高麗霞 ，閆治攀 ，李喜香 ，王雪梅

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

玉紅油紗條為甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑（甘藥制字Z04000845），處方由黃連、白及、五倍子和紫草組成，廣泛用于臨床外科急慢性創(chuàng)面，療效顯著。但由于使用不便，加之制劑生產(chǎn)過程中諸多因素導(dǎo)致不同批次產(chǎn)品間存在質(zhì)量差異，限制了該制劑的臨床應(yīng)用。原位凝膠新型給藥系統(tǒng)與用藥部位接觸前呈液態(tài)，接觸后轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w狀，具有給藥方便、穩(wěn)定性好、刺激性小、藥物緩控釋性能良好、制備工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)[1]。因此，擬將傳統(tǒng)制劑玉紅油紗條開發(fā)為新型原位凝膠制劑“紫連生肌凝膠劑”。指紋圖譜能全面反映中藥飲片或制劑的內(nèi)在物質(zhì)特征，其整體性及模糊性特征適合中藥飲片及制劑內(nèi)在質(zhì)量的控制與研究[2]。本研究通過指紋圖譜比較不同批次玉紅油紗條與不同提取方法提取液成分的差異，篩選傳統(tǒng)中藥外用制劑現(xiàn)代的提取方法，為其二次開發(fā)化學(xué)成分同質(zhì)性轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 2478高效液相色譜儀（美國Waters公司），SQP型十萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器），溶劑過濾器（津騰服務(wù)有限公司），HH-7型恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），KQ-300DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Labonce-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京蘭貝恒溫技術(shù)股份有限公司）。

沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)110831-201906，純度99.76%）、黃連堿對(duì)照品（批號(hào)112026-201802，純度98.9%）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-201814，純度99%）、巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)110732-201913，純度99%）、左旋紫草素對(duì)照品（批號(hào)110713-201814，純度99%），中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，天津大茂化學(xué)試劑有限公司；鹽酸為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。黃連（批號(hào)191007、 201102、 210702、 210821、220101、 220301、 220602、 220617、 220703、JZ2105022、210702，產(chǎn)地四川）、紫草（批號(hào)190301、200601、200701、20170901、20180701、20211001、20220301、210602、JZ2103028、220602，產(chǎn)地新疆）、白及（批號(hào)200504、2006037、210501、200701、201001、20210901、211101CP059，產(chǎn)地云南）和五倍子（批號(hào)191102、210101、220101、41222001、200901，產(chǎn)地四川）均由甘肅省中醫(yī)院提供，飲片經(jīng)甘肅省藥品檢定研究院宋平順主任藥師鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》各藥項(xiàng)下規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品和溶液制備

2.1.1 基準(zhǔn)樣品

11份玉紅油紗條樣品（Sy1～Sy11）為組方藥物黃連、紫草、白及、五倍子各批次飲片隨機(jī)組合。依據(jù)玉紅油紗條處方量，按表1組合稱取各批次飲片適量，取香油置于鍋內(nèi)加熱，冒熱氣后加入白及炸至切面金黃，隨后加入黃連、五倍子使其斷面呈枯黃時(shí)撈出，去除殘?jiān)?，待油溫降低?60 ℃，加入用乙醇浸泡過的紫草，待油呈紫紅色時(shí)，撈出藥渣，隨后加入黃蜂蠟熔化，過濾，即得含原藥材0.3 g/g 的玉紅油紗條樣品。

表1 11份玉紅油紗條處方飲片批次組合

2.1.2 供試品溶液

分別稱取上述11批玉紅油紗條樣品5 g，加入5 g硅藻土，置于研缽中，研磨均勻，從中取出置于錐形瓶中，加入90%甲醇-鹽酸（100∶2）50 mL，精密稱定，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取30 min，擦干錐形瓶表面水分，放冷后補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，收集續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液

