劉赫 ，李函舟 ，張輝 ，呂樹(shù)泉 ，蘇秀海 ，潘紅梅，

1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生院，河北 石家莊 050091； 2.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；3.河北中醫(yī)學(xué)院附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥[1]，早期通常表現(xiàn)為微量白蛋白尿，隨后逐步發(fā)展為大量蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率進(jìn)行性下降、血肌酐（SCr）進(jìn)行性升高[2]。若不及時(shí)治療，可導(dǎo)致慢性進(jìn)行性腎損傷，最終發(fā)展為終末期腎衰竭[3]。鐵死亡是鐵依賴的不飽和脂肪酸磷脂氧化累積導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)鐵離子依賴的脂質(zhì)過(guò)氧化物超限蓄積[4]。研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞損傷與鐵死亡密切相關(guān)[5]。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)，腎小管間質(zhì)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）表達(dá)與DN病情嚴(yán)重程度及進(jìn)展關(guān)系密切。GPX4作為觸發(fā)鐵死亡程序的重要靶點(diǎn)，是氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡信號(hào)的傳感器，GPX4表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高[7]。因此，通過(guò)調(diào)控鐵死亡抑制腎小管上皮細(xì)胞死亡，緩解DN腎損傷可能是治療DN的有效策略。

黃精多糖是黃精中含量最高且具有重要藥理作用的一類成分，在改善DN腎功能及緩解炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖干預(yù)可明顯改善糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂和胰島素耐受。另有研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖干預(yù)后，DN模型小鼠血糖、24 h尿微量白蛋白、SCr和血尿素氮（BUN）水平明顯降低[10]。黃精多糖治療DN的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)高糖高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合鏈脲佐菌素（STZ）注射建立DN大鼠模型，觀察黃精多糖對(duì)模型大鼠鐵死亡的影響，探討黃精多糖對(duì)DN的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2021-0031。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度（50±15）%，12 h光暗周期，自由飲水進(jìn)食。高糖高脂飼料（10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、67.5%常規(guī)飼料）、普通飼料（4.8%脂肪、20%蛋白質(zhì)及59.4%總糖），北京華阜康生物科技有限公司。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（CZX2022-KY-023）。

1.2 藥物及制備

黃精多糖（純度70%，批號(hào)S27804），上海源葉生物科技有限公司。用生理鹽水配制成濃度分別為200、800 mg/mL溶液。厄貝沙坦片（批號(hào)8A411），賽諾菲（杭州）制藥有限公司，用生理鹽水配制成30 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

尿蛋白（批號(hào)C035-2-1）、SCr（批號(hào)C011-2-1）、BUN（批號(hào)C013-2-1）、丙二醛（MDA，批號(hào)C003-1-2）、谷胱甘肽（GSH，批號(hào)C006-2-1）、總鐵離子含量（批號(hào)A039-2-1）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin）、鐵蛋白重鏈（FTH1）、GPX4、 β -actin 一抗（批號(hào)分別為ab278498、ab75973、ab252833、ab179467），英國(guó)Abcam公司。iMark680多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Fresco17離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；5810型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppndorf 公司；ABI Prism?7500 熒光定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；DYCZ-24DN型垂直電泳槽，北京六一儀器廠；SH-523型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，杭州申花科技有限公司。

1.4 造模、分組及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只作為正常組，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。剩余40只參照文獻(xiàn)[11]方法建立DN大鼠模型：高糖高脂飼料喂養(yǎng)7周后，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ 30mg/kg。72 h后尾靜脈采血檢測(cè)隨機(jī)血糖，≥16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)1周，代謝籠收集大鼠24 h尿液，檢測(cè)尿蛋白定量。血糖≥16.7 mmol/L，尿糖陽(yáng)性、尿蛋白陽(yáng)性，則DN模型制備成功[12]。

