70歲；②心理健康，身體無明顯不適癥狀；③Hp-；④證素積分均低于70分；⑤常見理化指標如血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、心肌酶、心電圖或B 超等未見異?；驘o器質(zhì)性改變；⑥1個月內(nèi)未服用過抗生素、質(zhì)子泵抑制劑或益生菌制劑者。

1.4 排除標準

①合并心腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴重疾病或影響其生存的嚴重疾病者，如腫瘤或艾滋??；②有嚴重認知障礙、精神病患者；③其他胃腸道疾病患者，如胃癌、腸癌等消化道腫瘤者，慢性腸炎者，合并胃潰瘍或胃大部切除者；④妊娠或哺乳期婦女。

1.5 四診信息采集

參照“600常見癥狀的辨證意義”[13]，結合臨床調(diào)研與專家意見，制訂慢性胃炎四診信息采集表，由2位經(jīng)過培訓的中醫(yī)人員依據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)四診方法進行四診信息采集并記錄。

1.6 樣本采集

采用14C-UBT進行Hp檢測，由福建中醫(yī)藥大學附屬晉江中醫(yī)院電子內(nèi)鏡室指派1名對胃鏡檢查有豐富操作和診斷經(jīng)驗的醫(yī)師進行檢查，得出胃鏡檢查報告。

糞便采集：用取樣棉簽蘸取中段、內(nèi)部糞便樣品，放入糞便采樣管，并于采樣當日移至-80℃冰箱保存。所有樣本送至杭州谷禾健康生物科技有限公司進行腸道微生物高通量測序。

1.7 樣本提取與檢測

利用試劑盒提取樣本DNA，保證DNA濃度、純度滿足二代測序要求。選擇V4區(qū)為測序區(qū)域，使用高保真酶進行PCR擴增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用磁珠對PCR產(chǎn)物進行純化，用2%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，獲取文庫。用Qubit對回收的文庫進行定量，用qPCR進行接頭效率檢測，用Illumina NovaSeq測序。

1.8 數(shù)據(jù)分析流程與方法

測序所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控留下有效數(shù)據(jù)用于下一步分析。數(shù)據(jù)間通過overlap拼接成Tags，通過可操作分類單元（OTU）聚類方法獲得擴增子序列變異（ASV）統(tǒng)計結果，并將原始序列比對回ASVs。使用97%的默認參數(shù)挑選OTU的代表序列，通過qiime2基于silva138數(shù)據(jù)庫對代表序列進行物種注釋，進一步生成OTU列表，在kingdom（界）、phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成?；谖锓N注釋結果及OTUs的豐度信息，進一步行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析，統(tǒng)計并評估菌群物種的豐富度和多樣性。使用R stats 包Kruskal方法比較樣本間或組間各分類水平的差異。LEfSe分析使用線性判別分析（LDA）與非參數(shù)的 Kruskal-Wallis及 Wilcoxon秩和檢驗相結合，檢測各組間分類單位上的差異。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布采用四分位數(shù)法進行描述統(tǒng)計，組間比較采用非參數(shù)檢驗。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

Hp陽性組50例，其中男性26例、女性24例；Hp陰性組130例，其中男性70例、女性60例；健康人30名，其中男性16例、女性14例。年齡最小者18歲，年齡最大者70歲。

2.2 證素分布情況

Hp陽性組常見病位證素依次為：胃、脾和肝。Hp陰性組常見病位證素依次為：胃、肝和脾。Hp陽性組常見病性證素依次為：氣滯、濕、熱、痰、陰虛、陽虛和氣虛。Hp陰性組常見病性證素依次為：熱、陰虛、氣滯、濕、痰、氣虛和陽虛。見表1。

表1 Hp陽性組、Hp陰性組證素分布

2.3 測序數(shù)據(jù)分析

Hp陽性組、Hp陰性組及健康組測序樣本共獲得6 392個OTUs，其中，3組共有的OTUs 5 241個，Hp陽性組特有OTUs 35個，Hp陰性組特有OTUs 261個，健康組特有OTUs 131個，說明不同組間存在大部分重合的群落。見圖1。