分別取對(duì)照品沒食子酸、黃連堿、巴馬汀、鹽酸小檗堿、左旋紫草素適量，精密稱定，甲醇溶解成濃度分別為0.822、0.282、0.466、1.568、0.063 mg/mL的對(duì)照品貯備液；分別精密吸取上述對(duì)照品貯備液各1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成濃度分別為82.20、28.20、46.60、156.80、6.30 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 乙醇提取液供試品

按處方量稱取五倍子、黃連、白及、紫草，分別以8、6倍75%乙醇為提取溶媒，進(jìn)行回流提取，每次提取60 min；將2次提取液合并，過濾，回收乙醇，并將提取液濃縮為含原藥材0.5 g/mL。精密吸取3 mL濃縮液，加入5 g硅藻土，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得乙醇提取液供試品。

2.1.5 水提取液供試品

按處方量稱取五倍子、黃連、白及、紫草，分別以8倍和6倍量純化水為提取溶媒，進(jìn)行回流提取，每次60 min；將2次提取液合并，過濾，將提取液濃縮為含原藥材0.5 g/mL。精密吸取3 mL濃縮液，加入5 g硅藻土，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得水提取液供試品。

2.2 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件

采用Agilent C18-WR 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.15%磷酸水（B），梯度洗脫（0～10 min，5%→12%A；10～48 min，12%→20%A；48～60 min，20%→21%A；60～70 min，21%→34%A； 70～85 min， 34%→80%A； 85～100 min，80%→95%A），流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長270、345、516 nm，采集時(shí)長110 min。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取玉紅油紗條樣品（Sy1）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以8號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得到各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.86%，相對(duì)峰面積RSD≤2.13%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取玉紅油紗條樣品（Sy1）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，以8號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得到各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤1.54%，相對(duì)峰面積RSD≤1.11%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取玉紅油紗條樣品（Sy1）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、24、72 h進(jìn)樣，以8號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得到各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.98%，相對(duì)峰面積RSD≤1.69%，表明樣品在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋為不同濃度對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 5種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3 指紋圖譜建立及共有峰確定

按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備玉紅油紗條供試品11批（Sy1～Sy11），進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，建立玉紅油紗條指紋圖譜，見圖1?；旌蠈?duì)照品色譜圖見圖2。

圖1 11批玉紅油紗條HPLC疊加圖

圖2 混合對(duì)照品HPLC圖

2.4 提取方法選擇

取乙醇提取液供試品及水提取液供試品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別記錄色譜圖。以玉紅油紗條樣品（Sy1）為對(duì)照，采用國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)色譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。乙醇提取液樣品與玉紅油紗條基準(zhǔn)樣品共有峰數(shù)為16個(gè)，分別占玉紅油紗條基準(zhǔn)樣品和乙醇提取液樣品總峰數(shù)的38.10%和28.07%，共有峰面積分別占總峰面積的64.70%和47.83%；水提取液與玉紅油紗條共有峰數(shù)為8個(gè)，分別占玉紅油紗條基準(zhǔn)樣品和水提取液樣品總峰數(shù)的19.05%和10.10%，共有峰面積分別占總峰面積的30.80%和45.06%。乙醇提取液樣品所含成分較為全面，因此選擇乙醇提取作為新劑型紫連生肌凝膠劑的提取方法。

圖3 玉紅油紗條及其乙醇、水提取液樣品HPLC圖

2.5 均勻試驗(yàn)安排及結(jié)果

在前期單因素試驗(yàn)確定提取次數(shù)為2次、提取溫度為60 ℃的基礎(chǔ)上，以左旋紫草素（y1）、黃連堿（y2）、鹽酸小檗堿（y3）、巴馬?。▂4）、沒食子酸（y5）及出膏率（y6）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)提取工藝影響較大的乙醇濃度（A）、乙醇加入量（B）和提取時(shí)間（C）三因素進(jìn)行考察，采用U6（64）均勻試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)分析，優(yōu)選最佳提取工藝[3-4]。因素水平見表3，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 優(yōu)選提取工藝因素水平