將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥組和黃精多糖低、高劑量組，每組10只。黃精多糖低、高劑量組按人與大鼠體表面積（1∶6.25）換算給藥劑量，予黃精多糖溶液200、800 mg/kg灌胃，陽(yáng)性藥組予厄貝沙坦溶液30 mg/kg灌胃，灌胃體積1 mL/kg，正常組和模型組予等體積蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)4周。每周周六晚禁食12 h，周日早8:00尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖（FBG），每2周稱量大鼠體質(zhì)量并記錄。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 腎功能指標(biāo)檢測(cè)

給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水，放入代謝籠中收集24 h尿液，檢測(cè)尿蛋白含量。過(guò)量麻醉處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，檢測(cè)SCr、BUN水平。

1.5.2 腎組織病理染色

取腎組織，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定24 h，水洗20 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（5 μm），行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腎組織病理改變。

1.5.3 腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及總鐵離子含量檢測(cè)

取腎組織，預(yù)冷PBS漂洗3次，剪碎后稱取0.1 g組織，加入900 μL生理鹽水低溫勻漿，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，試劑盒檢測(cè)腎組織MDA、GSH和總鐵離子含量。

1.5.4 qPCR檢測(cè)

取凍存大鼠腎組織，冰浴勻漿，裂解，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按PCR試劑盒說(shuō)明書步驟操作，熒光定量PCR 儀進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件：95 ℃、15 min，95 ℃、20 s，56 ℃、20 s，共40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.5 Western blot檢測(cè)

取腎組織，加入RIPA裂解緩沖液150 μL，勻漿離心后留取蛋白上清液。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，將蛋白濃度進(jìn)行均一化。取等量蛋白20 μg，8%～12% SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白分離，將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Transferrin一抗（1∶2 000）、FTH1一抗（1∶3 000）、GPX4 一抗（1∶3 000）、β-actin 一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜，加入二抗（1∶9 000），室溫孵育2 h。TBST洗膜，ECL法顯影檢測(cè)，使用Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，若滿足則采用t檢驗(yàn)，若不滿足則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃精多糖對(duì)模型大鼠體質(zhì)量和空腹血糖的影響

與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯減少（P＜0.01），F(xiàn)BG明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05），各給藥組大鼠FBG差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量和FBG比較（±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量和FBG比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

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2.2 黃精多糖對(duì)模型大鼠腎功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠SCr、BUN及24 h尿蛋白含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組及黃精多糖高劑量組大鼠SCr、BUN及24 h尿蛋白含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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2.3 黃精多糖對(duì)模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，系膜及系膜基質(zhì)未見(jiàn)增生，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象；模型組大鼠可見(jiàn)腎小管局灶變性、萎縮，腎小球基底膜略增厚，系膜增生，腎小球、腎小管出現(xiàn)脂肪變性；各給藥組大鼠病變減輕，以陽(yáng)性藥組和黃精多糖高劑量組改善更明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（HE染色）

2.4 黃精多糖對(duì)模型大鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及總鐵離子含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織MDA、總鐵離子含量明顯增加，GSH含量明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組和黃精多糖高劑量組大鼠腎組織MDA、總鐵離子含量明顯減少，GSH含量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腎組織MDA、GSH和總鐵離子含量比較（±s）

表4 各組大鼠腎組織MDA、GSH和總鐵離子含量比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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2.5 黃精多糖對(duì)模型大鼠腎組織鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織Transferrin、FTH1 mRNA表達(dá)明顯升高，GPX4 mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃精多糖高劑量組大鼠腎組織Transferrin、FTH1 mRNA表達(dá)明顯降低，陽(yáng)性藥組和黃精多糖高劑量組GPX4 mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4 mRNA表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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2.6 黃精多糖對(duì)模型大鼠腎組織鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織Transferrin、FTH1 蛋白表達(dá)明顯升高，GPX4 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組和黃精多糖低、高劑量組大鼠腎組織Transferrin、FTH1 蛋白表達(dá)明顯降低，GPX4蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖2、表6。

圖2 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4蛋白免疫印跡

表6 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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3 討論

