韓楊楊 ，韓玉潔 ，王海娟 ，高凡 ，劉興超， ，郭秋紅，

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200； 2.河北省中藥組方制劑技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200；3.河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050200

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于長期多種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和/或功能的異常改變，使心臟收縮和/或舒張能力減弱，從而引起的一組復(fù)雜臨床綜合征，是心臟疾病發(fā)展的終末階段[1]。近年來，中醫(yī)藥防治CHF取得了較好的療效，中藥不良反應(yīng)相對較小、安全劑量范圍大，配伍治療可增強(qiáng)療效[2]。

課題組前期研究認(rèn)為，CHF為本虛標(biāo)實(shí)之證，以宗氣虧虛為本，血瘀、痰濁、水飲為標(biāo)，基本病機(jī)為氣虛、陽虛、血瘀、水停，故以益氣溫陽、活血利水法為治療核心，臨床及實(shí)驗(yàn)研究均顯示療效良好[3-5]。通過文獻(xiàn)檢索收集防治CHF的中藥復(fù)方，具有益氣溫陽活血利水作用且出現(xiàn)頻次≥15的中藥為黃芪、桂枝、丹參、葶藶子[6]，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究初步闡明其有效組分配伍治療CHF的可能作用機(jī)制[7]。目前，益氣溫陽活血利水中藥治療CHF組方的劑量配比還處于探索階段。因此，本研究采用主動(dòng)脈弓縮窄法制備CHF大鼠模型，運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)法探討防治CHF中藥益氣、溫陽、活血、利水組分最佳配比，為中藥組分配伍規(guī)律研究提供參考。

1 動(dòng)物、儀器與試藥

SPF 級雄性SD 大鼠120 只，4～8 周齡，體質(zhì)量180～200 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006，動(dòng)物合格證號110011200110846981。飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由攝食飲水，12 h/12 h明暗交替，溫度20～22 ℃，濕度50%～60%，隔日更換墊料。本實(shí)驗(yàn)已通過河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（DWLL2021039）。

Vevo2100 小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics公司），SH-2型加熱磁力攪拌器（天津市泰斯特儀器有限公司），1-15K型高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司），HT7700 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

黃芪總皂苷（含黃芪甲苷50%，批號K20495）、丹參總酚酸（含丹酚酸B 50%，批號K20386），西安開來生物科技有限公司；葶藶子水提物（按10∶1比例提取，批號FY20Y1112）、桂皮醛（含桂皮醛98%，批號FY21S0108），南通飛宇生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液為溶劑將4種組分藥物混合按實(shí)驗(yàn)用量加入，制成所需濃度的混懸液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。卡托普利片（25 mg/片，批號393200204），石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司。將卡托普利片研磨后，用100 ℃蒸餾水和0.5%羧甲基纖維素鈉配制成1.05 mg/mL藥液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

N端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，貨號F15151）；血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，貨號D02PZB）；醛固酮（ALD）試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，貨號D03PZB）；肌鈣蛋白T（cTnT）試劑盒（生工BBI生命科學(xué)有限公司，貨號D731143）。

2 方法與結(jié)果

2.1 造模

采用主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)誘導(dǎo)CHF大鼠模型[8]。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，左胸備皮并用碘伏消毒，鈍性分離左胸腔第一肋間隙靠近第二肋上緣逐層打開，暴露胸腺后將胸腺推至頭側(cè)尋找主動(dòng)脈弓，主動(dòng)脈弓呈“H”型，將注射針頭去尖并將起始大約0.5 cm彎折30°制成特制挑針，將4-0號非吸收獸用縫合線穿進(jìn)特制挑針中，使用特制挑針找到主動(dòng)脈弓頭臂干與左頸總動(dòng)脈的連接處，將墊針與主動(dòng)脈弓結(jié)扎后，緩慢取出墊針。擦拭淤血后，迅速逐層縫合傷口。造模4周后檢測大鼠射血分?jǐn)?shù)（EF）進(jìn)行評估，以EF≤50%判斷造模成功。假手術(shù)組只做開胸處理。

2.2 均勻設(shè)計(jì)方案

采用U8（85）均勻設(shè)計(jì)表，以黃芪總皂苷、丹參總酚酸、桂皮醛和葶藶子水提物為考察因子，每個(gè)因子取8個(gè)水平。通過查閱文獻(xiàn)確定各藥物的劑量范圍，分別為黃芪總皂苷20～60 mg/kg[9-10]、丹參總酚酸10～40 mg/kg[11-12]、葶藶子水提物50～190 mg/kg[13-14]、桂皮醛30～100 mg/kg[15-16]。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)各組給藥劑量，得到均勻設(shè)計(jì)方案，見表1。