表4 提取工藝均勻試驗(yàn)結(jié)果

2.6 指標(biāo)權(quán)重計(jì)算及工藝參數(shù)優(yōu)選

2.6.1 層次分析法

層次分析法（AHP）是基于系統(tǒng)分層分析，將評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分解成多級(jí)指標(biāo)，通過組間比較確定各指標(biāo)權(quán)重[5]。其優(yōu)點(diǎn)在于通過一致性檢驗(yàn)克服了自主賦權(quán)時(shí)存在的偏差，可同時(shí)提供縱向比較和橫向比較；不足在于當(dāng)分層較多時(shí)結(jié)果容易出現(xiàn)誤判，因判斷矩陣不同造成評(píng)價(jià)結(jié)果不同[6-7]。根據(jù)紫連生肌凝膠劑處方君臣佐使配伍規(guī)律及各化學(xué)成分藥理作用強(qiáng)弱[8]，將6個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)量化為5個(gè)層次，并確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序：左旋紫草素＞黃連堿=鹽酸小檗堿＞巴馬?。緵]食子酸＞出膏率，構(gòu)建成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣，各項(xiàng)指標(biāo)的相對(duì)評(píng)分見表5。

表5 各指標(biāo)成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣

根據(jù)表5計(jì)算左旋紫草素、黃連堿、鹽酸小檗堿、巴馬汀、沒食子酸和出膏率的權(quán)重系數(shù)。經(jīng)一致性檢驗(yàn)，一致性比率（CR）=0.011，CR＜0.10表明指標(biāo)優(yōu)先比較判斷矩陣一致性較好，所得權(quán)重系數(shù)一致有效[9]。

2.6.2 CRITIC法

CRITIC法是一種基于評(píng)價(jià)指標(biāo)的對(duì)比強(qiáng)度和指標(biāo)之間的沖突性來綜合衡量指標(biāo)的客觀權(quán)重的方法。其中，對(duì)比強(qiáng)度是指同一個(gè)指標(biāo)各評(píng)價(jià)方案之間取值差距的大小，以標(biāo)準(zhǔn)差形式表現(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)差越大說明波動(dòng)越大，即各方案之間的取值差距越大，權(quán)重會(huì)越高。指標(biāo)之間的沖突性用相關(guān)系數(shù)表示，若2個(gè)指標(biāo)之間具有較強(qiáng)的正相關(guān)性，說明其沖突性越小，權(quán)重會(huì)越低[6]。CRITIC法兼顧了各指標(biāo)間的沖突性和指標(biāo)變異大小對(duì)權(quán)重的影響[10]。但當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)較多時(shí)，因計(jì)算量較大，可能影響評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。

為消除評(píng)價(jià)指標(biāo)異量綱對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響，采用歸一化法（MMS）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理。按公式（1）計(jì)算，結(jié)果見表6。采用SPSS20.0軟件得到各評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣，分別按公式（2）～（5）計(jì)算對(duì)比強(qiáng)度（σj）、沖突性（Rj）、指標(biāo)信息量（Cj）和指標(biāo)權(quán)重（Wj），式中rij表示評(píng)價(jià)指標(biāo)i和j之間的相關(guān)系數(shù)（i,j=1,2,3,……,n）。各指標(biāo)數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果見表7。

表6 均勻試驗(yàn)數(shù)據(jù)無量綱化處理結(jié)果

表7 評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)據(jù)CRITIC法計(jì)算結(jié)果