DN屬中醫(yī)學(xué)“腎消”“下消”“水腫”“尿濁”等范疇，病位主要在脾腎。脾為后天之本，主運(yùn)化，水谷精微需腎中陽(yáng)氣溫煦，腎為先天之本，主藏精，腎中精氣亦賴后天水谷精微的不斷補(bǔ)充與化生，脾腎兩臟互滋互養(yǎng)，相互為用。河北省名中醫(yī)蘇秀海主任醫(yī)師經(jīng)多年臨證，總結(jié)DN中醫(yī)病機(jī)為脾腎虧虛，固攝失權(quán)，其中痰濕、瘀血、熱毒損及腎絡(luò)，造成精微物質(zhì)漏泄，病久陰損及陽(yáng)，致陰陽(yáng)兩虛，濁毒內(nèi)停，嚴(yán)重者發(fā)展為腎衰竭。黃精味甘，性平，具有補(bǔ)氣、養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎功效，在治療DN中作用突出。基于此，本研究通過(guò)建立DN大鼠模型，明確黃精多糖對(duì)DN的治療作用，探討黃精多糖治療DN的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血糖、SCr、BUN及24 h尿蛋白含量較正常組明顯升高，病理觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎組織出現(xiàn)明顯的腎小管萎縮及腎小球增生，同時(shí)有一定程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與DN病理學(xué)表現(xiàn)一致[13]。GSH和MDA是反映機(jī)體氧化損傷程度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖可不同程度改善DN大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)，緩解腎組織病理變化，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，且以黃精多糖高劑量組最為明顯。提示黃精多糖對(duì)DN有一定治療作用。

鐵死亡與DN發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。糖尿病小鼠予鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1干預(yù)后，尿白蛋白肌酐比顯著降低，且Ferrostatin-1可顯著降低腎臟中鐵蛋白及腎小管鐵含量[14]。Transferrin是由結(jié)構(gòu)相似的2個(gè)亞基組成的糖蛋白，是鐵死亡特異標(biāo)志物之一，通常每個(gè)亞基可結(jié)合1個(gè)三價(jià)鐵離子，共結(jié)合2個(gè)三價(jià)鐵離子，組成三價(jià)載鐵Transferrin復(fù)合物（holo-Tf）[15]。holo-Tf與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）結(jié)合后通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞核形成核內(nèi)體，因核內(nèi)體酸化，holo-Tf/TfR復(fù)合物構(gòu)象發(fā)生改變，鐵離子隨即從復(fù)合物中釋放進(jìn)入胞質(zhì)，參與合成各類含鐵酶，調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)[16]。鐵蛋白是機(jī)體最主要的鐵儲(chǔ)存?zhèn)}，最重要的作用是為細(xì)胞提供鐵緩沖能力，通過(guò)儲(chǔ)存細(xì)胞內(nèi)游離鐵離子維持細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)，由2 種多肽鏈組成：鐵蛋白輕鏈（FTL）和FTH[17]。FTH1有鐵氧化酶活性，能催化亞鐵氧化[18]。GPX4是清除脂質(zhì)過(guò)氧化物的酶，在鐵死亡過(guò)程中發(fā)揮核心調(diào)控作用。抑制GPX4活性或其表達(dá)缺失會(huì)引發(fā)不受控制的多不飽和脂肪酸氧化和脂肪酸自由基生成，進(jìn)一步通過(guò)脂質(zhì)活性氧依賴性方式促進(jìn)鐵死亡發(fā)生。反之，上調(diào)GPX4表達(dá)則可減少脂質(zhì)活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡[19]。本研究中模型組大鼠腎組織總鐵離子含量增加，Transferrin、FTH1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，GPX4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，表明DN伴有鐵死亡發(fā)生。而黃精多糖可通過(guò)降低DN大鼠腎組織總鐵離子含量及Transferrin、FTH1表達(dá)，升高GPX4表達(dá)，抑制鐵死亡，從而發(fā)揮治療DN作用。