表1 益氣溫陽活血利水中藥組分配伍均勻設(shè)計(jì)方案（mg/kg）

2.3 均勻設(shè)計(jì)篩選實(shí)驗(yàn)

2.3.1 分組、給藥及取材

80只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、不同劑量組分配伍組（均勻1～8組），每組8只。成模后，均勻1～8組按均勻設(shè)計(jì)方案分別予4種組分藥物混懸液灌胃，給藥體積1 mL/100 g，假手術(shù)組、模型組予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)8周。末次灌胃1 h后，使用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)檢測大鼠心功能指標(biāo)；禁食禁水12 h，3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）麻醉大鼠，股動(dòng)脈取血，4 ℃、3 500 r/min離心20 min，分離血清后冷藏，用于檢測生化指標(biāo)；剖取左心室部分組織，用4%多聚甲醛固定，用于觀察心肌組織病理形態(tài)。

2.3.2 均勻設(shè)計(jì)各組對大鼠心功能的影響

大鼠吸入異氟烷（1%氧氣+5%異氟烷）進(jìn)行麻醉，腹部向上固定于操作臺(tái)上，心前區(qū)備皮，將小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)探頭置于大鼠胸前，以胸骨旁左室長軸和乳頭肌水平短軸切面，檢測心功能指標(biāo)，包括EF、短軸縮短率（FS）、收縮期左室前壁厚度（LVAWs）、舒張期左室前壁厚度（LVAWd）、收縮期左室后壁厚度（LVPWs）、舒張期左室后壁厚度（LVPWd），連續(xù)檢測3次，取平均值。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠EF、FS均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組EF、FS均升高（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd均增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd均減?。≒＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s，每組8只）

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s，每組8只）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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2.3.3 均勻設(shè)計(jì)各組對大鼠血清N 端腦利鈉肽前體含量的影響

全自動(dòng)生化分析儀檢測血清NT-proBNP含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清NT-proBNP含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，除均勻3組外，各給藥組大鼠血清NT-proBNP含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清NT-proBNP含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠血清NT-proBNP含量比較（±s，pg/mL）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

?

2.4 最佳配比分析

采用SPSS19.0 軟件，分別以NT-proBNP、EF 為因變量，黃芪總皂苷（Xa）、丹參總酚酸（Xb）、葶藶子水提物（Xc）和桂皮醛（Xd）為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析。NT-proBNP 回歸方程為Y=374.439-0.01Xa+0.048Xb-0.01Xc-0.001Xd，EF 回歸方程為Y=42.942+0.03Xa-0.013Xb+0.001Xc+0.003Xd。 最佳配比為黃芪總皂苷60 mg/kg，丹參總酚酸10 mg/kg，葶藶子水提物190 mg/kg，桂皮醛100 mg/kg。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.5.1 分組與給藥

將40只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、組分配伍優(yōu)選組（HDTG 組，黃芪總皂苷60 mg/kg，丹參總酚酸10 mg/kg，葶藶子水提物190 mg/kg，桂皮醛100 mg/kg）、陽性藥組（卡托普利10.5 mg/kg），每組10只。造模4周后，給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)8周。

2.5.2 優(yōu)選組分配伍對大鼠心重指數(shù)的影響

大鼠股動(dòng)脈取血后，迅速剖離心臟組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱量心臟質(zhì)量。心重指數(shù)（%）=全心質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、全心質(zhì)量、心重指數(shù)均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組體質(zhì)量無明顯差異，HDTG組和陽性藥組全心質(zhì)量、心重指數(shù)明顯減?。≒＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠體質(zhì)量、全心質(zhì)量、心重指數(shù)比較（±s）

表4 各組大鼠體質(zhì)量、全心質(zhì)量、心重指數(shù)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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2.5.3 優(yōu)選組分配伍對大鼠血漿血管緊張素Ⅱ、醛固酮及血清肌鈣蛋白T含量的影響