2.6.3 AHP-CRITIC組合賦權(quán)法

設(shè)2種賦權(quán)法得到的權(quán)重分別為wa和wb，則組合權(quán)重按公式（6）計(jì)算。結(jié)果見表8。

表8 各指標(biāo)不同賦權(quán)方法權(quán)重

2.6.4 綜合評(píng)分

按公式（7）計(jì)算各指標(biāo)綜合評(píng)分，結(jié)果見表9。

表9 均勻試驗(yàn)不同賦權(quán)法綜合評(píng)分

運(yùn)用SPSS20.0軟件對(duì)不同賦權(quán)法所得綜合評(píng)分進(jìn)行回歸分析，回歸方程為Y=72.466+0.144A+1.749B-0.236C（r=0.991，P=0.027），表現(xiàn)出良好的擬合度，能夠較好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)對(duì)方程規(guī)劃求解得最優(yōu)提取工藝為：乙醇濃度89.78%、乙醇加入量15.77倍、提取時(shí)間90.64 min，綜合評(píng)分為90.428 5。為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，便于生產(chǎn)參數(shù)控制，將優(yōu)選的工藝參數(shù)調(diào)整如下：乙醇濃度90%，乙醇加入量16倍，提取時(shí)間90 min。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱取黃連、紫草、白及和五倍子4味藥，共3份，每份1 500 g，按均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化的最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，即乙醇濃度90%、乙醇加入量16倍（第1次8倍，第2次8倍）、提取時(shí)間90 min（第1次45 min，第2次45 min），按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定左旋紫草素、黃連堿、鹽酸小檗堿、巴馬汀和沒食子酸的含量，結(jié)果見表10。綜合評(píng)分平均值為90.374 0，與預(yù)測(cè)值接近，表明工藝穩(wěn)定可行。

表10 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究綜合考察了甲醇-磷酸水溶液和乙腈-磷酸水溶液在不同配比條件下色譜峰的峰形和分離度情況，以甲醇-0.15%磷酸水溶液、乙腈-0.15%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，前者所得色譜峰的基線不平直，而后者所得色譜峰基線平直，出峰數(shù)量、保留時(shí)間和分離度良好；考察不同波長（223、240、270、280、345、516 nm）的指紋圖譜，結(jié)果237、270、516 nm波長所得峰面積、峰形、保留時(shí)間和出峰數(shù)量最佳。

本方由4味藥組成，方中黃連清熱燥濕、解毒、瀉火，抗菌譜廣，抗真菌作用強(qiáng)，含有鹽酸小檗堿、黃連堿、表鹽酸小檗堿、甲基黃連堿、巴馬汀、小柴紅堿及藥根堿等多種生物堿，具有消炎抗菌、促進(jìn)潰瘍愈合等多種功效[12]；紫草涼血、活血、解毒，其中左旋紫草素有良好的抗感染作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌等有明顯抑制作用[13-14]；白及中白及多糖具有止血、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)傷口愈合作用[15-16]；五倍子中鞣質(zhì)的含量最高，是其主要成分，具有免疫、抗炎、抗病毒等作用[17-18]。故本試驗(yàn)選擇沒食子酸、黃連堿、鹽酸小檗堿、巴馬汀和左旋紫草素為指標(biāo)成分研究玉紅油紗條和紫連生肌凝膠劑的差異性。

本試驗(yàn)首先建立玉紅油紗條指紋圖譜，作為參照?qǐng)D譜，并在此條件下分別測(cè)定乙醇提取液和水提取液的圖譜，并與基準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較，以化學(xué)成分保留情況篩選出最佳的提取溶媒，避免了傳統(tǒng)制劑二次開發(fā)過程中唯指標(biāo)成分含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的片面性；再采用均勻試驗(yàn)法結(jié)合AHP-CRITIC組合賦權(quán)法考察乙醇濃度、乙醇加入量和提取時(shí)間對(duì)玉紅油紗條指標(biāo)性成分的影響，得到最優(yōu)工藝為乙醇濃度90%、乙醇加入量16倍（第1次8倍，第2次8倍）、提取時(shí)間90 min（第1次45 min，第2次45 min）。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，上述優(yōu)化工藝符合實(shí)際生產(chǎn)要求，且穩(wěn)定可行，預(yù)測(cè)性良好。