圖1 3組受試者OTU韋恩圖

2.4 多樣性分析

2.4.1 Alpha多樣性分析結果

Hp陽性組Simpson和Shannon指數(shù)均低于Hp陰性組和健康組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明3組樣本在群落豐富度和群落異質(zhì)性上差異不顯著。見圖2。

圖2 3組受試者Alpha多樣性組間比較

2.4.2 Beta多樣性Anosim檢驗結果

考慮到物種差異，使用非加權距離的Anosim分析，結果R=0.053，R值介于（-1，1）之間，說明不同組間菌群結構存在差異，且組間差異大于組內(nèi)差異；P=0.03，表示差異有統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 3組受試者非加權距離Anosim分析

2.5 組間物種組成情況

2.5.1 門水平組成分析

門水平上，3組絕大部分OTU屬于10個門，從高到低依次為：擬桿菌門Bacteroidota、厚壁菌門Firmicutes、 變形菌門Proteobacteria、 梭桿菌門Fusobacteria、放線菌門Actinobacteriota、脫硫桿菌門Desulfobacterota、疣微菌門Verrrucomicrobia、巴氏桿菌門Patescibacteria、彎曲桿菌門Campilobacterota、互養(yǎng)菌門Synergistota。另外還有一些未識別分類的物種統(tǒng)一歸于一個門unidentified。見圖4。

圖4 3組受試者糞便樣本菌群門水平相對豐度

3組優(yōu)勢菌門在構成上基本一致，但在豐度上存在差異：Hp 陽性組變形菌門Proteobacteria 的豐度高于Hp陰性組和健康組（P＞0.05），梭桿菌門Fusobacteria的豐度低于Hp陰性組和健康組（P＞0.05）。見圖5。

圖5 3組受試者糞便樣本菌群門水平組成

2.5.2 屬水平組成分析

3組樣本在優(yōu)勢菌屬上的構成相似，排名前10位的優(yōu)勢菌屬由高到低依次為：擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f、普雷沃氏菌屬Prevotella、糞桿菌屬Faecalibacterium、巨單胞菌屬Megamonas、考拉桿菌屬Phascolarctobacterium、 副 擬 桿 菌 屬Parabacteroides、梭桿菌屬Fusobacterium、羅氏菌屬Roseburia、毛螺菌屬Lachnospira、屬于毛螺菌科的Eubacterium_eligens_group 菌群。組間群落比較，健康組考拉桿菌屬Phascolarctobacterium和梭桿菌屬Fusobacterium的豐度較Hp陽性組和Hp陰性組高，而巨單胞菌屬Megamonas、副擬桿菌屬Parabacteroides在Hp 陽性組表現(xiàn)更為富集。見圖6、圖7。

圖6 3組受試者糞便樣本菌群屬水平相對豐度

圖7 3組受試者糞便樣本菌群屬水平組成

通過Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗對各菌屬進行豐度比較，3組樣本擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f（P＜0.01）、嗜膽菌屬Bilophila（P＜0.05）、厚壁菌門未知菌屬Firmicutes|c（P＜0.05）、經(jīng)黏液真桿菌屬Blautia（P＜0.05）、毛螺菌屬Lachnospira（P＜0.05）、毛旋螺菌科UCG-010 群Lachnospiraceae_UCG-010（P＜0.01）、考拉桿菌屬Phascolarctobacterium（P＜0.05）、薩特氏菌屬Sutterella（P＜0.05）、巴斯德菌科未知菌屬Pasteurellaceae|g（P＜0.01）差異顯著。與健康組比較，Hp陽性組巴斯德菌科未知菌屬Pasteurellaceae|g豐度明顯減少（P＜0.01），擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f、厚壁菌門未知菌屬Firmicutes|c、考拉桿菌屬Phascolarctobacterium上豐度減少（P＜0.05）；Hp陰性組擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f豐度減少（P＜0.01）。與Hp陰性組相比，Hp陽性組經(jīng)黏液真桿菌屬Blautia豐度明顯減少（P＜0.01）， 毛螺菌屬Lachnospira、薩特氏菌屬Sutterella豐度減少（P＜0.05）。 Hp 陽性組毛旋螺菌科UCG-010 群Lachnospiraceae_UCG-010 豐度低于Hp 陰性組（P＜0.05）、健康組（P＜0.01）。見表2。