使用半自動(dòng)生化分析儀檢測血漿AngⅡ、ALD及血清cTnT含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿AngⅡ、ALD和血清cTnT含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，HDTG 組和陽性藥組大鼠血漿AngⅡ、ALD 和血清cTnT含量均降低（P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠血漿AngⅡ、ALD及血清cTnT含量比較（±s，pg/mL）

表5 各組大鼠血漿AngⅡ、ALD及血清cTnT含量比較（±s，pg/mL）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較， ##P＜0.01

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2.5.4 優(yōu)選組分配伍對大鼠心肌組織形態(tài)的影響

將4%多聚甲醛固定的心肌組織取出，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，分別進(jìn)行HE、Masson染色，光鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)。

假手術(shù)組大鼠心肌染色均勻，肌橫紋排列整齊，細(xì)胞間界限均勻清晰，細(xì)胞核形態(tài)完整；模型組染色不均勻，心肌橫紋明顯斷裂，細(xì)胞水腫明顯，心肌纖維增粗、斷裂，炎性細(xì)胞浸潤及成纖維細(xì)胞增生明顯，細(xì)胞排列紊亂、間隙增寬，核溶解；HDTG組和陽性藥組均顯著緩解，心肌細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤減少，心肌細(xì)胞排列較整齊，成纖維細(xì)胞增生改善。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)（HE染色，×400）

與假手術(shù)組比較，模型組病理切片心肌細(xì)胞排列雜亂，出現(xiàn)大量藍(lán)紫色膠原纖維明顯堆積，心肌結(jié)構(gòu)被破壞；與模型組比較，HDTG組和陽性藥組心肌細(xì)胞排列較整齊，膠原纖維堆積情況減少。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)（Masson染色，×400）

3 討論

根據(jù)CHF臨床癥狀，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“懸飲”“水腫”“喘證”“心脹”等范疇[17]，病位在心臟及血脈，與肺、脾、肝、腎等臟相關(guān)[18]，主要表現(xiàn)為勞力性呼吸困難、夜間陣發(fā)性呼吸困難、下肢水腫、咳嗽、食欲不振等。CHF的核心病機(jī)是虛、瘀、水，主要治法為益氣溫陽、活血利水[19]。益氣藥有明顯強(qiáng)心作用，與溫陽藥配伍可使療效更為顯著；兼以去除標(biāo)實(shí)，采用活血利水法使瘀血得消，水濕得化。黃芪總皂苷能改善心力衰竭大鼠心功能，延緩左室重構(gòu)[20]。葶藶子水提液可改善心力衰竭大鼠心臟功能，抑制心室重構(gòu)，減少心肌細(xì)胞凋亡[13]。丹參總酚酸改善心肌細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)，增強(qiáng)心肌舒張和收縮功能[11]。桂皮醛可降低高血壓小鼠血壓，抑制血管重塑和炎癥反應(yīng)[21]。

NT-proBNP對于診斷和鑒別心力衰竭具有良好的特異性和敏感性。NT-proBNP水平與心力衰竭的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，為心力衰竭常用的診斷指標(biāo)[22-24]。心臟超聲是目前臨床診斷心血管疾病及療效評定的重要手段，其中左心室EF隨心功能分級升高而降低，臨床常作為評估左心室重構(gòu)的重要參考指標(biāo)[25]。NT-proBNP和EF可分別在CHF血液及心臟功能上反映心力衰竭的嚴(yán)重程度，故選擇作為因變量。

本研究基于均勻設(shè)計(jì)法，制備大鼠CHF模型，以黃芪總皂苷、丹參總酚酸、葶藶子水提物、桂皮醛4種中藥組分為觀察對象，大鼠血清NT-proBNP含量及EF為因變量，通過多元回歸分析得到該組方的最佳配比：黃芪總皂苷60 mg/kg，丹參總酚酸10 mg/kg，葶藶子水提物190 mg/kg，桂皮醛100 mg/kg。該配比中丹參總酚酸劑量較小。無論中醫(yī)病程中的血瘀，還是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中由左心衰竭引起右心衰竭導(dǎo)致體循環(huán)淤血，在疾病發(fā)展階段中都屬于晚期，故發(fā)揮活血化瘀功效的丹參總酚酸與藥效為負(fù)相關(guān)，考慮與疾病進(jìn)程有關(guān)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明該配比有效。本研究結(jié)果表明，益氣溫陽活血利水中藥組分對CHF有較好治療效果，且有一定配比規(guī)律，可為中藥組分配伍臨床應(yīng)用提供參考。