表2 3組受試者腸道菌群屬水平豐度比較［M（Q1，Q3），%］

通過LEfSe分析獲得組間差異標記物。默認LDA＞2、P＜0.05，共獲得39個顯著差異標記物，其中，Hp陽性組特有12個重要微生物類群，Hp陰性組有27個重要微生物類群。Hp 陽性組差異類群在變形菌門Proteobacteria、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、腸桿菌科Enterobacteriaceae、巨球形菌屬Megasphaera豐度較高；Hp 陰性組差異類群在毛螺菌目Lachnospirales、毛螺菌科Lachnospiraceae、乳桿菌科Lactobacillaceae 及乳桿菌屬Lactobacillus豐度較高。見圖8。

圖8 Hp陽性組與Hp陰性組患者LEfSe物種標記物

2.6 Hp陽性、Hp陰性慢性胃炎證素與腸道菌群相關性比較

將Hp陽性與Hp陰性患者證素與腸道菌群的菌屬豐度做相關性比較，發(fā)現(xiàn)同一菌屬與不同證素之間相關性不同。Hp陽性組毛螺菌屬Lachnospira與肝呈正相關，與痰呈負相關；薩特氏菌屬Sutterella與陰虛呈正相關。Hp陰性組薩特氏菌屬Sutterella與肝、氣滯呈正相關，與熱呈負相關。見表3。

表3 Hp陽性、Hp陰性慢性胃炎證素與腸道菌群屬水平豐度相關性（r）

3 討論

3.1 幽門螺桿菌感染對病位、病性影響

本研究顯示，在病位證素分布上，Hp陽性患者胃的頻率最高，其次是脾、肝；Hp陰性患者頻率最高的亦是胃，其次是肝、脾?？梢?，Hp感染對脾的影響較大，與相關研究結果一致[14-16]。一方面，脾胃共居中焦，為氣血生化之源、氣機升降之樞。生理上，二者納運相得，升降相合，以助水谷運化，精微布散。病理上，二者互結相兼，胃腑受邪，水谷不化，胃失和降，亦傷脾臟，脾不升清，精微不散；Hp為外來邪氣，Hp感染可傷胃腑，亦犯脾臟。另一方面，肝與脾胃密切聯(lián)系。肝主疏泄，調(diào)暢脾胃氣機，助脾胃升降相濟，納運相得，化生氣血，涵養(yǎng)肝木。若肝氣郁結，乘脾犯胃，納運失和，飲食積滯，胃腑壅滯為病。故慢性胃炎患者病位在胃，亦傷肝木，克伐脾土。

在病性證素分布上，Hp陽性組以氣滯、濕、熱、痰等實性證素為主，而Hp陰性組熱、陰虛等證素占比較高。脾胃為氣機升降之樞，二者功能失常，升降失調(diào)則飲食內(nèi)停，阻滯氣機。氣滯加重脾胃運化失司，水飲內(nèi)停，邪壅成滯，痰濕內(nèi)生，日久可郁而化熱，導致氣滯、濕邪、熱邪、痰邪相兼為患。研究表明，Hp感染與慢性胃炎濕熱證的發(fā)生存在相關性，感染Hp可出現(xiàn)胃腑濕、熱的相關癥狀，濕熱之邪內(nèi)生，痰濕內(nèi)盛，阻滯氣機，郁而化熱，進一步加重濕熱之證[17-19]。Hp為外來之邪，外邪犯胃，正氣未虛，病程較短，因此，陰虛等虛性證素占比較低。臨床治療中，Hp感染初期，應于辨證論治的基礎上佐以行氣、化濕、清熱、祛痰類中藥，防止Hp感染對胃腑的進一步損傷。而Hp陰性組多為胃腑功能失調(diào)，飲食積滯，久積則郁而化火，煎灼陰液，日久則陰虛，陰虛則熱，二者相兼為病，故Hp陰性組可出現(xiàn)熱等實性證素，又可見陰虛等虛性證素。臨床治療慢性胃炎應于辨證論治的基礎上佐以滋陰清熱之品，防止胃腑陰津耗傷，虛熱內(nèi)生。

3.2 幽門螺桿菌感染對腸道菌群影響

本研究發(fā)現(xiàn)，Hp陽性組、Hp陰性組與健康組的優(yōu)勢菌門相同，均為擬桿菌門Bacteroidota、厚壁菌門Firmicutes、 變形菌門Proteobacteria、 梭桿菌門Fusobacteria、放線菌門Actinobacteriota，與目前研究發(fā)現(xiàn)人胃內(nèi)5大優(yōu)勢菌門相同[20]。雖然3組優(yōu)勢菌門在構成上基本一致，但在豐度上存在差異，Hp陽性組和Hp 陰性組變形菌門Proteobacteria 的豐度高于健康人群，結合組間差異標記物結果，推測變形菌門Proteobacteria可能是感染Hp的慢性胃炎患者的特征性菌門。

在屬水平上，與健康人相比，Hp陽性患者考拉桿菌屬Phascolarctobacterium、毛旋螺菌科UCG-010群Lachnospiraceae_UCG-010、巴斯德菌科未知菌屬Pasteurellaceae|g、擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f上豐度較低?？祭瓧U菌屬厚壁菌門，該菌屬會增加Bacteroides、Odoribacter（被報道能有效降低腸道炎癥、抑制結腸癌的發(fā)生[21]）、Peptococcaceae等在胃腸道的豐度。毛旋螺菌科UCG-010群Lachnospiraceae_UCG-010的存在有助于改善胃腸黏膜屏障完整性，降低局部和全身炎癥風險。擬桿菌屬能產(chǎn)生抗炎介質(zhì)，抑制中性粒細胞和巨噬細胞、釋放促炎細胞因子，幫助維持胃腸道生物穩(wěn)態(tài)。研究顯示，擬桿菌屬過低會導致炎癥性胃腸道疾病的發(fā)生，如克羅恩病和潰瘍性結腸炎等[22]。我們推測Hp感染引起胃腸道菌群失調(diào)的原因，可能由于Hp感染引起胃黏膜萎縮和壁細胞顯著減少，導致胃酸分泌減少、pH值升高，胃內(nèi)環(huán)境改變，顯著抑制益生菌的生長，使胃內(nèi)正常菌所占比例下降，對胃黏膜的保護作用降低，胃內(nèi)的弱勢菌厭氧菌數(shù)量顯著增加，成為Hp感染患者胃內(nèi)的優(yōu)勢菌，從而導致胃內(nèi)微生態(tài)平衡破壞，慢性胃炎等疾病的發(fā)生。經(jīng)黏液真桿菌屬Blautia、毛螺菌屬Lachnospira、薩特氏菌屬Sutterella在Hp陰性患者胃腸道中豐度較高，而在Hp陽性患者胃腸道豐度降低，推測可能與Hp定植對其抑制作用有關，具體機制有待進一步研究。

3.3 慢性胃炎證素與腸道菌群相關性

對慢性胃炎主要證素與腸道菌群各菌屬的豐度進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)Hp陰性組薩特氏菌屬Sutterella豐度與肝和氣滯呈正相關，與熱呈負相關。肝失疏泄可致氣滯，可見肝氣郁滯有利于薩特氏菌屬Sutterella富集，而“熱”對其富集具有抑制作用。Hp陽性組毛螺菌屬Lachnospira豐度與肝呈正相關，與痰呈負相關。毛螺菌屬Lachnospira為腸道有益菌，肝氣疏泄助脾胃氣機調(diào)暢，表明肝氣調(diào)達有利于毛螺菌屬Lachnospira生長。Hp致病特點與中醫(yī)濕熱之邪相似，濕邪內(nèi)阻，久郁化火，煉津為痰，痰濕內(nèi)擾，表明痰濕可能是導致毛螺菌屬Lachnospira豐度降低的重要因素。

綜上所述，Hp感染對脾影響較大，易出現(xiàn)氣滯、濕、熱、痰等實性證素。Hp感染影響腸道菌群的構成，降低中性菌及有益菌的豐度。本研究可為Hp感染患者臨床診治提供參考。